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干细胞国际
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干细胞国际/2017年/文章
特殊的问题

脑损伤和干细胞替换

把这个特殊的问题

研究文章|开放获取

体积 2017年 |文章的ID 9405204 | https://doi.org/10.1155/2017/9405204

心心汉,李明,杰任,王敏,Zhongliang Liu心语胡,胡林黛玉,Yihong Chen Li,应张北京Liu华,小青张Zhengliang高, ”高效、快速的人类神经干细胞分化人类胚胎干细胞细胞疗法”,干细胞国际, 卷。2017年, 文章的ID9405204, 11 页面, 2017年。 https://doi.org/10.1155/2017/9405204

高效、快速的人类神经干细胞分化人类胚胎干细胞细胞疗法

鑫鑫汉,1 李明于,1 杰任,2 王敏,3 Zhongliang刘,2 鑫胡,2 林黛玉胡,2 Yihong陈,4 李陈,1 应张,1 北京日报刘,1 小青张5et al。 花他,4 Zhengliang高5

1200001年上海口腔医院、复旦大学、上海,中国

2上海第十人民医院、同济大学医学院,200092年上海,中国

3嘉兴大学医学院314001年浙江,中国

4长征医院、第二军医大学第二附属医院,200003年上海,中国

5上海第十人民医院、同济大学医学院的同济大学先进的转化医学研究所,上海200092

学术编辑器:李姚
收到了 2017年5月19日
修改后的 2017年6月28日
接受 2017年7月27日
发表 2017年9月18日

文摘

干细胞疗法已用于修复受损的脑组织和帮助脑损伤后功能恢复。变异神经发生与脑损伤有关,multipotential神经干细胞从人类胚胎干细胞(他)细胞为细胞替代治疗提供一个巨大的希望。优化协议神经分化是必要的生产功能人类神经干细胞(hNSCs)细胞疗法。然而,合格的过程是稀缺和详细功能hNSCs起源于他的细胞仍不清楚。在这项研究中,我们开发了一种方法来从他获得hNSCs细胞,我们可以收获丰富hNSCs在相对较短的时间。然后,我们检查了多能和多功能标记基因的表达通过免疫染色和分化的潜力分化hNSCs确认。此外,我们分析这些hNSCs的有丝分裂活动。hNSCs在这份报告中,我们提供全面的特性和交付的知识如何获得更多的高品质hNSCs他细胞可能有助于加快NSC-based疗法在治疗脑损伤。

1。介绍

神经发生的定义是进步的新神经元生成神经干细胞(nsc)或通常叫神经祖细胞(npc) [1,2]。神经发生在胚胎阶段和成人阶段都存在。在成人中,有两个截然不同的地区发生神经发生在中枢神经系统(CNS): subventricular区(SVZ)的侧脑室和subgranular区(SGZ)在哺乳动物的海马齿状回3,4]。胚胎神经发生发生在心室区(VZ)和SVZ源于神经上皮细胞的分化成放射状胶质细胞(RGCs)在小鼠大脑4,5]。

成年神经发生在50年前首先报道海马齿状的大脑(齿状回、DG区)6]。在此之前,科学界普遍认为很长一段时间,成年人的大脑不能产生新的神经元。现在,这个想法被广泛承认,成年神经发生存在于人类大脑的DG [7,8]。成年神经发生发生在大多数哺乳动物和其他脊椎动物9]。

nsc multipotential干细胞的自我更新能力并能产生神经元,星形胶质细胞,少突胶质细胞(9]。nsc发挥重要作用在神经发育的基础研究和广泛的潜在的干细胞治疗神经系统疾病,如中风、帕金森病、脊髓损伤(10,11]。据报道,一个不灭的人类NSC, HB1。F3 (F3),是由人类胎儿大脑但这15周妊娠细胞系是过表达v-myc致癌基因的逆转录病毒载体(10]。先前的研究表明,人类nsc移植静脉注射可以分化成不同的神经细胞类型和减少卒中后神经损伤(12,13]。

目前,他的研究细胞神经分化主要是集中在直接从他细胞分化成熟的功能性神经元或神经嵴干细胞临床应用[14,15]。值得注意的是,据报道,一个良好生产规范(GMP)分化过程设计了高效生产的多巴胺从他细胞祖细胞16]。也有研究获得GABA神经元从人类胚胎干细胞17)和大脑皮层神经元通过人类多能干细胞的分化(18]。同时,几组成功了,他们可以从他归纳出成熟的皮质神经元生产细胞通过一些小分子化合物(19- - - - - -22]。

由于潜在的神经干细胞的细胞疗法,开发和优化方法实现的重要性hNSCs生产。尽管上述研究可以皮质发展模式,从他的大多数细胞分化细胞成熟的混合人口包括上层和深层大脑皮层神经元。目前尚不清楚高纯度hNSCs已经从他的细胞生成。我们想开发差异化协议消除使用未定义的因素。

‘诺金’,被称为骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂,是一个关键neural-inducing因素在青蛙和哺乳动物(23,24]。重组的大脑已经应用于不同的神经感应协议他细胞分化[25,26]。最近,SB431542礼物增加神经感应能力在一个胚状体精神神经感应协议从他细胞通过抑制左撇子/苯丙酸诺龙/ TGFb通路(14,27]。虽然‘诺金’或SB431542治疗能促使神经诱导的效率,治疗本身并不是有效的神经感应将他定义或附着条件下细胞(14]。

Multipotential干细胞从他为细胞替代疗法提供了巨大的希望。更好的差异化协议是必要的为了减少未定义的因素调查这些方法在神经细胞生产的潜力。然而,合格的过程是稀缺和详细功能hNSCs起源于他的细胞仍不清楚。

在这里,我们开发了一种方法来从他获得hNSCs细胞,我们可以收获丰富hNSCs在相对较短的时间。大多数他细胞分化成nsc根据这个协议。然后,我们分离nsc的特征检测标记蛋白的表达和识别其分化潜力为星形胶质细胞和神经元。最后,我们分析了有丝分裂活动和细胞分裂周期的比例hNSCs,发现这些hNSCs健康人群。hNSCs和提高我们的研究将提供详细的特征的知识如何从他获得更多hNSCs细胞。我们的研究可能揭示这些细胞群的潜在治疗治疗脑损伤和疾病。

2。材料和方法

2.1。他细胞和细胞培养条件

他(H9)培养细胞对小鼠胚胎成纤维细胞(MEF) 30 -通道细胞。MEF细胞获得为期16天的怀孕的老鼠和培养在10%胎牛血清的边后卫在高葡萄糖DMEM (Gibco)。在使用之前,MEF细胞丝裂霉素C处理以阻止MEF部门。他细胞种植在MEF 1.8×103/厘米2密度。然后,他对MEF细胞细胞培养在下列条件:DMEM / F12 (Gibco)含20%击倒血清替代(Gibco), 1×不必要的氨基酸(Gibco), 1×GlutaMAX (Gibco), 1/2×青霉素和链霉素(Gibco), 0.1毫米beta-mercaptoethanol(σ),和6 ng / mL FGF-2 (HumanZyme) 6-well盘子。媒介改变了新鲜的每一天。当细胞需要通过每8天,我们用1 U /毫升dispase II(罗氏)在DMEM / F12 (Gibco)消化的细胞。最后,我们播种细胞1:9成新的比例6-well盘子。

2.2。基底膜基质,Poly-L-ornithine Laminin-Coated盘子

盘子被涂上一层凝胶(σ)或人工基底膜(BD)神经干细胞诱导。其他板块与poly-L-ornithine precovered(σ)和层粘连蛋白(热Fisher)对人类NSC文化和通道。菜刚涂上一层凝胶或人工基底膜和一夜之间必须保持在4°C包效果更好。盘子被0.5处理μg / mL poly-L-ornithine(溶解在水中)在室温下16个小时。然后,我们应用1 x PBS洗盘子。最后,5μg / mL层粘连蛋白添加到菜至少16小时。涂覆盘子可以集中存储在冰箱−20度,在使用它们之前,我们需要解冻,丢弃上层的液体。

2.3。神经干细胞诱导

他细胞消化运用StemPro Accutase(热费希尔)20分钟在37°C。然后,收集细胞和洗他细胞生长介质。细胞沉降离心机和收集。细胞被放入gelatin-coated板块为1小时37°C。因为他细胞被停职和MEF细胞附着在岩石抑制剂(Tocris)的存在,我们可以收集从MEF细胞悬浮细胞和他分开。不依从他细胞被洗和镀5×104细胞/厘米2密度在Matrigel-precoated菜MEF-conditioned介质(DMEM / F12含有20%悬浮介质从MEF收集细胞并非由丝裂霉素C治疗KSR 20%, 1×不必要的氨基酸,1×GlutaMAX, 1/2×青霉素和链霉素,0.1毫米beta-mercaptoethanol, 10 ng / mL FGF-2,和岩石抑制剂)。1天之后,岩石中含有抑制剂被改变了。单一细胞附着他扩大在细胞中几乎直到他们汇合的。新媒介改变了每2天。‘诺金’(500 ng / mL,研发)和鉴定及抑制剂(10毫米,Tocris)添加到融合性的细胞。

新媒介改变了每2天使用KSR媒介。第六天,及抑制剂被撤分化培养基和细胞变成了媒介与25%的氮气和75%的KSR 500 ng / mL的大脑。两天后,50% N2介质和50% KSR介质与500 ng / mL的大脑细胞。2天后,75% N2介质和25% KSR介质与500 ng / mL的大脑细胞。近10天后的分化,nsc 100% N2培养基培养(DMEM / F12 / N2 / B27 / GlutaMAX / FGF / EGF /肝素、青霉素、链霉素)1天,然后转移到一个100% N2 / B27媒介(DMEM / F12 / N2 / B27 / GlutaMAX / FGF / EGF /肝素、青霉素、链霉素)。hNSCs是通道1:每5天4比到poly-L-ornithine laminin-coated盘子。

2.4。神经干细胞的性格和分化

hNSCs培养在100毫米菜肴和通道poly-L-ornithine laminin-coated 24-well板块在N2 / B27第四段中FGF /补充EGF /肝素因素。三天后,hNSCs 24-well板被固定在4%多聚甲醛(PFA) 12分钟。

描述nsc的潜在能力,自发分化启动。自发分化试验可以诱导nsc到神经元,星形胶质细胞和少突胶质细胞。hNSCs种植在poly-L-ornithine laminin-coated 24-well板块较低密度100% N2 / B27介质与三因素(FGF / EGF /肝素)16个小时。第二天,我们改变了新鲜N2 / B27介质没有FGF, EGF,肝素的因素。然后,我们没有因素每2天更新中。这个自发分化的过程持续了至少21天。然后,分化的细胞被固定的使用上面所述的方法。

2.5。抗体,免疫染色和显微镜

对于BrdU疣状,孵化所需的活细胞与生长介质包括10μM BrdU 24小时在黑暗中有限公司2孵化器然后固定细胞4% PFA PBS如下。固定细胞permeabilized 1%皂素在PBS 8分钟,然后洗0.1%皂素PBS。2摩尔/ L盐酸(2 n)细胞治疗了18分钟。细胞被洗0.1%皂素在PBS三次,阻止了5%的牛血清白蛋白(BSA)在室温下1小时。细胞被孵化BrdU主要抗体在4°C 48小时和第二抗体室温为1.5小时根据一般的过程。

对于其他抗体染色,细胞固定4% PFA和PBS洗3次,然后permeabilized Triton x - 100的2.5%。细胞被封锁5% BSA在室温下1小时。根据一般的免疫荧光技术,细胞用0.1% Tween-20 PBS和孵化主要抗体在4°C 48小时。主要用于抗体免疫染色是Oct4 (Biovision) Sox2(研发),Pax6 (Covance), Nanog(研发)、巢蛋白(研发),Tuj1 (Covance) S100-beta(研发),Ki67(热费希尔),和BrdU (Santa Cruz)。初级抗体的稀释缓冲2.5% BSA在PBS。细胞用0.1% Tween-20 PBS的3倍和孵化第二抗体室温为1.5小时。最后,我们使用4 6-diamidino-2-phenylindole (DAPIσ)马克hNSCs的核心。额外的关注,当我们用DAPI,我们必须把细胞10分钟第二抗体孵育后在室温下。

被用倒置荧光显微镜观察细胞(尼康)。获得的图像在彩色CCD摄像机和基于pc的抓帧器数字化。然后,由ImageJ照片进行了分析,这是一个强大的图像分析软件。然后,收集到的数据从ImageJ被Excel计算。计算结果输入GraphPad棱镜6然后组织图表。

2.6。流式细胞术和统计分析

收集细胞后消化和离心机,享年1000岁 /分钟3分钟。细胞颗粒轻轻洗了3毫升PBS和悬浮在50μL PBS。细胞被降至1毫升预冷70%乙醇在PBS。细胞被保持在一夜之间−20度。第二天,包含细胞离心管,享年500岁 /分钟。上层清液被丢弃,细胞resuspended轻轻地400μL PBS包含0.5μ33258克/毫升赫斯特(σ)和10μg / mL核糖核酸酶a细胞管保持在黑暗中在室温下。最后,我们添加了Pyronin Y的管0.5的最终浓度μ克/毫升。20分钟后,管被放置在冰在黑暗中,分析了流式细胞术(BD)。结果流式细胞术被FlowJo计算和分析。

所有的结果都显示平均标准偏差的平均值(SD)。数据被Excel和计算 测量值的双尾学生的统计学意义t以及。

3所示。结果与讨论

3.1。结果
3.1.1。他从细胞中诱导神经干细胞

为了开发一个最优方案和检测的详细特性hNSCs从他细胞分化,我们扩大了分化方法获得hNSCs(图1)。使用这个新的协议,hNSCs分离通过一个简单的过程,一个相对较短的时间(图1(a))。具体的细胞状态显示(图在不同分化阶段1(b))。在分化过程中,细胞需要在不同的时间(图中为一个特定的文化1(c))。整个过程最初hNSCs MEF上培养的细胞,是收获消化成单个细胞。单一的ES细胞生长汇合的层后,诱导因素被添加到汇合的ES细胞。然后,细胞培养到分化。整个过程持续了4周,在此期间,有必要不断改变介质的细节描述如下。


图1
流程图的方法用于获得神经干细胞的细胞来自人类胚胎干细胞。(一)人类胚胎干细胞的分化过程神经干细胞。(b)细胞不同分化阶段的状态。人类胚胎干细胞原本长在馈线细胞,然后细胞消化单细胞和删除馈线细胞。单他细胞粘在盘子底部表面和单层他细胞增长。减少介质和因素被添加到单层他细胞。分化的细胞培养,直到结束。这个过程持续了约4周,细胞保持新鲜medim仔细。KSR媒体:基因敲除血清替代媒体;MEF-C媒体:小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基; non-ad hES: nonadherent human embryonic stem cells.

目的在于证明详细诱导分化的过程中,我们记录了细胞分化的不同阶段。他细胞培养和消化成单细胞显示在第一个两张图片(图2(一个))。为了获得足够的细胞,他细胞培养和放大MEF馈线细胞(图2(一个))。他在MEF饲养细胞,细胞已经7天,将立即消化(图2(一个),为消除MEF饲养细胞,B)。他细胞消化gelatin-coated板(图2(一个)C)。不依从他细胞种植到Matrigel-coated菜肴和扩大MEF-C中直到融合(图4天左右2(一个)D)。

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图2
神经干细胞的细胞是来自人类胚胎干细胞的分化。(一)人类胚胎干细胞培养和消化成单个细胞,然后馈线细胞(MEF细胞)被移除,并在MEF单层细胞培养条件直到他们汇合的媒体。(A)他细胞增长MEF饲养细胞,并将消化后7天文化开始分化。(B)他在MEF饲养细胞,细胞已经7天,将立即被消化。(C)他细胞消化gelatin-coated板去除MEF细胞。(D)不依从他细胞扩大MEF-C中大约4天直到汇合的。(b)‘诺金’和SB431542 hNSCs诱导人类胚胎干细胞。(一)汇合的单层他在分化培养基培养细胞包括KSR介质及抑制剂和‘诺金’1天。(B)在分化培养基中分化为5天。(C)分化为10天,改变KSR介质只有‘诺金’的第六天。 (D) After 12 days, cells grew in 25% N2 media with 75% KSR medium for 2 days. (c) Cells crawled out from the assembled ES cells. After cell passage, the clone was visible. (A) Cells climbed from hESCs at 15 days. (B–D) State of cells around passage. (d) Differentiated cells from human ES grew homogeneously and fast. Scale bar = 50 μm。(A, B)不同代从0到通道1。

诱导过程中细胞形态提出了发展特别是在天1,5,10,12,‘诺金’和SB431542添加到人类ES细胞(图2 (b))。汇合的单层ES细胞在分化培养基包括KSR培养基培养鉴定及抑制剂和‘诺金’(图1天2 (b)),细胞状态显示,5天后分化(图2 (b)B),细胞分化为10天,改为KSR介质从第六天(图只有‘诺金’2 (b)C), 12天后细胞增长在25% N2媒体75% KSR媒介(图2天2 (b)D)。

追踪细胞分化状态,我们使用成像记录新细胞在分化的诞生。细胞可以观察到有许多细胞爬行从他组装细胞(图2 (c))。然后,我们通过细胞生长介质准备hNSCs(图2 (c))。大量的新生细胞从他爬在15天,21天(图2 (c)a - b)。细胞传代后,hNSCs克隆形成显示(图2 (c)c - d)。分化细胞从他变得均匀,看起来很健康(图2 (d))。细胞的形态可能表明,新生的细胞有一个健康的状态和良好的增殖能力(图2 (d)a - b)。不同的一代从0到通道1(图所示2 (d)c - d)。

3.2。他从细胞中细胞分化Sox2 Pax6积极

识别细胞的分化趋势和潜在的胚胎干细胞,我们使用特定标记测试单元属性。我们发现细胞Octamer-binding转录因子4 (Oct4) -和Sox2积极(图3(a))。Oct4极度参与未分化的胚胎干细胞的自我更新28]。SRY基因-性别决定地区(Y)框2,也称为Sox2,是一种转录因子,是至关重要的维持胚胎和神经干细胞29日]。Nanog是一个转录因子批判与自我更新(30.]。在神经发生和扩散[Pax6实现其关键作用31日]。在这里,我们发现hNSCs Pax6表示,神经发生因素(图3(b))。然而,Nanog的表达下降但仍没有完全撤回(图3(b))。持久性的转录因子Nanog可能是由于神经干细胞的自我更新的重要作用以及在胚胎干细胞。在我们的研究中,虽然大多数他细胞可以分化成hNSCs,人口有一个小他拒绝的细胞分化成hNSCs(图3(c))。这些小undifferentiating他细胞还显示胚胎细胞character-Oct4积极(图3(d))和hNSCs很快死于特定文化中(数据未显示)。


图3
从他人类神经干细胞的细胞分化细胞Sox2 Pax6积极。(一)细胞分化从他Oct4 - Sox2积极。(b) Pax6和Nanog也表达在人类神经干细胞的细胞。(c, d)大多数他细胞分化成hNSCs,但人口不多他细胞未分化成人类神经干细胞的细胞,胚胎细胞character-Oct4还显示。(d)这是一个扩大规模(c)领域。酒吧= 50μm。
3.3。nsc细胞表达标记蛋白质,可以分化为星形胶质细胞和神经元

彻底调查神经干细胞,我们使用了神经干细胞标记蛋白抗体免疫染色。我们从他固定4通道细胞分化细胞,发现这些细胞Sox2(图4(一))和巢蛋白(图4 (b))积极。细胞表达Sox2和巢蛋白都视为hNSCs的特点。为了检测细胞分化的潜能,我们使用识别hNSCs能否产生自发分化为神经胶质细胞和神经元。我们发现细胞可以分化成S100-beta-positive(星形胶质细胞(图)4 (c))和特异性神经元第三类beta-tubulin - (Tuj1)阳性细胞(神经元)(图4 (d))。

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图4
细胞表达神经干细胞标记蛋白质,可以分化为星形胶质细胞和神经元。(a, b)细胞分化从他表示Sox2和巢蛋白的蛋白质。(c, d)细胞表达神经干细胞标记蛋白质,可以分化成S100-beta-positive细胞(星形胶质细胞)和Tuj1-positive细胞(神经元)。(一)比例尺= 50μm;(罪犯)比例尺= 25μm。
3.4。有丝分裂活动hNSCs分析

分析细胞的活动,我们利用5-bromo-2 脱氧尿苷(BrdU)抗体检测神经干细胞的分裂状态。BrdU总是作为胸苷类似物的识别DNA合成。BrdU-positive细胞被免疫荧光染色观察(图5(一个)),几乎一半的细胞(40.2%)BrdU积极在hNSCs(图5 (b))。Ki67,标记蛋白质的核糖体RNA转录,核蛋白质是细胞增殖所必需的。我们也探讨Ki67进一步研究细胞增殖。数据显示,Ki67-positive细胞被免疫荧光染色观察(图5 (c)),将近一半的细胞(52.2%)Ki67积极在hNSCs(图5 (d))。

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图5
有丝分裂活动的分析人类神经干细胞通过BrdU和Ki67抗体。(一)BrdU-positive细胞被免疫荧光染色观察。(b)近40.2%(396/985)细胞在hNSCs BrdU-positive。(c) Ki67-positive细胞被免疫荧光染色观察。(d)近52.2%(427/817)细胞在hNSCs Ki67-positive。比例尺= 50μm。
3.5。细胞分裂期hNSCs化验

获得的特征细胞分裂和细胞阶段,我们扑灭hNSC使用Pyronin Y和赫斯特33258染色流式细胞术分析。赫斯特33258年是一个蓝色的荧光染料使用DNA染色。Pyronin Y用于RNA染色。G0 / G1期DNA总是保持在2 n但RNA在G1期开始复制。S期细胞的DNA改变2 n和4 n之间和RNA继续复制。DNA含量达到4 n在G2 / M期。几乎一半的hNSCs部门(图6(一))。形态学的hNSCs流式细胞术分析之前(图所示6 (b))。数据显示,54%的细胞分布在G0-G1阶段,31%在S期,14%在G2-M阶段(图6 (c))。

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图6
流式细胞术分析人类神经干细胞通过Pyronin Y和赫斯特33258年。(一)流式细胞仪分析显示hNSCs,几乎一半的细胞分裂。(b)的形态学hNSCs流式细胞术。hNSCs (c)细胞分裂相分析。54%的细胞分布在G0-G1阶段,在S期31%,14% G2-M阶段。比例尺= 50μm。

4所示。讨论

hNSCs并改善我们的研究提供了详细的特征的知识如何从他获得更多高质量的hNSCs细胞。这些结果有助于促使这些细胞群细胞疗法的治疗潜力。

在本文中,我们采用了double-inhibiting方法从他获得hNSCs细胞‘诺金’和SB431542的结合应用。我们收获hNSCs通过一个简单的过程在一个相对短的时间。我们确定了从胚胎干细胞细胞的潜力。大多数他细胞可以分化成nsc,除了一个小的人口Oct4-positive他细胞。这些小nondifferentiation他细胞迅速死亡在以下文化(数据未显示)。

然后,我们确定hNSCs通过检测标记蛋白的表达并确认他们的分化潜力为星形胶质细胞和神经元。此外,我们分析了有丝分裂活动和细胞分裂周期的比例hNSCs,发现这些hNSCs活跃居民。研究细胞的活动,我们利用Ki67 BrdU抗体检测神经干细胞的分裂。

目前,促进他细胞神经分化的研究大多集中在功能神经元或神经嵴干细胞分化成熟的细胞疗法(15,16]。这种分化过程是开发高效生产的多巴胺从他细胞祖细胞16]。GABA神经元和脑cortex-specific神经元来自他细胞(17,18]。同时,成熟的皮质神经元从他生成细胞的小分子(19- - - - - -22]。尽管上述研究可以发展模式皮质很好,大多数的细胞从他产生细胞混合人口包括成熟的神经元。

模糊的高纯度hNSCs是否有很高的自我更新和增殖能力已经从他的细胞生成。这里,我们开发的差异化协议消除使用未定义的因素。定义的差异化因素将减少hNSCs在细胞疗法的应用障碍。我们调查了一个高效、快速从他获得hNSCs细胞分化的方法成功地在更短的时间内通过一个简单的过程比通常的方法(25,32]。

然后,我们确定了分离hNSCs通过检测标记蛋白的表达和识别潜在分化为星形胶质细胞和神经元。最后,我们分析了有丝分裂活动和细胞分裂周期的比例hNSCs,发现这些hNSCs健康人群。从他细胞hNSCs,我们的分化方法只需要大约3周(从图2(一个),B)图2 (c)C)。三周是一个非常短的时间内,由于以前的报告。通常需要5 - 7周时诱导分化的MEF细胞(25,32]。

脑损伤,如创伤性损伤、缺血性中风、帕金森病或其他神经退行性疾病死亡和残疾的主要原因在全世界,带来了严重的社会和经济负担33- - - - - -36]。因此,脑损伤的治疗方法旨在减少神经赤字是必要的和细胞治疗是至关重要的(37]。

干细胞移植中发挥着巨大的潜力,以减少残疾和促进中枢神经系统(CNS)损伤后大脑功能和疾病(38,39]。临床前数据指出,这些细胞疗法能增强大脑修复和显著改善中风或其他脑损伤后功能恢复(40]。他们被证明是安全的,高效的实验动物在中风和中风患者(41,42]。

细胞治疗尤其是干细胞疗法也被测试在某些神经疾病和得到希望的结果提出,它可能是一种有效的中风治疗(42]。目标保护神经干细胞的试剂,脑内皮细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞,神经元也可以改善卒中后神经功能(37]。

nsc是中枢神经系统的不成熟的前体和自我更新和multipotential分化能力。激素和地方因素可以直接调节其增殖和分化能力(43]。改变在神经发生与许多神经系统疾病有关。研究结果表明,nsc可以是一个潜在的治疗脑损伤(43]。

‘诺金’是一个BMP拮抗剂神经管发育起着重要的作用[44,45]。重组在哺乳动物的大脑也执行neural-inducing作用[24]。重组的大脑已经应用于多个不同的神经感应协议他细胞分化[25,26]。最近,该药物SB431542礼物从他支持神经感应细胞(27]。SB431542破坏左撇子/苯丙酸诺龙/ TGFb ALK4通路通过抑制活动,ALK5, ALK7受体(14]。虽然‘诺金’或SB431542治疗提示神经诱导的效率,治疗本身并不是有效的神经感应将他定义或附着条件下细胞(14]。

Multipotential干细胞从他细胞为细胞替代疗法提供了巨大的希望。更好的差异化协议是必要的为了减少未定义的因素应用这些方法生产的神经细胞。然而,详细的功能hNSCs分化从他细胞仍不清楚。

我们也做了少突细胞分化试验3周,细胞和少突胶质细胞的表型。少突细胞分化介质由neurobasal介质与B-27补充,GlutaMAX-I, T3。但最后,我们的免疫染色测试没有取得理想的结果,也许,我们需要更多的测试。有区别Ki67和BrdU检测部门的神经干细胞。BrdU通常被用作胸苷类似物的识别DNA合成。增殖标记蛋白质Ki67阻止染色体崩溃成一个单一的染色质质量和生物表面活性剂作为单独的有丝分裂染色体(46]。我们应该设计更多的化验发现扩散信息。额外的工作将被要求识别机制的双重抑制后hNSC分化和需要进一步减少细胞未分化的他的数量接近于零。

5。结论

细胞治疗可以提高功能恢复,帮助神经脑损伤。国家安全委员会(nsc)可能是一个潜在的治疗脑损伤。Multipotential干细胞从他细胞为细胞替代治疗提供巨大的希望。更好的差异化协议是必要的为了产生更多的神经干细胞疗法。然而,合格的过程是稀缺和详细功能hNSCs起源于他的细胞仍不清楚。在这项研究中,我们开发了一个程序从他得到hNSCs细胞,我们可以在很短的时间内收获丰富的hNSCs。hNSCs我们提供全面的特性和交付的知识如何获得更多的高品质hNSCs他细胞。这些结果可能有助于加速治疗通过使用这些干细胞治疗脑损伤。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。

确认

纸是由中国国家自然科学基金资助31371497和31371497。

引用

  1. f·h·盖奇,“哺乳动物的神经干细胞,”科学,卷287,不。5457年,第1438 - 1433页,2000年。视图:谷歌学术搜索
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