CRISPR / Cas9技术对心脏的影响研究:从疾病模型的治疗方法

文摘

基因编辑技术已经成为一种强大的方法,使一代的转基因细胞和有机体必须阐明基因功能和人类疾病的机制。定期聚集空间短回文重复(CRISPR -) 9 (Cas9)系统相关已迅速成为最流行的一种方法用于基因组编辑在基础生物医学研究近年来由于其简单性和适应性。CRISPR / Cas9基因组编辑已被用于正确的DNA突变从单个碱基对都删除在体外和在活的有机体内模型系统。CRISPR / Cas9被用来增加了解心血管疾病的许多方面,包括脂质代谢、电生理和遗传基因。CRISPR / Cas9技术已被证明是有效的在创建基因敲除(KO)或兄弟在人类细胞和特别有用编辑诱导多能干细胞(万能)。尽管有这些进展,一些生物、技术和伦理问题限制基因组编辑在心血管疾病的治疗潜力。本文将专注于各种应用程序CRISPR / Cas9基因组编辑在心血管领域,对于疾病研究的前景在活的有机体内在未来的基因编辑疗法。

1。介绍

的可能性进行基因治疗,纠正在生殖系特定的致病突变,出现了40多年前(1]。在1980年代,增加理解的传导功能的逆转录病毒,科学家们对这些病毒的临床潜力进行了基因治疗的应用。它已经证明了逆转录病毒可能正确的表型细胞病变患者(2- - - - - -4]。然而,使用逆转录病毒面临一些重要的障碍,像他们的不稳定,毒性,不能感染:细胞。由于这些原因,其他病毒和病毒的基因传递工具被开发出来,包括腺相关病毒(AAV)载体、疱疹向量,和脂质体5,6]。第一心血管疾病基因治疗的临床试验是交付的基因编码的血管内皮生长因子(VEGF)外周动脉疾病的患者,但这是不被认为是一个理想的治疗很多病人提出病变不适合基因传递7]。在本世纪头十年,努力专注于开发高效、安全的工具提供基因导入患者细胞。通过与插入诱变和替换,再造工程AAV向量都是安全,耐受性良好开发(8]。最近,基因编辑技术已经成为一个强大的新方法来阐明人类致病变种基因功能和纠正,使转基因细胞和生物体的生产。基因组编辑工具的主要特点是由他们依赖于核酸酶介绍DNA双链断裂(双边带)诱导基因突变通过刺激内源性修复机制(9]。最关键部分在于引入双边带的具体期望的目标站点。这个行动是解决不同的特异性不同的工具,最常用的是锌指核酸酶(ZFNs)转录activator-like效应核酸酶(取得),定期和集群空间短回文重复——(CRISPR)相关9 (Cas9)系统(10,11]。其中,CRISPR / Cas9系统,首先描述了2012年由组Jinek et al。12),带来了相当大的进步。这个系统是足够简单和高效的编辑几乎任何生物的基因和细胞类型13,14),因为它的简单性和适应性,CRISPR / Cas9已迅速成为最流行的一种方法用于基因组编辑(15- - - - - -18]。

的上下文中疾病分子机制和疾病治疗的基本理解,CRISPR / Cas9系统刚刚开始展示它的潜力,出现作为基础研究应用程序的一个强有力的工具,如功能性审讯的新位点和一代的小说动物模型,以及小说临床方法15,17,19- - - - - -21]。目前,临床试验使用CRISPR / Ca9-edited人类细胞正在进行,例如,治疗癌症[22,23]。

心血管疾病仍然是一个主要的健康问题越来越流行(24,25),剩余的挑战是获得更深入的知识背后的机制发展的共同和心血管死亡率和发病率的常见原因。心血管疾病包括几个涉及血管和心脏的医疗条件。这些主要是冠状动脉疾病(CAD)、脑血管疾病(中风),外周动脉疾病(PAD)、心肌病、风湿性心脏病、心律失常、高血压心脏病、先天性心脏病(26]。由于基因检测和生物信息学分析,我们越来越能够识别主题特别容易受到心脏疾病。然而,进一步的研究旨在了解疾病的原因是有限的,主要的隔离和文化人类心肌细胞对心血管研究是极其困难的27]。在这种背景下,世界各地的研究人员投入时间和资源以改善心脏疾病的动物和细胞模型。CRISPR / Cas9技术已经用于生成遗传疾病的小鼠模型,如严重的心肌病,在更短的时间比传统的同源重组技术(28- - - - - -30.]。此外,现在可以注入CRISPR / Cas9细胞胚胎的老鼠,兔子,和灵长类动物用于研究心血管疾病(31日,32]。随着诱导多能干细胞(iPSC)技术,研究人员也能够产生替代细胞模型来研究疾病的分子机制。在这种背景下,CRISPR / Cas9技术提供了一种straightforwarc机制阐明细胞如何作弊通过允许降级的因果变异33- - - - - -35]。最后,在心血管领域,已经在重要的步骤走向治疗应用程序(34,36- - - - - -38]。

目前的审查重点CRISPR的各种应用程序/ Cas9基因组编辑工具在心脏领域,从其应用到人类和动物模型的治疗潜力,描述系统的优点和潜在的缺点。

2。CRISPR / Cas9系统

CRISPR / Cas9技术来源于适应性免疫的细菌酿脓链球菌(12]。的Cas9核酸酶介导anti-phage活动由于其定期结合集群空间短回文重复CRISPR位点。这些位点短,重复序列组成的30 - 40 bp和插入间隔序列匹配病毒基因组(39]。很长一CRISPR位点的转录成RNA随后裂解的CRISPR-associated内切核糖核酸酶(Cas)释放小CRISPR RNA (crRNAs)。这些crRNAs形成Cas-RNA复杂,识别病毒的基因组,继续坚持。

基因组编辑修改的形式,CRISPR / Cas9系统由RNA指导(gRNA)序列目标核酸酶Cas9基因组中一个特定的网站。gRNA由短RNA序列所需的绑定Cas9 + ~ 20核苷酸序列,称为protospacer,它定义了DNA目标要修改(12]。的Cas9核酸酶包含一个HNH-nuclease和RuvC-like核酸酶域。它首先认识到一个名为protospacer-adjacent主题(PAM)的保守序列,侧翼目标DNA (40,41]。Cas9绑定PAM后,海航和RuvC催化域,生成一个钝双链断裂(双边带),可以修复nonhomologous结束加入(NHEJ)或homology-directed修复(HDR)系统(10,12,42]。NHEJ修复主要发生在G1期,而HDR在年代和G2阶段中是最重要的。NHEJ不需要修复模板或广泛的DNA合成和修复双边带的速度比HDR。偶尔,它介绍了小插入或删除(indel)裂解位点。如果indel发生在一个基因的编码序列,它会导致移码突变,这可能导致一个基因敲除43),使其不适合gene-correction目的。相比之下,HDR使用DNA模板,或nonmutant同源染色体,实现高保真修复和可用于引入精确插入突变或重组(44- - - - - -47]。HDR修复双边带的效率相对较低(17相比),少NHEJ在人类细胞增殖48]。HDR的效率可以得到瞬态抑制NHEJ [49,50]。

值得注意的是,存在一个有限数量的PAM网站在真核基因组(12,51)代表一个限制的精确初始基因组编辑应用程序(52]。为了克服这个问题,基因组内的通道网站数量增加由于CRISPR / ca系统的特性在不同的细菌种类不同PAM网站(15,53]。此外,Kleinstiver et al。54已经证明,常用酿脓链球菌Cas9可以修改展示PAM特异性改变,因此识别替代PAM网站整个人类的基因组和生物模型。几项研究利用HDR修复机械介绍精密单点目标基因的突变或兄弟提供一个同源修复模板。NHEJ修复机械优先作为一种介绍插入和/或删除它可以破坏目标轨迹(55,56]。也可以生成大删除或基因重组,倒置或易位等,用一双gRNA-directed Cas9核酸酶(57]。CRISPR / Cas9系统有许多基因编辑以外的其他应用程序,如内源性基因表达的调节。一个nuclease-deficient Cas9,叫做“死Cas9”(dCas9),开发了创建活动融合蛋白能够针对启动子或监管的一个基因序列改变其表达式通过干扰正常转录机械(56,58]。耦合的dCas9转录抑制因子如带锁(CRISPRi)可以减少内生人类基因的转录。这种方法被描述持续减少真核基因表达模型(58]。最近,它已被证实能抑制基因表达也在细菌和人类诱导多能干细胞(59,60]。同样,与转录激活域融合dCas9 VP64或p65 (CRISPRa)可以增加内源性人类基因的表达(61年]。还CRISPRa使多路复用基因激活,使用单一gRNAs (sgRNA)同时针对更多的基因62年]。dCas9也可以融合功能域的DNA甲基化或脱甲基酶,或组蛋白修饰符epigenome-editing [63年,64年]。不同Cas9核酸酶生成修改核酸酶选择性活动或绑定。Cas9D10A,突变CRISPR Nickase,能选择性地削减在目标单链DNA序列。这种double-nicking方法,Cas9D10A创建“粘结束”,确保DNA片段插入到基因组在正确的方向65年,66年]。CRISPR / Cas9系统也用于live-cell标签,耦合dCas9荧光蛋白来可视化特定基因位点(67年]。

3所示。CRISPR / Cas9系统在人类心脏疾病的细胞模型

引入基因组编辑有了基本和转化研究的创新发现的诱导多能干细胞(68年]。

由于他们与胚胎干细胞相似(ESCs) [68年,69年]和事实,他们不是背负的道德关注的,则是目前最合适的模型来研究cardiomyogenesis人类细胞(70年]。进一步的,则是一个几乎无限的人类心肌细胞来源,代表心脏领域的一个宝贵的工具,特别是缺乏人类在体外模型(71年]。鉴于iPSC-derived心肌细胞(iPSC-CMs)显示一个表型仍然远离成人心肌细胞(72年,73年),很多努力已经由科学界能够改善他们的开发协议在体外成熟为了产生更好的心脏病理模型(74年]。到目前为止,使用iPSC-CM一些心脏疾病已经被调查,这已被证明是一个很好的模型继承arrhythmogenic障碍(75年- - - - - -78年]。针对病人已经生成的细胞则从个人家庭受到长qt综合征1型和诱导分化成心脏细胞功能。这些细胞表现出延长动作电位的改变延迟整流钾电流(IK)通道的激活和解除激活儿茶酚胺和异常响应,这是电生理功能的障碍76年]。因此,iPSC-CMs源自一个含有儿茶酚胺的多态室性心动过速(CPVT)病人显示异常电生理特性,包括延迟afterdepolarizations [79年]。此外,iPSC-CMs生成研究单细胞等结构性心脏缺陷的变化与扩张型心肌病(DCM)和肥厚性心肌病(HCM)。太阳等人由万能干细胞生成心肌细胞的DCM患者携带突变基因编码的sarcomeric蛋白质心肌肌钙蛋白T和显示iPSC-CMs概括影响心脏的形态和功能表型,如改变Ca^{2 +}处理、收缩性下降和sarcomeric的异常分布α辅肌动蛋白(80年]。此外,万能的HCM患者一个错义突变MYH7基因表现出杂乱无章的观察,电生理学的违规行为,增加了基因在细胞增殖81年]。

因此明显,平行的基因组编辑和iPSC技术的进步现在提供机会调查直接继承了心脏疾病的病理生理机制在人类细胞模型82年- - - - - -84年]。在这里,CRISPR / Cas9工具允许相对高效和容易代同基因的细胞系的不同只有感兴趣的DNA序列(85年),从而消除其他混杂因素如遗传背景和表观遗传记忆(35,85年]。直到现在,CRISPR / Cas9系统已经被证明是一个有效的和有用的方法来创建基因KO或兄弟在人类细胞(15- - - - - -17),特别是在万能(86年,87年]。此外,这个系统有可能正确的基因突变在iPSC-related疾病模型(88年- - - - - -90年并已经开始应用于研究不同的心脏疾病,如巴斯综合症、x染色体遗传心脏病(91年]。具体地说,小王和同事最近给潜在的一个很好的例子,结合CRISPR / Cas9和iPSC技术提供。他们生成的万能巴斯综合症患者和异常与此相关的线粒体厘米病理特点。通过引入突变tafazzin (小胡子)基因在万能健康的捐赠者通过Cas9-mediated基因组编辑,他们也展示了一种因果关系小胡子基因突变和线粒体表型。重要的是,政府巴斯syndrome-derived iPSC-CMs抗氧化剂mitoTEMPO是有效的抑制线粒体活性氧的生产过剩,导致肌节组织正常化和收缩性91年]。最近,CRISPR / Cas9系统也被用来评估肌小节的致病性基因突变在扩张型心肌病。错义或转移肌小节介绍了突变和收缩的细胞则赤字一直在随后评估iPSC-CM [33]。此外,iPSC-CMs已经生成的两个独立的组患者Jervell和Lange-Nielsen综合症(JLNS),这是一种最严重的心律心律失常92年]。心肌细胞显示JLNS的典型特征,包括动作电位延长和严重减少或缺乏IKs次方(35]。最近,山本等人建立了一个针对疾病的iPSC克隆从个体长QT综合征(LQTS)带着一个杂合的CALM2突变作为一个在体外疾病模型,复制疾病表型。此外,他们切除使用CRISPR / Cas9系统的突变等位基因和救了异常的电生理特性93年]。重要的是,CRISPR / Cas9也可以用来介绍DNA非编码区域的变化。这种方法成功地用于人类细胞则删除序列相邻的intronic单核苷酸多态性PHACTR1密切相关的基因,过早心肌梗死(94年]。

4所示。CRISPR / Cas9在心脏疾病的动物模型

实验诱导特定的突变基因的生物模型把我们目前的了解心脏功能的基础(95年,96年]。然而,传统工具显示重要的限制:化学诱变完全缺乏特异性,而通过同源重组基因打靶是复杂和耗时97年]。在这种背景下,CRISPR / Cas9技术的发展代表了一个强大的突破的一代不同的动物模型心脏疾病调查的目的。

在目前的段落,我们正在评估当前的结果和新方法在三个不同的生物广泛而成功地用于研究心脏疾病:黑腹果蝇斑马鱼(鲐鱼类),和鼠标(亩骶)。

果蝇(黑腹果蝇)已经被用作生物医学研究的模式生物来研究超过一个世纪的广泛生物过程,包括其他人,遗传学,继承和发展98年]。飞过脊椎动物模型的成功主要依赖于他们很便宜,寿命短,生产大量的胚胎。虽然果蝇心脏是一个线性管,因此不同于哺乳动物的心脏的4室,它让人想起脊椎动物心脏管和展品的进化元素相关心脏发育和功能(99年]。最近,一个RNAi-based筛查已成功进行的果蝇识别关键路径心血管体内平衡,导致CCR4-Not复杂的识别作为一种重要的新玩家在心脏功能,证实在小鼠和人类One hundred.]。因此,在果蝇基因组屏幕展示了他们潜在的识别守恒的候选基因参与心脏功能。然而,经典的RNAi屏幕受到重要的缺点,即(i) RNAi成功只有当目标是积极转录(101年),(2)它常常会导致部分蛋白质消耗(102年),(3)允许的功能评价编码区,因此排除监管的审讯和基因间的元素(103年]。在这种背景下,CRISPR / Cas9技术代表实质性改进对所有上述传统方法的局限性。值得注意的是,CRISPR / Cas9-mediated诱变已成功报道果蝇(104年- - - - - -106年]。最近,港口和他的同事们(107年)实现biallelic目标选择基因的体细胞,展示的可行性限制CRISPR / Cas9-mediated诱变在时间和空间,从而为未来的高通量基因筛查铺平了道路果蝇的心。

斑马鱼已经获得了越来越广泛的普及,心脏模型开发和疾病主要是因为其相对易用性基因分析相比,老鼠。进一步说,由于这一事实需要活性氧交付开发的第一个星期期间非常有限(108年),使用斑马鱼模型允许调查心血管缺陷导致其他生物胚胎死亡。有趣的是,斑马鱼的心脏表现出强大的再生潜能,缺乏其他脊椎动物,如啮齿动物(109年,110年]。这方面已经成倍地增加了对斑马鱼模型,目的是了解心肌细胞再生的分子基础可能最终应用于人类。虽然只由两院组成,斑马鱼的心脏具有电气特性,类似于人类的心脏。例如,它显示了一个起搏器,窦房结上地区(111年)和心室心肌细胞表现出动作电位特征类似于人类心脏的(112年,113年]。不仅创建了斑马鱼模型探讨分子心脏发展的决定因素(114年),但也获得更深的见解心脏疾病,如遗传性心肌病(115年]。值得注意,可拆卸的模型生成的标准吗啉代法显示差异相比,基于基因编辑方式(116年]。这个观察再次强调的重要性进行gene-deficiency研究使用基因组编辑,而不是基于RNA的工具(117年]。直到现在,一些基于CRISPR / Cas9系统已报告在斑马鱼基因组编辑(118年,119年]。最近,群Ablain et al。120年)报告了一个工具来生成组织基因敲除,将指导RNA和Cas9信使RNA注入细胞阶段的胚胎。正如前面描述的果蝇,这将打开的可能性来控制特定的基因只在心肌细胞的破坏。这极大地提高了潜在的功能丧失在斑马鱼屏幕,可在不久的将来不仅在胚胎心脏表型特征,而且造型成人心脏疾病(121年]。

直接适用的胚胎,CRISPR / Cas9系统鼠标工程已经成为最受欢迎的工具。老方法所需的同源重组的诱导小鼠胚胎干细胞,通过抗生素耐药性变异的ESCs的选择,抗生素盒式的切除,ESCs的注入到老鼠囊胚接受者(28]。相反,CRISPR / Cas9-based技术允许代变异老鼠只在一个步骤中,组成的coinjection Cas9受精卵的信使rna, DNA不同sgRNA,捐助者(29日]。使用这种方法,金子和其他人已经表明,受基因敲除小鼠模型的改善心脏功能引起的心力衰竭隐钙素超表达(122年]。此外,已经证明CRISPR / Cas9基因组编辑应用于小鼠受精卵可以正确杜氏肌dystrophy-causing突变,恢复肌营养不良蛋白表达不仅在骨骼肌也在mdx小鼠的心脏组织123年]。

CRISPR / Cas9系统进一步显示其巨大的潜力时,表明它可以正确的遗传缺陷在产后/成年老鼠[124年]。丁等人利用CRISPR / Cas9系统编辑基因体细胞在活的有机体内。他们扰乱了proprotein转化酶枯草杆菌蛋白酶/可馨类型9 (PCSK9)基因,从而降低血液中胆固醇的水平,降低患冠心病(CHD)的风险由于较高的低密度脂蛋白胆固醇水平13]。本研究证明了的治疗潜力CRISPR / Cas9工具预防冠心病。值得注意的是,其中一个主要问题与CRISPR / Cas9系统相关的分子大小CRISPR / Cas9组件,它们不会轻易地打包成腺相关病毒(AAV)在活的有机体内交货(36]。为了克服这个限制,不同的策略已经被使用,就像一个对偶向量方法,允许更好的控制管理的核酸酶与目标元素组件之间的比率(125年]。此外,转基因小鼠表达Cas9只有在心肌细胞产生的卡罗尔et al。30.]。作为一个概念证明,研究人员报道,消融对Myh6 Myh6由sgRNA的交付通过AAV导致小鼠受损的心脏性能和明显的肥大。这描述了一个优雅的工作效率和相对容易cardioediting工具探索心脏功能和/或发展的具体作用的基因的表达并不局限于心脏。

为了完整性,同样重要的是要注意,CRISPR / Cas9系统已经成功用于目标其他哺乳动物如老鼠的胚胎32和猴子31日]。有趣的是,妞妞和他的同事们证明了可行性专门针对多个基因组网站一步诱变的方法应用到一个细胞猴子胚胎(31日]。它也认识到,鼠标,虽然大多数哺乳动物用于基因研究,提出了一些局限性当用来模拟人体电生理紊乱126年),血脂异常(127年),和心肌梗死128年]。CRISPR / Cas9相对简单的技术和概念验证它的可行性在范围广泛的生物15- - - - - -17,104年,105年,129年,130年)所以现在丰富科学界与要使用的可能性在活的有机体内模型更具有代表性的人类心脏生理如兔子和猴子。

总之,CRISPR / Cas9技术似乎是最有效的工具之一的基因组编辑广泛的动物模型,在一个细胞的胚胎阶段和产后的生活。连续演化的生物信息学工具改进的设计指导rna (131年),以及实验条件的不断优化,使建立的非常一致的协议是完全可靠的代淘汰赛和兄弟点突变有助于心脏疾病建模、心脏基因编辑和勘探的潜在基因治疗(132年,133年]。

5。的治疗潜力CRISPR / Cas9系统

近年来,主要是由于新一代测序方法(134年),我们见证了一个常数增加人类遗传信息不仅单基因,而且复杂疾病(135年]。这些进步,再加上越来越多的证据表明疾病易感性的常见变异的作用[136年,137年),使基因编辑策略的搜索应用复杂的疾病的治疗,包括心血管疾病。

理论上,CRISPR / Cas9系统不仅可用于治疗纠正致病突变,还引入保护突变和针对病毒基因组138年]。

最近,Limpitikul等人设法纠正突变钙调蛋白2 (CALM2iPSC-CM)基因,导致功能拯救长QT syndrome-triggered心脏事件(139年]。LQTS-associated calmodulinopathies是由于基因突变发生在3钙调蛋白的基因,CALM1,CALM2,CALM3。在这部作品中,渊源者受到恶性calmodulinopathic长QT综合征存在只有1 6冗余calmodulin-encoding等位基因的突变。在这里,作者用CRISPR干扰(CRISPRi)策略选择正确的突变等位基因。CRISPRi技术使用dCas9蛋白在转录水平调节基因的表达。dCas9-sgRNA复杂绑定到目标基因的启动子或编码序列,它阻碍了RNA聚合酶的活性,阻止转录起始或伸长140年]。成功地抑制突变等位基因,作者成功地演示了一种方法,在原则不仅适用于其他calmodulinipathies,如含有儿茶酚胺的多态室性心动过速,还要各种各样的心脏和非心脏疾病的特征的冗余基因的影响。

重要的是要注意,虽然有吸引力的策略,基因编辑方法治疗的效果依赖于开发成功的交付策略CRISPR / Cas9系统的病人。这个可以体外实现,使用一个“病人”战略通过修改自体的细胞,然后移植回病人,或在活的有机体内CRISPR / Cas9系统,通过直接注入到患者(数字1(一)和1 (b))。

(一)

(b)

图1

治疗方法通过基因组编辑。有两种可能的方法在心血管疾病基因组编辑。(a)体细胞可以从病人和孤立的“诱导多能性”细胞重新编程。特定的细胞则可以修改体外,编辑它们可以分化和移植后回病人。(b)基因突变可以直接编辑在活的有机体内,提供复杂的CRISPR / Cas9系统发布工具网站所需的基因在特定的组织。

在第一种情况下,从病人的细胞则可以编辑校正的特定突变或可以抵御疾病。编辑万能干细胞可以分化成所需的细胞类型(如心肌细胞)移植回病人。然而,这种方法似乎是有限的有效嫁接后回注系统细胞。不幸的是,干细胞归巢的效率并移植到受损的心脏著称的极低(141年,142年];因此,它仍然是一个重大的挑战在体外的可能性编辑自体iPSC-derived心肌细胞。不靠谱的是,庄等人最近从胚胎干细胞生成心肌细胞能够成功地嫁接和修复受伤的心肌在灵长类动物模型的心肌梗死143年]。然而,特别是在遗传性疾病的情况下,纠正细胞的数量可能仍然过低与宿主组织的体积相比。因此,在活的有机体内治疗心血管领域基因组编辑必须处理不同的障碍144年,145年]。更成熟的改进iPSC-CMs以及瀑样或三维结构的生成将必须充分意识到这种技术的效用。

因此似乎合理,心脏疾病,遗传在活的有机体内编辑方法涉及核酸酶的直接喷射系统可能是一个更好的方法。事实上,在活的有机体内交付CRISPR / Cas9工具可以被视为一个角度校正的突变遗传的心脏疾病,如长QT综合征(146年]。类似的方法已被用于正确CRYGC基因的显性突变导致白内障在鼠标147年]。

的一个例子在活的有机体内破坏的基因治疗提供的方法是针对使用CRISPR / Cas9 PCSK9基因的“人性化”小鼠模型,降低胆固醇水平,因此心肌梗塞的风险(148年]。CRISPR / Cas9编辑也被成功地用于治疗酪氨酸血症和预防心血管疾病在活的有机体内成年小鼠(149年]。

正如我们所见,CRISPR / Cas9被用来纠正致病基因突变大删除从一个碱基对。纠正大的改变的功能蛋白质,可以使用多路复用CRISPR / Cas9附近有两个gRNAs DNA突变要删除和恢复功能的蛋白质。这个过程一直尝试治疗杜氏肌萎缩症(150年]。

最后的话,应该注意的是,CRISPR / CAS9系统会导致多个组织的目标,它可以被视为一个巨大潜力的情况下针对多个器官的疾病,反之作为一个伟大的限制对特定组织选择性取向时想要的但难以实现。事实上,大多数的在活的有机体内通过装甲防护研究提供CRISPR-Cas9组件,但组织取向的装甲防护仅限于几个器官(151年]。

6。CRISPR / Cas9系统的优点和缺点

在前面的章节中概述和总结表1CRISPR / Cas9系统比其他现有技术有很多优势。Cas9酶是由一个指南引导到一个特定的DNA序列RNA (gRNA),可以很容易地克隆。相比之下,ZFNs和取得设计融合蛋白的dna结合蛋白序列和霍英东我核酸酶劈理域。因为霍英东我域需要二聚活跃,两个基因组编辑实验所需蛋白质,比单gRNA CRISPR / Cas9系统(152年,153年]。使用多个gRNAs,可以针对多个基因位点同时引入多个基因突变(15,17,154年]。CRISPR / Cas9已经证明是有效的为编辑不同的人类细胞(15- - - - - -17]。此外,CRISPR / Cas9屏幕可用于DNA非编码区域识别监管元素来了解基因变异与人类疾病(155年,156年]。例如,使用CRISPRi方法,Fulco等人确定远端增强剂及其9个目标基因(155年]。CRISPR / Cas9也被用于介绍DNA非编码区域的变化,intronic snp之间建立联系PHACTR1在轨迹和转录功能(94年]。


优势	缺点

目标设计简单	有限数量的PAM序列
多路复用目标识别	外部的影响
编辑效率不同的人类细胞	镶嵌性
筛选DNA非编码区域	复等位基因
一个€‰	伦理问题

尽管已经取得了巨大的进步,我们的基因组编辑功能由于CRISPR / Cas9创新,一些问题仍然(表1)。基因组编辑在心血管疾病的治疗潜力仍受制于生物和技术问题,这只是开始。CRISPR / Cas9的主要限制是PAM序列的需要和链接目标核酸酶。两种方法解决这个问题包括扩大使用PAM序列序列的数量从各种细菌和PAM序列特异性的修改链球菌Cas9 [15,54,65年]。

另一个主要关心的应用CRISPR / Cas9系统对动物胚胎诱变与被描述的脱靶效应在人类细胞的高频率。脱靶效应的特异性的活动的结果是中科院基因组的核酸酶在不属预定目标的位置,由于不正确的绑定的sgRNA157年]。不同组织评估不相干的事件的频率预测脱靶的位置(65年,158年]。在一项研究中,编辑CCR5和HBB基因,一些结构生成的突变率58%非目标但相关CCR2和HBD DNA序列CRISPR / Cas9转染细胞(159年]。然而,不相干的事件已经证明不同在不同的细胞类型(160年]。事实上,其他研究证明人类万能,这个系统提供高效高特异性的基因编辑工具(161年- - - - - -163年]。进一步,对整个生物体的研究显示低非目标频率相比以往的研究癌症细胞系。这些研究在老鼠和猴子身上发现任何突变预测脱靶网站使用CRISPR / Cas9当生成基因编辑应用于受精卵(29日,31日]。一些团体试图减少非目标效应修改Cas9的结合位点。破坏一些Cas9的结合位点,他们能够将DNA目标,导致低或没有不相干的绑定(54]。另一个尝试减少非目标效应是配对使用的报道Cas9 nickas Cas9孤独,而是大大减少非目标乳沟,50 - 1000倍(65年]。尽管不相干的事件可能是稀缺的,他们不应该被低估,因为其他基因突变与潜在的破坏性后果。特别是,它是重要的临床使用genome-edited细胞或组织完全避免非目标效应的发生。

另一个问题是基因编辑效率的变化在不同的组织,特别是在活的有机体内。CRISPR / Cas9效率似乎在骨骼肌肉和心脏肌肉鼠标低于肝(150年]。即使在心脏Cas9转基因老鼠,编辑的效率很低在心肌细胞(30.]。

CRISPR / Cas9系统的进一步担忧其有关编辑效率:sgRNAs诱导Cas9-mediated双边带所需的目标站点。双边带刺激通过HDR DNA修复。然而,另一种DNA修复机制NHEJ可以发生在较低的频率,引入不可预测的事件的小插入和删除(47]。治疗旨在促进HDR已经开发,以提高编辑效率(47]。

也有实践和相关的伦理问题的应用设计和交付的细胞则回到病人。在实践中,一个高效和安全的交付CRISPR / Cas9很难使转染到细胞或组织和/或感染的影响引入到一个不同的遗传背景需要仔细评估(164年]。基因改造引入胚胎或中可以传递给后代。直到现在,所有治疗干预人类使用在体细胞基因组编辑已经完成165年,166年),这是伦理上接受,考虑风险和收益之间的平衡和知情同意的使用。在人类基因组编辑不能存活的胚胎被用来尝试修改基因负责β由中国集团地中海贫血。HDR的效率很低,编辑胚胎是马赛克。此外,不相干的乳沟也呈现(167年]。CRISPR-Cas9系统也用于编辑CCR5轨迹在人类胚胎(与艾滋病毒相关的阻力)。即使在包含工程CCR5基因的胚胎成功,是不可能控制其他在同一位点等位基因和他们保持野生型或包含(del突变(164年]。此外,马等人利用CRISPR / Cas9系统正确的杂合的突变MYBPC3基因,在人类胚胎会导致肥厚性心肌病,专门创建的精子捐赠者携带突变(168年]。在这项研究中,他们观察到大量的胚胎携带野生型基因没有不相干的事件的证据。最近,CRISPR / Cas9基因编辑系统已被用于研究多能性转录因子的功能OCT4在人类胚胎发生。在这项研究中,他们专门针对OCT4基因编码(POU5F1)在人类二倍体受精卵,发现胚泡发育受损,表明OCT4有一个重要的角色在人类囊胚的进展169年]。

2015年,美国国家卫生研究所(NIH)禁止NIH研究人类胚胎基因组编辑由于严重的无法量化的安全问题,道德问题相关生殖细胞系的变更,这可能影响后代没有他们的同意,而缺乏明确的医学应用证明CRISPR / Cas9胚胎的使用。然而,2015年6月,瑞典集团获得批准使用CRISPR技术禁用基因在人类胚胎研究胚胎发育,并在2016年2月,英国议会批准了转基因人类胚胎的使用CRISPR / Cas9和相关技术(170年]。

7所示。结论

如今,基因组编辑已成为一个强大的工具,修改细胞系和生物研究生物学和各种遗传疾病的病理生理机制。基因组编辑工具最近也开始被使用在心血管领域产生新的细胞和心血管疾病的动物模型。基因组编辑的治疗潜力仍然是生物和技术壁垒所阻碍。所代表的另一个重要的问题是道德关注CRISPR技术的使用在人类身上。在基因组编辑领域的进步会让我们增加的开发和发病机制的理解障碍,以及尝试治疗心血管疾病。

信息披露

资金没有参与决定发布或准备的手稿。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持的创新和研究部门和大学的自治省份博尔扎诺。感谢作者的创新和研究部门和大学自治省博岑/博尔扎诺覆盖开放获取出版成本。

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