人体滑膜关节内注射Membrane-Derived间充质干细胞在小鼠胶原诱导关节炎:体内免疫调节能力的评估

文摘

本研究的目的是评估人类的功效滑膜membrane-derived msc (SM-MSCs)在小鼠胶原诱导的关节炎(CIA)。雄性老鼠(年龄7 - 9周)关节内注射SM-MSCs从骨关节炎患者,获得牛后28天,32和38 II型胶原免疫。SM-MSCs在中情局的疗效评估临床和组织学检查。细胞因子分析是由实时聚合酶链反应和多元分析。脾辅助T细胞(Th)和监管B细胞子集被流式细胞术分析。关节内的SM-MSC注入改善关节炎的临床和组织学的严重性。减少在肿瘤坏死因子-α干扰素-γ和白介素- 17 (IL) IL - 10和增加生产SM-MSC治疗后观察。流式细胞术显示,Th1和Th17细胞减少,而Th2、调节性T (Treg)和PD-1⁺CXCR5⁺FoxP3⁺卵泡Treg细胞增加SM-MSC-treated小鼠的脾脏。监管B细胞分析显示CD21。表征^嗨CD23^嗨过渡2细胞,CD23^低CD21^嗨边缘区细胞,CD19⁺CD5⁺CD1d⁺il - 10⁺监管SM-MSC治疗后B细胞增加。我们的研究结果表明,SM-MSCs注入关节发炎的中情局有治疗效果,可以防止关节炎发展和抑制免疫反应通过免疫调节细胞扩张。

1。介绍

类风湿性关节炎(RA)是一种系统性自身免疫性疾病,其特征是持续的炎症,广泛的滑膜增生,最终,软骨和骨破坏(1]。失去自我耐受性会导致不平衡效应和监管细胞,在发病中扮演着关键角色,RA的发病机制2,3]。特别是,干扰素(IFN)γ辅助T (Th) 1和白介素(IL) 17-Th17细胞被认为是病因学的人口,而调节性T细胞和B细胞(Treg) IL-10-secreting剖面,能够恢复自我耐受性和防止自身免疫性疾病(4- - - - - -6]。因此,由扩大监管细胞免疫耐受的复苏可能是一个理性的RA的治疗方法。

msc是成人多功能细胞,存在于骨髓(BM),脂肪组织,滑膜,滑液,围产期组织。这些细胞特征对成纤维细胞克隆形成单位(CFU-F)、表面标记表达式,并在体外multidifferentiation潜力,根据国际社会细胞治疗(ISCT)标准(7]。在过去的几十年中,msc主要调查了他们强大的免疫调节和抗炎能力,成为一个有前途的治疗自身免疫性疾病,如风湿性关节炎(8- - - - - -10]。

虽然积累的作品显然表明,msc是从BM和胎盘文化具有强大的免疫调节作用在体外和体内11- - - - - -13),相对是知之甚少的角色滑膜membrane-derived msc (SM-MSCs)免疫系统。SM-MSCs于2001年首次发现;据报道,人类从膝关节滑膜的捐赠者可能会引起纤维母细胞群拥有巨大的扩张潜力,典型的抗原表达,multidifferentiation能力(14]。最近,一些研究表明,SM-MSCs从骨关节炎(OA)患者会抑制T细胞增殖和维护Treg人口体外cocultured时同种异体淋巴细胞(15,16),这表明SM-MSCs也可以用来开发一个截然不同的免疫调节的方法。然而,体内监管SM-MSCs在RA中的作用还不清楚。

在这项研究中,我们采用小鼠胶原诱导的关节炎(CIA)模型来评估SM-MSCs重复内注入后的治疗效果。据我们所知,本研究是第一个显示SM-MSCs可以通过扩张FoxP3在中情局起到免疫调节作用⁺Treg细胞和CD21^嗨CD23^嗨过渡2 (T2)、CD23^低CD21^嗨边缘区(MZ), IL-10-competent监管B细胞。我们的数据表明,SM-MSC政府可能为RA的治疗提供一种很有前途的方法。

2。材料和方法

2.1。隔离和msc从人类滑液膜的扩张

msc隔绝人类滑液膜(如前所述)(17]。膝关节滑液膜获得无菌的人类捐助者(64±8岁,21岁女性和18名男性)为退行性膝关节置换手术的时候OA在哈尔滨医科大学第二附属医院,与捐赠者的理解和知情同意。排除标准为这些捐助者是风湿性疾病,感染在这项研究中,和恶性肿瘤的历史。

滑液膜冲洗两次在汉克的平衡盐溶液(哈佛商学院;Hyclone)补充antibiotic-antimycotic解决方案(100 U /毫升青霉素,100μ0.25 g / mL链霉素,μg / mL两性霉素B、生活技术)、切碎,与0.2%的I型胶原酶消化(生命技术)在杜尔贝科的修改鹰中低葡萄糖(DMEM-LG;Hyclone)含10%胎牛血清(的边后卫;青霉素和链霉素Excell Bio)和1% (P / S;英杰公司)。8 h后孵化在37°C,未消化的组织被使用70μm尼龙筛,收集细胞,洗两次,resuspended DMEM-LG补充与10%的边后卫和1% P / S的解决方案(称为生长培养基),扩张和镀T25培养瓶在37°C湿润有限公司5%₂大气中3 - 4天。不依从细胞被移除,生长介质每3天刷新到融合。在分离MSC单层使用trypsin-ethylenediaminetetraacetic酸(EDTA)(0.25%胰蛋白酶,EDTA 0.53毫米;表达载体),随后通过使用前的两倍。

CFU-F测定,细胞被播种密度的10⁴细胞/在6-well盘子和在生长培养基培养10天。细胞随后在4%多聚甲醛固定,沾0.5%结晶紫为5分钟。所有可见的菌落数。

2.2。识别SM-MSCs

的immunophenotype SM-MSCs被确认通过流式细胞术分析(流式细胞仪第二章,BD生物科学)通过使用以下荧光抗体:藻红蛋白——(PE)共轭鼠标反人类的CD34、CD45、CD90抗体;异硫氰酸荧光素(FITC)共轭CD73抗体;和allophycocyanin - (APC)共轭CD105抗体。同形像控制,适当的老鼠免疫球蛋白G (Ig)₁是代替主要的抗体。所有抗体购自BD Pharmingen(美国圣地亚哥,CA)。

SM-MSCs下一个测试他们的能力向脂肪形成的区分和成骨的血统。脂肪形成的感应,2.5×10⁵msc在6-well镀板和对待hMSC脂肪形成的差异化BulletKit™介质(Lonza)和维持14天之前被油红O染色(Sigma-Aldrich)。成骨诱导,msc消化和播种6-well 10板的密度⁵细胞/,然后保持在hMSC成骨分化BulletKit介质(Lonza) 21天前接受茜素红S染色(Sigma-Aldrich)。

2.3。感应的CIA和SM-MSC治疗

中情局在男性DBA / 1 j小鼠诱导(年龄7 - 9周)购自上海实验动物中心(线性、上海、中国)。老鼠()保持在标准条件下在我们的大学中心动物实验室和随机放置在笼子里。牛II型胶原蛋白(CII;Chondrex)在50毫米醋酸溶解,用同等体积的弗氏完全佐剂乳化(Sigma-Aldrich)。老鼠免疫与100年底部的尾巴μL乳液含有200μg人民共和国。21天之后,100年的老鼠注射助推器剂量μg CII(2毫克/毫升)用弗氏不完全佐剂乳化(Chondrex)通过皮内注射到尾巴。在28天,32和38第一次免疫后,小鼠麻醉和10⁶msc在7μL PBS是关节内的注入的右膝SM-MSC治疗组();控制老鼠收到7μL PBS关节内的()。

2.4。关节炎的临床和组织学评估

每个鼠标临床关节炎和严重程度评分(每组)进行评估每2天使用的意思是关节炎严重程度指数、分数在0 - 4,之前报道(18]。平均厚度的后爪是用游标卡尺测量。小鼠麻醉和安乐死CII免疫后70天,和脚踝关节(右)收获了组织学评估。关节在4%多聚甲醛固定,在10% EDTA脱钙48 h,并嵌入在石蜡。组织切片在7μ米厚度和苏木精和伊红染色())。彩色联合部分都是通过光学显微镜观察蒙蔽的方式。

2.5。定量聚合酶链反应(PCR)

从右膝盖关节滑液的小鼠在实验的最后收获。总RNA提取使用试剂盒试剂(表达载体)和反向转录cDNA Primescript RT工具包(豆类)根据制造商的指示。SYBR Green-based实时PCR进行使用7500快速实时PCR系统(美国应用生物系统公司)量化的mRNA水平TNF -α干扰素-γIL-17A, il - 10、il - 4和转化生长因子- (TGF)β。基因表达的相对变化计算使用比较C_T方法。目标基因的mRNA水平是标准化的β肌动蛋白基因。本研究中使用的引物序列从引物获得哈佛大学的银行和被列在表中1。

2.6。多元分析

内眦静脉的外周血样本收集小鼠醚麻醉后70天,和血清后获得了一个标准的协议。细胞因子(TNF -α干扰素-γIL-17A,血清中il - 10、il - 4)浓度测定细胞因子与多路复用珠阵列系统(德国默克公司)根据制造商的指示。

2.7。流式细胞术

脾细胞是刚做好的70天,和单细胞悬浮体染色后抗体的细胞表面分析:anti-CD4-FITC, anti-PD-1-peridinin叶绿素(PerCP) anti-CXCR5-APC, anti-B220-APC, anti-CD21-FITC, anti-CD23-PE anti-CD19-PerCP, anti-CD5-FITC, anti-CD1d-APC抗体。转录因子染色,细胞被固定和使用商业FoxP3 permeabilized染色工具包(美国eBioscience)根据制造商的协议。细胞内细胞因子染色,孤立的脾细胞与佛波醇刺激十四酯(PMA;50 ng / mL) / ionomycin (1μg / mL) 4 h brefeldin (3μ和monomycin (1.4 g / mL)μg / mL)。以下使用抗体:anti-IFN -γpe、anti-IL-4-PE anti-IL-17-PE, anti-IL-10-PE抗体。适当isotype-matched控制抗体被用来确定非特异性染色。所有抗体都买了BD生物科学。数据获取与流式细胞仪第二章流式细胞分析仪(美国BD生物科学)和分析使用FlowJo软件。

2.8。统计分析

数据提出了的意思标准偏差(SD)。比较两组之间的参数数据进行了分析与学生的t -测试。统计分析了GraphPad棱镜(Mac版本6;GraphPad软件)。值小于0.05被认为是重要的。

2.9。道德声明

人类使用的材料在这个研究是哈尔滨医科大学医学伦理委员会批准。所有的老鼠实验动物研究当地伦理委员会的许可,是符合国家实验动物使用指南。

3所示。结果

3.1。描述人类SM-MSCs

显示的SM-MSCs spindle-like,成纤维细胞形态(图1(一)),这是一个典型的msc的特征。自CFU-F试验被认为是提供最接近的估计MSC水平(19),我们评估细胞的克隆形成疗效与人类的滑液膜。细胞发达大殖民地文化持续了10天(图1 (b)),建议的高产和扩张潜力孤立的msc。流式细胞仪分析显示SM-MSCs负造血血统CD34、CD45标记,而他们CD73阳性,CD90、CD105(图1 (c))。SM-MSCs能够区分向成熟脂肪细胞和骨细胞显示油红O染色和茜素红染色(图1 (d))。

3.2。管理SM-MSC改善胶原诱导关节炎

我们准备细胞腔内注入正确的膝盖的老鼠在28天,32和38第一次免疫后(图2(一个))。重复内注入10⁶SM-MSCs右膝有效减毒的关节炎症状(图2 (b))和平均减少关节炎评分()(图2 (c))。SM-MSC-injected老鼠的后爪厚度均明显低于控制老鼠()(图2 (d))。组织学检查中情局PBS处理为特征的积累在滑膜组织炎性浸润,滑膜增生的滑膜衬里层,其次是血管翳的形成和关节损伤。组织学分析SM-MSC-treated踝关节的老鼠显示一个相当正常的关节结构,表现出显著的降低细胞渗透,没有或有限的滑膜炎和血管翳形成(图2 (e))。因此,重复内注入SM-MSCs在中情局的治疗效果。

3.3。重组细胞因子资料后SM-MSC治疗

我们分析了居民synoviocytes的细胞因子基因表达缺失或同种异体SM-MSCs的存在。滑膜组织(右膝关节)从老鼠70天,收获和TNF - mRNA水平α干扰素-γIL-17A, il - 10、il - 4和TGF -β被量化。与接受pbs的结果控制相比,synoviocytes SM-MSCs显示降低TNF -的存在α干扰素-γ,(TNF - IL-17A表达式α:干扰素-γ:,IL-17A:),伴随着il - 10的一个重要增长记录()。il - 4和TGF -β表达SM-MSC-treated和接受pbs组没有显著差异(il - 4:TGF -β:)(图3(一个))。

接下来,我们分析了血清中细胞因子的浓度。多元分析显示,肿瘤坏死因子-α和IL-17A SM-MSC-treated小鼠血清中浓度显著降低,而抗炎介质的浓度il - 10 (TNF -的显著增加α:IL-17A:,il - 10:)。观察干扰素-没有显著差异γ和il - 4水平在CIA小鼠(IFN - SM-MSC治疗后γ:il - 4:)。然而,干扰素-γ/ il - 4的比例要低得多比PBS对照组小鼠SM-MSCs对待()(图3 (b))。总的来说,这些数据表明,地方政府SM-MSCs导致系统性监管效果在CIA小鼠细胞因子的概要文件。

3.4。SM-MSC治疗纠正Th1 / Th17之间的平衡和FoxP3-Expressing Treg细胞在脾脏

特异表达Th细胞引发的子集被证明是主要参与者负责组织损伤的细胞因子级联(20.]。因此,我们下一个解决重复SM-MSC治疗小鼠中情局能否正确的平衡Th细胞在脾脏子集。脾细胞分离和PMA刺激/ ionomycin之前流式细胞术分析。Th1细胞的频率,定义为IFN -γ表达CD4⁺SM-MSC-treated小鼠T细胞,显著低于在接受pbs老鼠,而Th2细胞定义为IL-4-expressing CD4⁺T细胞明显增加(Th1:Th2:)。此外,IL-17-expressing CD4较少⁺T细胞,更具体⁺CD4⁺Treg SM-MSC-treated老鼠细胞(Th17:Treg:)(图4(一))。因此,SM-MSCs可以帮助恢复Th1 / Th2和Th17 / Treg细胞平衡中央情报局。

FoxP3的关键的增强⁺SM-MSCs促使进一步分析的T细胞亚群Treg细胞。卵泡Treg(总和生育率)细胞,源自自然Treg前兆,记录有抑制效应T细胞体外增殖和生发中心(GC) B细胞体内反应(21,22]。在我们的研究中,CD4的显著增加⁺CXCR5⁺PD-1⁺FoxP3⁺总和生育率细胞中观察到SM-MSC-treated老鼠比PBS控件()(图4 (b))。在一起,这些数据表明,增加FoxP3-expressing Treg细胞,伴随着Th1和Th17反应减少,参与机制关节炎缓解下SM-MSC治疗。

3.5。SM-MSCs青睐监管在脾脏B细胞的发展

先前的研究表明,监管B细胞扮演着一个关键角色,维护周边通过Th1和Th17反应抑制和FoxP3宽容⁺Treg细胞池感应(23]。此外,总和生育率脾脏细胞要求最优扩张和监管B细胞分化[24]。确定Treg细胞增加SM-MSCs-treated老鼠伴随着增加监管B细胞,我们分析了几种B细胞的比例特征子集,以前被免疫耐受的机制(25]。B220⁺细胞表型分析CD21和表征CD23的表情。SM-MSC-treated老鼠有一个相当高的频率CD21。表征^嗨CD23^嗨T2细胞和CD23^低CD21^嗨MZ细胞比PBS控制,而CD21。表征的比例^intCD23^int滤泡(FO) B细胞相似的两组之间(T2:FO:,MZ:)(图5(一个))。CD19细胞⁺CD5⁺CD1d⁺il - 10⁺表型,B10细胞,增加SM-MSC-treated老鼠()(图5 (b))。总的来说,我们的研究结果表明,SM-MSCs诱导增加监管B子集,包括T2、MZ,和B10细胞,在CIA小鼠的脾脏。

4所示。讨论

风湿性关节炎是一种典型的慢性和进步的自身免疫性疾病,与故障相关的免疫耐受和异常炎症反应。虽然现在可以使用生物制剂等新治疗药物,相当比例的患者仍对这些疗法。MSC-based细胞疗法是一种很有前途的选择RA患者的抗炎、免疫调节,这些细胞的再生性能。适当的来源msc、理想的管理路线,时机和最优的疾病/阶段实现有效的治疗效果是至关重要的因素。

在这项研究中,人类SM-MSCs选择从众多细胞来源,因为他们强大的免疫调节特性在coculture T淋巴细胞在体外和高增殖能力有限的衰老14]。此外,msc的“现成的”属性使可用的同种异体人为msc CIA小鼠(26]。msc从骨关节炎关节滑液膜能够抑制CD4细胞被发现⁺对CD3 / CD28刺激T细胞增殖,而BM-MSCs从同一个病人不能16]。此外,人类的滑液膜的访问来源msc。他们通常OA患者,关节镜检查和膝关节置换手术期间,提供优秀的供应未来临床应用的优势。此外,先前的研究在SM-MSCs强调这些细胞在组织修复的重要性质;这些数据表明,SM-MSCs将是一个有前途的选择破坏性疾病的治疗的骨头和软骨27]。

据我们所知,我们的研究是第一个显示SM-MSCs在中情局的治疗效果。中央情报局是RA的最常见的小鼠模型研究,一般认为是依赖collagen-specific CD4⁺T细胞在关节自身免疫反应的初始阶段28]。重复管理SM-MSCs与减少发炎的关节会减弱关节炎严重性血清中炎性细胞因子il - 10和增产,表明当地MSC治疗可能产生系统性的小鼠的治疗效果。最近的研究报告说,重复关节内的同种异体的MSC可以安全管理策略,从而增强MSC可用性(29日]。同样,使用proteoglycan-induced关节炎(PGIA)的一项研究中,一个研究类风湿性关节炎模型,表明关节内的BM-MSCs有效减少关节炎的累积分数和PG-specific IgG2a血清的抗体水平(30.]。另一项研究使用小鼠antigen-induced关节炎还解决了msc的系统性抗炎效果,反映在降低TNF -αBM-MSCs浓度后血清注射到膝盖关节(31日]。众所周知,msc对通过本地信息接触或分泌的可溶性免疫调节作用调节介质,在特定MSC-derived吲哚胺2,3-dioxygenase (IDO)在人类和诱导一氧化氮合酶(间接宾语)在鼠标32]。此外,msc在免疫反应的调节作用,特别是通过分泌可溶性因子,批判与炎症信号发生的“许可证”,应用msc (33]。我们假设外生synoviocytes msc和居民之间的相互作用可能触发一系列生物过程参与msc的旁分泌行为,这是最有可能负责msc在中情局的治疗效果。

虽然我们的结果是有前途的,本研究的一个限制是,我们没有跟踪SM-MSCs注入体内的分布。之前的研究表明,msc注入关节内的保留在注射部位1 - 4周,没有迁移到遥远的器官如肺,脾,肝(30.,31日]。

这里介绍我们的数据表明,SM-MSCs在CIA小鼠的治疗效果是通过增加监管FoxP3平行⁺T细胞(Treg和总和生育率)和诱导监管B细胞(T2、MZ和B10),两者都是必不可少的抑制免疫反应自体抗原特异表达和参与自我耐受性机制。先前的研究证明,注入人类gingiva-derived msc显著改善中情局通过抑制Th1和Th17 FoxP3-expressing CD4反应和增加⁺在脾脏T细胞(34),与我们的研究结果一致。此外,SM-MSCs似乎阻碍B细胞的成熟和分化和诱导IL-10-competent监管B细胞在我们的研究中。这是支持的增加immature-transitional阶段B细胞如CD21。表征^嗨CD23^嗨2 (T2)细胞和CD23过渡^低CD21^嗨MZ细胞,以及CD5⁺CD1d⁺il - 10⁺细胞,SM-MSC-treated小鼠的脾脏。将未成熟的T2细胞从老鼠关节炎缓解阶段可以帮助恢复平衡Treg和Th1 / Th17反应il - 10^−−/主机(35,36]。同样,CD5过继转移⁺CD1d⁺il - 10⁺监管B细胞阻止CIA小鼠抑制发展Th17细胞在脾脏和淋巴结(25]。最近诊断为RA患者临床资料还透露,有较小的IL-10-competent B细胞,包括CD19⁺CD5⁺CD1d⁺细胞和CD19⁺TIM1⁺细胞,比健康对照组,这减少呈正相关,CD4细胞的数量⁺CD25⁺FoxP3⁺Treg细胞在外周血37]。鉴于上面的和之前的数据,我们假设,不仅FoxP3⁻Treg细胞还T2、MZ,和IL-10-expressing监管B细胞负责与CIA小鼠炎症反应的抑制,表明细胞调节B细胞和Treg细胞之间的相互作用是关键决定的有益结果SM-MSCs中情局。函数前馈回路之间的免疫调节T细胞和B细胞在治疗SM-MSC是极大的兴趣,需要进一步研究。

5。结论

据我们所知,目前的研究是第一个显示SM-MSCs可以预防关节炎的关节内注射通过FoxP3的扩张发展和抑制免疫反应⁺Treg细胞和T2、MZ和IL-10-competent监管B细胞,从而恢复外围宽容与CIA小鼠。我们的发现在CIA小鼠建立SM-MSCs的体内效应,表明关节内的管理SM-MSCs RA细胞疗法可能构成潜在的方法。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(81373202)和中国国家高技术研究发展计划(2015 aa042401)。作者要感谢Editage (www.editage.com)英语编辑。

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