文摘
介绍。增加干细胞生物可降解支架加强骨再生是一个有价值的选择。不同种类的干细胞成骨细胞的活动进行了测试,如骨髓基质干细胞(BMSSCs)。目的。评估一个正确的协议成骨干细胞分化,所以BMSSCs被播种在一块骨头猪(BPB)。材料和方法。骨髓从六个minipigs提取从胫骨、肱骨和孤立BMSSCs治疗。播种后BPB,临界大小的缺陷上创建的每个下颌骨minipigs和植入BPB BPB / BMSSCs。三个月后,histomorphometric进行分析。结果。Histomorphometric分析提供三组的百分比。组织中存在控制缺陷板层骨23±2%,28±1%编织骨,56±4%骨髓空间;在摄影领域的缺陷20±5% BPB,板层骨32±2%,24±1%编织骨,和28±2%骨髓空间;BPB / BMSSCs缺陷BPB / BMSSCs 17±4%,板层骨42±2%,编织骨12±1%,骨髓空间22±3%。结论。BPB用作支架诱导骨再生可能受益于增加的BDPSCs组织工程结构。
1。介绍
1.1。骨再生和干细胞
牙科社会所面临的一个常见问题是口腔功能的康复患者的无齿的萎缩性肺泡的过程。改进成功的方法诱导骨再生是一个持续的挑战在牙科1]。近年来,生物材料的使用来提高骨再生大大发展,因为他们的能力模仿细胞外基质的自然环境(2]。增加这种方法的有效性,生物材料的使用,或支架,在协会与干细胞osteoblast-like活动介绍(3,4]。1968年,Friedenstein等人首次出版作品展示的成骨的属性在不同的组织和骨髓移植培养的可能性,克隆,再移植体内(5]。大量的干细胞研究之后(6,7]。成人可以获得,还可以从许多别的来源间充质干细胞。特别是,他们能成功地在osteoblast-like分化细胞源自不同的牙科组织(8- - - - - -11]。
1.2。BMSSC
在干细胞与所需的成骨细胞的活动,BMSSCs已经证明有效的诱导新骨形成临界大小的缺陷的动物模型12- - - - - -14]。实际上,这些细胞增强骨形成的能力甚至可以发现scaffold-type建筑、立体的形状,和文化浸润的细胞。近年来,使用了一些矩阵,从nonresorbable生物材料,如羟磷灰石,在与BMSSCs不同的关系,包括层封装在水凝胶(15牛骨[]或煅烧16),resorbable的如beta-tri-calcium磷酸盐(βtcp)或磷酸氢钙(CP) [17]。当比较矩阵,一项研究发现一个更好的反应体内和体外磷酸钙而不是增加羟磷灰石骨小梁形成,细胞密度,减少纤维化(18]。不管结果,仍没有公认的支架,每一个都有单独的测试。
支架,BMSSCs原位培养提高骨折愈合和矩阵再吸收成骨的影响。在最近的实验中,BMSSCs丰富壳聚糖支架产生骨,超过CP独自在大鼠肌肉(19]。BMSSCs nonhematopoietic元素的骨髓(BM)。这个集群整体细胞的细胞由不到0.01%的人口居住在大英博物馆(20.]。BMSSCs显然是明显的非齐次性质时检查单独的殖民地。不同的细胞形态包括梭形细胞、纤维母细胞,或殖民地的大型和flat-shaped细胞。此外,如果允许这样的文化发展长达20天,表型异质性也指出。一些殖民地是高度碱性磷酸酶阳性(高山),而另一些人则是消极的,第三种类型是中部地区的积极和消极的外围(21]。一些殖民地形成矿化结节矩阵可以被冯Kossa染色茜素红或钙。然而别人积累脂肪,被油红O染色(22),而一些殖民地形成软骨被阿尔新蓝染色(23]。在最近的一项研究[24)对小鼠间充质干细胞来源于牙髓和骨膜骨再生的差异被发现,证实加强与间充质干细胞再生的假说。这是测量骨体积的比例总缺陷面积,播种时支架块脱去蛋白质的猪骨(BDPB)单独和牙髓和骨膜干细胞。定性观察骨histomorphometry分类的本质为片状或编织骨元素。剩余生物材料和炎症介质内的缺陷也被观察到。类似的模型已经采用本研究评估不同程度的骨再生使用猪骨块与骨髓基质干细胞(BPB / BMSSCs)。
本研究的目的是评估一个正确的协议成骨干细胞分化成骨细胞的表型在适当的衬底:BMSSCs播种在一块骨头猪(BPB)为了提高性能在骨再生使用的脚手架块和诱导与BMSSCs定性优越的再生。
2。材料和方法
2.1。动物
六成人minipigs的平均年龄2年被用于本研究。的均值±4公斤体重29公斤。研究协议是意大利国家批准的卫生(协议编号7326 - 26/06/2013)。
根据动物维护道德行为指南由欧洲共同体委员会指令的11月24日1986 (86/609 / EEC)。所有努力都是尽量减少动物的疼痛或不适。在每个emi-mandibula 3缺陷(5毫米宽,5毫米深)。缺陷被填写以下方式:一块骨头猪(BPB)的一个缺陷(OsteoBiol, Tecnoss、Coazze、意大利)BMSSCs插入,一个满是猪骨块没有BMSSCs空,和一个缺陷是留空的控制。总共36临界大小的圆形缺陷(5毫米直径;5毫米厚度)。
2.2。体外细胞培养
骨髓是收获根据以下手术技术。
minipigs,骨髓是收获的近端胫骨、肱骨。在猪身上的血液循环量是65 - 75毫升/公斤。用于实验的动物是~ 30公斤的体重;因此,总量为20毫升的骨髓动物安全地收集,特别是5毫升/骨段考虑两个肱骨和两个胫骨,获得大约2×109骨髓单核细胞(BMMNCs)每头猪25- - - - - -27]。猪麻醉如前所述。一个无菌的环境中进行的技术和使用无菌手套和工具,剃须后,彻底消毒皮肤的收获。程序是用一根针来实现专门用来收获骨髓,11个指标×110毫米,前沿和主轴。收获地点是在通信与内侧胫骨近端肱骨的四肢,密质骨在哪里更符合这一领域相对较薄的皮质骨。猪被放置在横向卧位的位置。骨髓愿望针是通过皮肤与主轴的位置。皮质骨的主轴是移除,骨髓,骨段5毫升的体积,吸进无菌注射器含0.2毫升的肝素(1000单位/毫升)。样品很快就转移到实验室的后续步骤隔离和干细胞分化。
2.3。BMSSC隔离、文化和脚手架准备
为了获得BMSSCs,骨髓吸入物处理如前所述短暂(28,29日):1077年样本受到Histopaque密度梯度(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。巴菲外套细胞分数完全是收获和孵化湿润大气中5%的二氧化碳在37°C获取BMNCs: 24小时后,不依从细胞部分被丢弃而粘附细胞分数培养48 - 72小时,直到达到semiconfluent状态(图1(一))。
(一)
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(c)
BMSSC文化,从而获得,使胰蛋白酶化,计算,然后用于测试和集成支架。控制成骨分化,细胞部分被培养在抗坏血酸的存在50 ng / ml十天,然后染色碱性磷酸酶(ALP)表达式如前所述(图1 (b))。从每个动物,1×106BMSSCs用于流仪测定表明间充质干细胞标记表达式。猪骨块支架使用提出了圆柱形状,直径5毫米和5毫米长。他们刚性多孔的街区,因此在时间上能够保持最初的移植物体积,这是特别重要的大型再生。
之前结合细胞、支架在alpha-MEM水化和孵化为30分钟三次调湿大气中5%的二氧化碳在37°C。细胞播种之前,介质的体积中包含的三度空间的结构支架使用无菌棉花球被吸收。100μl BMSSC悬挂(5×105细胞)在慢慢滴到支架以避免溢出。BMSSCs孵化在湿润的支架播种大气中5%的二氧化碳在37°C 2 h,然后添加额外的培养基是完全覆盖支架。确保细胞可以成功连接到支架,文化是孕育在湿润的气氛中5%的二氧化碳在37°C 3天。3天后,50μg / ml添加抗坏血酸和媒体改变了每2天为了获得两周,支架移植之前,BMSSC成骨分化的细胞整合到支架(图1(c))。
2.4。体内下颌缺陷
手术在全身麻醉下感应Zoletil 100(盐酸tiletamine +盐酸zolazepam)的剂量6毫克/公斤IM。维护与异氟烷在2/2.5%氧气。三个双边临界大小的圆形缺陷(5毫米直径;5毫米厚度)创建使用手钻和环钻在下颌体(图2)。下颌骨的后部区域被选中,是因为存在常规的前庭皮质板的厚度;创建缺陷与具体措施更好的地方圆柱形骨猪块,完全适应,缺陷。每个缺陷都是随机的外科医生。过程中,无菌生理盐水滴在钻井现场为了避免广泛的加热和保护周围的骨头。
治疗术后疼痛与flunifen(氟尼辛葡甲胺)在剂量为2.2毫克/公斤我两次(所有)或根据动物是否显示疼痛。抗生素治疗Repen (Benzilpenicillina双氢链霉素)剂量的20.000 IU的Benzilpenicillina和双氢链霉素12.5毫克/公斤5天IM。
2.5。Histomorphometry
标本在生理盐水洗,立即在4%多聚甲醛和0.1%戊二醛固定0.15甲次砷酸盐缓冲在4°C和pH值7.4,为组织学处理。锥束ct (CBCT) (Vatech Ipax 3 d pch - 6500,李堡,美国新泽西)和标准RX(图55×75毫米电影3mandibulae)进行检索。DICOM数据阐述了Ez3D +软件(Ez3D + VATECH全球李堡,美国新泽西)精心制作的3 d模型标本和找到完美的生物材料支架的位置和对齐骨头本身。CBCT分析还允许评估之间的接口支架和周围的本地骨头。支架位置CBCT鉴定后,后区mandibulae与带锯加工获取薄的地面部分,并精确的自动化系统(如,罗马,意大利)的标本在一个提升系列脱水酒精冲洗和嵌入在glycolmethacrylate树脂(Technovit 7200 VLC、Kulzer Wehrheim,德国)。聚合后,标本切片与50 mesiodistal方向μ米的距离一个幻灯片,随后一个,使用高精度金刚石圆盘约为150μm和地面下降到30μ与一个特别设计的磨床。总共3张幻灯片为每个标本了。幻灯片和酸碱性品红和甲苯胺蓝染色,他们观察到在正常下透射光Leitz则Laborlux显微镜(Leitz则位于德国)。
Histomorphometry进行了使用光学显微镜(Leitz则Laborlux年代,位于德国)连接到一个高分辨率摄像机(3 ccd, JVC KY-F55B, JVC®,圣克拉拉,CA,美国),界面的监控和PC(英特尔奔腾III 1200 MMX,英特尔®,横滨日本)。这个光学系统与数字化垫(矩阵愿景GmbH, Oppenweiler、德国),和一个histometry软件包与图像捕捉功能(Image-Pro + 4.5,媒体控制论Inc . Immagini &计算机Snc米兰,意大利)。评估剩余百分比的生物材料,新骨形成,骨髓空间进行下颌缺陷的三个实验组。每个部分在至少6 x放大检查,评估和整个地区的部分。数字图像的每个部分收购和用于跟踪区域确定为新骨,残余粒子,和骨髓空间。图像处理软件是用于创建单个层新骨,残余粒子,和骨髓空间。这些层被转换成一个二进制(黑色和白色)形式,和地区三层的每个数字的百分比计算,基于像素的数量,用图像分析软件。
2.6。统计分析
权力分析使用临床软件,免费http://clincalc.com/stats/samplesize.aspx,确定骨缺陷的数量需要达到统计学意义histomorphometry的定量分析。计算模型采用二分变量(是的/没有影响)通过将影响发病率旨在警告的原因治疗,控制为95%,20%。最优数量的骨缺陷进行分析是10,而在目前的研究中,每组12创建缺陷。
方差分析是用来确定统计学意义的三个检验组之间的差异。新骨形成的百分比,骨髓空间,和剩余生物材料被表示为±标准差。观察到的差异的重要性是为多个比较评估使用Bonferroni测试:阈值被设定为统计意义。
3所示。结果
Histomorphometric后分析结果显示不同的骨再生BPB和BPB / BMSSC组之间评估测量板层骨的百分比,编织骨、骨髓空间,和残余摄影领域。对照组显示常规的治疗模式。三个月后没有发现宏观缺陷。
3.1。控制
骨组织是明显的分化良好型的细胞和矿化矩阵:类骨质,造骨细胞,骨细胞和血管。再生骨组织从轴向墙壁的边缘被观察到。纤维组织缺陷仍然占据小空间面积(图4)。从骨膜新生骨的痕迹被观察到,上覆的表面部分骨缺损。组织中存在的缺陷是由23个±2%的板层骨,28±1%的编织骨,56±4%的骨髓空间。
(一)
(b)
3.2。猪骨块(BPB)
低倍镜下,可以观察到,几乎所有的块材料包围成熟骨:只有在某些领域可以观察骨样的物质的存在。物质粒子接近骨髓空间只有少数地区。在所有标本,没有急性炎症细胞浸润或异物反应是目前在粒子或骨的界面。块都是殖民地和新形成的骨(图包围5(一个))。这个骨头是编织或片状。在摄影领域,总有新形成的骨的存在。没有观察到上皮细胞或结缔组织接口。再生骨组织延伸到大约所有骨缺陷除了中央区域,那里的纤维组织仍然占据interparticular空间的一部分。观察骨突出纹理的成熟。实验腔的边缘和中央部分矿化新骨形成(图6(一))。骨缺损并没有完全愈合,许多粒子或BPB是可见的。组织中出现的缺陷是由20±5%的BPB,由32±2%的板层骨,24±1%的编织骨,28±2%的骨髓空间。
(一)
(b)
(一)
(b)
3.3。猪骨块与骨髓基质干细胞(BPB / BMSSCs)
再生骨组织观察周围一些BPB从轴向墙壁的边缘。骨组织是存入块(图5 (b))。新骨扩展到基底第三骨缺损的边缘和部分包围了BPB块。新骨延长也在中央骨缺陷(图的一部分5 (b))。没有纤维组织中观察到的缺陷区域。从骨膜新生骨的痕迹被覆盖的表面部分骨缺损。骨形态更成熟和组织良好呈现层状模式与周围骨缺损。周围骨组织块的高放大显示,没有出席bone-biomaterial空白界面,和骨头似乎总是在密切接触块(图6 (b))。在某些领域,观察成骨细胞的过程中直接添骨块表面。没有急性炎症细胞浸润,或异物反应出现在粒子或骨的界面。所有的缺陷都充满了新形成的致密骨和骨髓。组织中出现的缺陷是由17±4%的BPB / BMSSCs, 42±2%的板层骨,12±1%的编织骨,由22±3%的骨髓空间。
3.4。统计评估
被发现在统计上有显著差异的百分比之间的空间和板层骨骨髓三组()。BPB之间的细节,和BMSSCs / BPB,片状和编织骨的差异被发现具有统计学意义和考虑骨髓空间,而没有区别生物材料中发现了两个测试组(图之间的比例7)。
4所示。讨论
本研究发现相关的差异在使用一块骨头猪骨再生支架植入骨髓基质干细胞与骨块猪相比没有任何形式的治疗。文献提出了各种丰富的干细胞/祖细胞用于细胞骨再生。他们一直在探索临床和实验了不同程度的成功。猪骨块支架承诺各种组织工程的应用。BPB支架有一个防止硬结构缺陷和创建正确的骨再生环境没有软组织殖民的风险。BPB支架是完美的为当地的骨再生材料因其生物相容性、osteoconductivity [30.),孔隙度允许高效BMSSC播种和增长31日]。BPB生物降解分析不是本研究的目的,因此,支架生物降解和骨形成之间的关系还没有详细研究,只在组织学评估测量的比例。
在目前的研究中,一个3 d软件分析CBCT表现和组织学图像被收购,BPB植入位置和诱导更高的BMD和SUV在下颌缺陷没有BMSSCs BPB相比。尽管BMSSCs的贡献,在两组骨形成是可见的。本研究旨在进一步描述在这些scaffold-based BMSSCs植入物引起的骨再生利用组织学参数。剩余生物材料的百分比,新骨形成,在下颌缺陷和骨髓空间充满BPB单独或结合BMSSCs进行评估。Histomorphometry进行了单独的骨头、骨髓空间,与测量误差和残余移植材料,和和永远不会给100。此外,下颌骨缺损的组织形态学的定性描述。描述的特征包括新形成的骨,炎性细胞浸润,和骨形成在缺陷的位置。histomorphometric结果显示,观察到的时候,骨髓空间和残余移植材料的数量超过新骨形成总是从100%完全不同,这是由于这样的事实,这三个分别进行测量与误差误差之和是包容性的测量进行BPB,板层骨或编织骨和骨髓空间。结果表明,虽然残余生物材料的比例是相似的实验人群,形成新骨和骨髓空间的比例是不同的。目前的研究表明,BPB / BMSSC组导致大大增强骨形成在牙槽骨缺损minipig下颌骨比独自BPB集团。 This suggests that BPB can produce synergic effect with BMSSCs. The minipig was chosen as an animal model because of its similarities to humans in terms of platelet count, clotting parameters, metabolic rate, bone structure, and characteristics of their MSCs [32]。一个肺泡缺陷模型为组织工程骨的组织学评估提供了几个优势结构。手术很简单,感染的风险有限,通过嫁接和类似的干预是主张临床。一个真正的批评-大小的下颌minipig模型中的缺陷是超过5毫米33]。最近,msc的协同效应和富含血小板血浆纳入一个脚手架fluorohydroxyapatite在外科骨缺损和骨形成无齿的下颌骨minipigs已经报道的34]。这些结果表明,msc显示出积极的影响骨形成当结合自体生长因子(34]。事实上,血小板生长因子和生物材料的组合与成功用于骨再生(35和软组织扩张36,37]。在目前的研究中,下颌缺陷模型选择确定的潜在能力BPB增强骨形成时辅以BMSSCs。每个minipig担任自己的控制。在我们的研究中,BPB仅是用作测试BMSSC骨支架材料归纳。选择这个特定的生物材料的原因是摄影领域已经被证明是一个合适的载体osteoblast-like细胞,成骨蛋白和生长因子。这个特定的生物材料已经被证明是一个合适的载体纵向脊增强成骨细胞的萎缩后下颌骨(38]。这个生物材料有困难的一致性和可用于阻止osteotomized段的碎片。BPB放置在手术时创建的缺陷,它成为正确集成在新板层骨愈合(39]。这表明该材料是综合分析,作为自然成为新骨形成的支架。生物相容性BPB组织学分析证实了的40]。周围纤维囊形成的粒子不发生在任何部分。在这方面,目前的研究结果与人类组织学观察研究。这些研究表明,一个总是BPB粒子之间建立亲密接触和新形成的骨矿化40]。目前的研究表明,骨再生BMSSCs的卓越贡献是由于成熟(片状)骨的形成。此外,干细胞的贡献是明显的在分析编织骨的百分比。定性histomorphometry还表明,播种的干细胞支架导致更大的骨形成BPB / BMSSCs构造。这是证明的骨组织在外围和中心区域的缺陷。最值得注意的是,观察骨没有炎症过程可能干扰再生的过程(41]。
5。结论
这项研究表明BPB当用作支架诱导骨再生可能受益于增加的BMSSCs组织工程结构。我们的数据显示了治疗模式在minipig模型,但人类应用程序还需要进一步的研究。
缩写
| BMMNC: | 骨髓单核细胞 |
| BMSSC: | 骨髓基质干细胞 |
| BPB: | 猪骨块。 |
附加分
研究突出了。骨髓基质干细胞(BMSSCs)获得6 minipigs。BMSSCs合适的种子,培养在生物材料如猪骨块(BPB)。BPB BMSSCs显示更好的结果在骨再生比单独控制和BPB集团。
的利益冲突
作者声明没有冲突的财务或其他利益发生冲突。
作者的贡献
乔治·森和菲利斯罗伯托·葛拉同样这项工作。
确认
这部分工作由教育部的支持,大学研究(M.I.U.R.), 2009主要协议。20098 m9r_001,罗马,意大利。