文摘

质量评价的间充质干细胞(msc)基于功效会有利于他们的临床应用。在这项研究中,我们旨在找到人类骨髓msc的因素与软骨修复。体液因素的表达谱,信使rna (mrna),和小分子核糖核酸(microrna)分析了在人类骨髓msc从五个不同的捐赠者。我们研究了这些表达谱的相关性与msc的增殖能力,chondrogenic分化,和软骨修复体内。mRNA的表达MYBL1呈正相关,增殖和软骨分化。相比之下,mRNA的表达RCAN2和TIMP-1和VEGF蛋白表达与增殖和软骨分化负相关。然而,从所有五个捐助者msc有能力促进软骨修复体内不管他们的增殖和软骨分化的能力。mRNA的表达HLA-DRB1呈正相关,软骨修复体内。与此同时,mRNA的表达TMEM155和表达mir - 486 - 3 - p, mir - 148 b, mir - 93, mir - 320 b与软骨修复负相关。表达式的分析,这些因素可能有助于预测骨髓msc的能力,促进软骨修复。

1。介绍

间充质干细胞(msc)有自我更新的能力1和分化成几个mesoderm-type血统,包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、细胞和血管细胞(2),被认为是nonimmunogenic [3,4]。因此,msc是最有前途的一个细胞来源的干细胞,可以不使用任何免疫抑制药物研究,对于研究和临床用途。临床研究使用msc随处可见。例如,msc被用于疾病的治疗,如延长软骨(5,6)和骨性缺陷(7],椎间盘[8),急性心肌梗塞9)、白血病(10),和糖尿病(11]。我们已经开始两个临床试验腔内注射自体骨髓msc基于我们之前的关节软骨修复动物实验(5,12,13]。然而,msc对软骨再生的功能质量可能多样化根据捐赠者的异质性msc。有报道称,分化和增殖能力随着年龄增长而减少14,15),因此,使用自体msc对组织修复,在一些迹象老年病人的担忧,有一定的限制(16]。质量评价确认msc已经建立的属性,以及基于细胞表面标记(CD19 - CD14或CD11b, CD34, CD45, CD79α,HLA-DR CD73阳性,CD90 CD105, CD166和CD44 (17- - - - - -19])和分化能力(20.- - - - - -22]。然而,质量评价基于msc的功效已经不成立。MSC基于质量的评估标准的实际应用所需的功效将MSC移植。在这项研究中,我们旨在设计一个功能质量评估方法的msc软骨再生通过检查以下数据之间的关系在人类骨髓msc (hMSCs):软骨的合成代谢和分解代谢的因素,信使核糖核酸(mrna),和小分子核糖核酸(microrna)和细胞增殖的能力,chondrogenic分化在活的有机体内,和软骨再生在活的有机体内。

2。材料和方法

所有程序都是通过动物实验和执行的指南,广岛大学、研究机构和委员会实验动物科学、生物医学科学研究生院,广岛大学。

在这项研究中,hMSCs买来Lonza Walkersville Inc . (pt - 2501, Walkersville医学博士,美国)。所有这些hMSCs通过了质量检查由Lonza公司使用细胞生存能力(超过75%),脂肪形成的和成骨分化(油红O染色和钙沉积染色),和流式细胞仪分析细胞表面标记(90%以上是积极为CD29、CD44、CD105,和CD14 CD166和消极,CD34、CD45)。化验(GR)和集落形成细胞增长率(CF),颗粒的文化在体外,移植hMSCs成软骨缺损模型在活的有机体内进行使用hMSCs从五个不同的捐赠者。年龄、种族和性别的五个不同的捐赠者如下:22岁的黑人男子,20岁的白人男子,39岁的黑人,29岁的白人妇女,41岁的白人妇女。

2.1。文化hMSCs和人类皮肤成纤维细胞

hMSCs在通道两个离心机在500 为5分钟。细胞在培养基resuspended由杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM;美国生活技术,卡尔斯巴德,CA), 15%胎牛血清(的边后卫;SAFC生物科学公司,欧文、钙、美国),20更易/毫升的4 - (2-hydroxyethyl) 1-piperazineethanesulfonic酸(技术),50μg / ml庆大霉素(Gentacin®、默沙东、东京、日本),和0.25μg / ml两性霉素(Fungizon®,百时美施贵宝,纽约,纽约,美国)。暂停然后镀成文化菜肴。菜孵化在相对湿度95%,公司5%的氛围2confluency在37°C到70 - 80%,然后细胞收获与胰蛋白酶(TrypLE™表达;美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)。后添加high-glucose DMEM®的边后卫10%和1%的抗生素,这些细胞被中和,离心收获的200年 5分钟,得到的上层清液冻结在−80°C Cellbanker®1 (LSI Medience、东京、日本),直到进一步的测试。这些细胞被定义为通过三(P3)。在P3 hMSCs受移植者在high-glucose DMEM和10%的边后卫和hMSCs抗生素增长1%。这些附着的细胞被称为hMSCs通道4 (P4)。在P4 hMSCs被用于当前的研究。成人正常的人类皮肤成纤维细胞(hFBs;Lonza日本,日本东京)P2与成纤维细胞培养的细胞生长Medium-2 BulletKit(女性生殖器切割™2 BulletKit™;Lonza日本,日本东京),直到P4通过类似的方法和所使用的细胞在P4。

2.2。测定hMSCs的增长率

在P4 hMSCs被播种到文化菜5.0×103细胞/厘米2间充质干细胞基础培养基(MSCBM™;Lonza日本,东京、日本)和孵化的氛围中95%的相对湿度和5%的有限公司2在37°C。细胞分裂率评估后5天。

2.3。克隆形成实验

在初步研究中,我们证实了正相关( , )之间hMSC播种密度和CF的能力。因为CF测量不反映播种密度、CF的能力没有分泌腺的影响因素,可以测量细胞CF测量的质量。的hMSCs镀在P4 1.5×103细胞/ T75瓶血压得到较好的控制MSCBM (Lonza日本)为14天。媒介是改变每隔三到四天。在石蜡嵌入板后,这些细胞被染色1.0%结晶紫溶液(Wako,大阪,日本)10分钟。聚集的细胞分化50多个细胞被算作一个殖民地,我们计算这些殖民地在所有种子细胞的比例。

2.4。分析的蛋白质来自上层的文化

msc在70 - 80% confluency ref媒体与文化。48小时孵化后,媒体收集。移除碎片,媒体在600年离心机 5分钟和上层清液收集MSC-conditioned媒体(MSC-CMs)。他们储存在−80°C,直到他们被用于以下分析。

分析了MSC-CMs通过酶联免疫吸附试验(ELISA)。夹心ELISA试剂盒购自研发系统(明尼阿波利斯,美国)被用于骨形成蛋白(BMP) 2, BMP-7,纤维母细胞生长因子(FGF) 2,胰岛素样生长因子- 1 (IGF),转化生长因子- (TGF)αTGF -β1、TGF -β2的金属蛋白酶组织抑制剂- 1 (TIMP), TIMP-2,血小板源生长因子(PDGF)——AA,白介素- 2 (IL), IL-17,单核细胞趋化蛋白- 1 (MCP),基质金属蛋白酶- 1 (MMP), MMP-3, MMP-9, MMP-13,咆哮,基质细胞衍生因子(SDF) 1α巨噬细胞炎性蛋白- 1 (MIP)α,MIP-1β,MIP-3α。包从生活技术(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)被用于肝细胞生长因子(HGF), il - 1βil - 10、il - 4、引发,TNF -α,干扰素(IFN)γ和血管内皮生长因子(VEGF)。化验按照制造商的指示进行复制。作为一个控制、文化媒体也进行了分析。在P4 hFBs与细菌培养同时hMSCs作为控制。

2.5。评估使用颗粒文化hMSCs Chondrogenic分化

hMSCs chondrogenic分化能力的使用颗粒从每个捐赠者评估文化。

用颗粒为软骨形成文化系统(23- - - - - -26]。约2.5×105hMSCs在P4被放置在一个15毫升polyethyleneterephthalate管(住友电木)和离心机,享年450岁 10分钟。颗粒是培养在37°C公司为5%2500年μl chondrogenic介质包含500 ng / ml BMP-6(27)(研发系统,明尼阿波利斯,美国除了high-glucose DMEM补充10 ng / ml TGF -β3(研发系统,明尼阿波利斯,美国),10−750 M地塞米松,μ40 g / ml ascorbate-2-phosphate,μ100年g / ml脯氨酸μg / ml丙酮酸(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),和50毫克/毫升+预混料(正欲;6.25μ6.25 g / ml胰岛素μg / ml转铁蛋白,6.25 ng / ml亚硒酸,1.25毫克/毫升BSA和5.35毫克/毫升亚油酸)。每3到4天中取代了21天。显微镜,球被嵌入在石蜡,切成5μ米部分,沾0.05%甲苯胺蓝的解决方案(Muto纯化学品有限公司,东京,日本)。细胞外基质的生产是通过测量评估的异染色颗粒比例(PMP)源自hMSCs与甲苯胺蓝染色图像处理软件(WinROOF®, Mitani,东京,日本)。我们计算所有地区的PMP丸。

2.6。实时定量聚合酶链反应(qPCR)的颗粒

总RNA分离颗粒使用试剂盒RNeasy微工具包(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA)。核糖核酸的互补脱氧核糖核酸合成使用超级脚本很掌握混合(技术)。得到控制,总RNA从正常膝关节软骨切割只是成熟尸体的捐助者(美国关节工程,诺斯布鲁克,IL)。qPCR进行混合使用电力SYBR绿色主人(技术)。互补脱氧核糖核酸样本分析胶原蛋白II型(坳二世)和参考基因(glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH))。化验进行根据制造商的指示。实验使用的引物序列如表所示1。的数量坳二世信使rna表达的规范化GAPDH表达式。此外,大量的mRNA表达hMSCs从捐助者(hMSC-1 hMSC-5)规范化在hMSC-1表达式比较五个捐助者之间的信使rna表达的目的。

表1
引物序列用于qPCR。
2.7。评估使用软骨修复软骨再生的能力

在这项研究中,男性裸体小鼠年龄在9到10周被使用和麻醉的腹腔内政府1.0毫升/公斤戊巴比妥钠在手术之前。内侧parapatellar方法被用来使膝关节。我们创建了完整的关节软骨缺损直径2毫米的厚度和深度1毫米膝沟的股骨远端使用电钻,和关节囊和皮肤切口关闭6 - 0尼龙缝线。老鼠被分为两组。在对照组,磷酸盐(PBS, 25岁μl)注入5关节( )。这一组表示的自然愈合过程中骨软骨缺损。hMSC组,3×105hMSCs从五个捐助者注入每一个是联合运营的( )。移植后,所有裸体老鼠在笼子里被允许自由移动。

2.8。组织学评价

牺牲了所有裸体小鼠腹腔内注射致命剂量的戊巴比妥钠注射后12周。膝沟切除和固定在4%多聚甲醛24 h。然后标本和0.5乙二胺四乙酸脱钙。之后,嵌在石蜡标本切成5块μ米部分连续沿矢状面,包括缺陷的中心。组织学评估,这些部分是沾Safranin-O /快速绿色。标本被分级半定量的。评分范围是基于一个软骨再生如前所述组织学评分量表(27]。

2.9。3 d-gene®人类益生元芯片25 k mRNA和TaqMan®低密度阵列microrna的表达分析

hMSCs和hFBs P4上均质板使用试剂盒试剂(技术)和总rna分离根据制造商的指示。信使核糖核酸微阵列分析3 d-gene人类益生元芯片25 k (3 d-gene;东丽工业,日本东京)使用(24460不同的基因)。hFBs在P4的基因表达是用作控制规范化。实验程序TaqMan低密度阵列分析(TLDA®;生命技术)进行了使用TaqMan人类微阵列卡®(卡v2.0和卡B v3.0)根据制造商的指示来识别差异表达microRNA hMSCs每个捐赠者。

2.10。统计分析

所有分析都是一式三份。结果显示为平均值和标准偏差。皮尔森相关系数计算使用软件的统计程序供Statcel4 Windows®Excel统计(Bunkyo-ku Statcel4:星云公司,东京,日本)被用来评估细胞增殖能力之间的关联,chondrogenic分化,和软骨再生,和表达模式的蛋白质,hMSCs mrna, microrna。多重比较进行标本的组织学评估分数之间的裸大鼠膝关节每组使用Bartlett的测试和单向方差分析。当一个重要的 价值被发现,Tukey-Kramer方法用于识别组之间的显著差异。显著性水平是定义 所有的测试。

3所示。结果

3.1。增长率和集落形成

hMSCs从五种不同的捐赠者排名hMSC-1 hMSC-5 GR的顺序,和hMSC-1 hMSC-5来自一名22岁的黑人男子,20岁的白人男子,39岁的黑人,29岁的白人妇女和41岁的白人女性。GR和克隆形成效率(CFE) hMSC-1 hMSC-5和hFBs 0.52倍/天,9.6%,和2.6%的0.35倍/天,0.32倍/天,2.0%,和1.7%的0.30倍/天,0.16倍/天和0.3%,分别为0.0%和0.73倍/天。与GR (CFE显示正相关 , )(图1(一))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
图1
(一)《和GR之间的相关性,(b) CFE, PMP, (c) GR和PMP (d) CFE COLII, (e) GR和COLII, PMP和COLII (f) 和 , 和 , 和 , 和 , 和 , 和 ,分别。
3.2。浮在表面的蛋白质来源于文化

评价蛋白质分泌msc与软骨修复,antianabolic和软骨在文化上层清液的分解代谢的因素选择评估。蛋白表达的评估使用ELISA,合成代谢因素TIMP-1 TIMP-2 TGF -β1、TGF -β2 PDGF-AA HGF, igf - 1和白细胞介素6的分解代谢的因素,IL8, SDF-1a, MMP13, VEGF, MCP-1, MMP1、MMP-3每个捐赠者的文化上层清液中发现(表2)。另一方面,我们不能验证BMP-2蛋白表达,BMP-7, il - 4、il - 10, FGF-2,干扰素γ摘要意思,βIL2 IL17, MMP9,咆哮,TNFα,MIP1α,MIP1β,MIP3α,TGFα。31日的15个因素可以用ELISA检测。

表2
每10000 hMSCs Secretional能力的蛋白质(pg / 10000 hMSCs)。
3.3。比例的异染色颗粒

PMP hMSC-1 hMSC-5分别为69.3%,46.16%,32.8%,12.4%,和0.0%,分别为(图2)。细胞外基质的生产能力,展示chondrogenic分化,GR呈正相关,与CFE (GR): , ;CFE: , )(数据1 (b)和1 (c))。


图2
百分比的异染色颗粒hMSC-1 hMSC-5分别为69.3%,46.16%,32.8%,12.4%,和0.0%,分别。酒吧,500μm。
3.4。实时PCR检测颗粒

COLII基因表达式hMSC-1 hMSC-5分别为1.00,1.08,0.80,0.63,和0.00,分别。基因表达的坳二世显示与CFE相关趋势( , 与GR()和相关 , )和PMP ( , )(数据1 (d),1 (e),1 (f))。这些发现表明,chondrogenic hMSCs能力和扩散能力呈正相关。

3.5。组织学评价软骨修复

在对照组,不沾Safranin-O软骨缺损区域。控制样品的意思是组织学得分12.40±1.52 (SD)点。在hMSC-1 hMSC-2 hMSC-5,软骨缺损区与Safranin-O部分染色。然而,在hMSC-3 hMSC-4,缺陷的边缘不规则,修复软骨纤维组织组成。hMSC-1 hMSC-5组,组织学得分均值为4.4±4.51 (SD), 4.6±3.13 (SD), 6.0±1.22 (SD), 6.2±3.90 (SD),分别和3.2±2.28 (SD)、(图3)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
(a)组织学发现Safranin-O /快速绿色染色在12周后注射hMSCs成软骨缺损模型。酒吧,500μm。(b)的评估五个不同的捐赠者使用Wakitani的尺度( , )。
3.6。基因表达的hMSCs评估3 d-gene人类益生元芯片25 k和TaqMan低密度数组

24460年3 d-gene mRNA分析,我们发现mRNA的表达MYBL1(MYB原癌基因(如1)RCAN2(钙调磷酸酶2)监管机构相关的增殖能力在体外和HLA-DRB1(主要组织相容性复合体II级、β1)博士TMEM155(跨膜蛋白155)与软骨修复在活的有机体内(表3)。TLDA 768 microrna的分析,我们发现mir - 486 - 3 - p, mir - 148 b, mir - 93, mir - 320 b在软骨修复在活的有机体内(表4)。从每个捐赠者hMSCs的基因表达是评估褶皱变化与基因表达在hFBs控制规范化。的评估并不在hFBs发现的基因,基因表达在hMSCs最低的是用作控制规范化。

表3
变化在hMSCs mRNA的表达。
表4
在hMSCs microrna的表达的变化。
3.7。体外的关系

五个捐助者的hMSCs分为两组hMSC-1 hMSC-3和hMSC-4 hMSC-5根据chondrogenic分化的结果。甲苯胺蓝染色和rt - pcr检测hMSCs的小球,hMSC-1 hMSC-3显示丰富,而hMSC-4 hMSC-5显示,贫穷,细胞外基质的生产。此外,hMSC-1 hMSC-3显示良好的能力,而那些hMSC-4和hMSC-5显示能力差,细胞增殖。mrna和microrna可分为两组hMSC-1 hMSC-3和hMSC-4 hMSC-5根据他们的结果在chondrogenic分化选择和评估的相关性与chondrogenic分化。

评估的mrna和microrna的表达MYBL1是高的吗RCAN2低hMSCs从三个捐助者有良好的细胞增殖和细胞外基质的生产比hMSCs从其他两个捐助者。此外,TIMP-1和VEGF蛋白表达水平是负相关细胞增殖和细胞外基质(表的生产5)。

表5
相关分析的具体因素在体外。
3.8。体内的关系

五个捐助者的hMSCs hMSC-1分为两组,hMSC-2, hMSC-5 hMSC-3 hMSC-4根据他们的结果在评价软骨再生使用Wakitani的尺度。mrna和microrna hMSC-1可以分为两组,hMSC-2, hMSC-5 hMSC-3 hMSC-4根据他们的结果在软骨再生选择和评估的相关性与软骨再生。

的表达式MYBL1,RCAN2、TIMP-1和VEGF显示相关性与细胞增殖和chondrogenic分化与软骨修复没有相关性在活的有机体内。另一方面,的表达HLA-DRB1是高的吗TMEM155,mir - 486 - 3 - p, mir - 148 b, mir - 93, mir - 320 b的三个捐助者的低hMSCs显示良好的软骨修复在活的有机体内比hMSCs从另外两个捐助者(表6)。然而,蛋白表达水平的合成代谢和分解代谢的因素对软骨和软骨修复没有联系在活的有机体内。

表6
相关分析的具体因素在活的有机体内。

最后,之间没有相关的细胞增殖和细胞外基质的生产在体外和软骨修复在活的有机体内。

4所示。讨论

本研究表明,mRNA的表达MYBL1呈正相关,增殖和软骨分化hMSCs和mRNA的表达吗RCAN2和蛋白质TIMP-1和VEGF的表达与msc的增殖和软骨分化负相关。然而,我们还显示,msc从所有五个捐助者促进软骨修复的能力在活的有机体内不管他们的增殖和软骨分化的能力。mRNA的表达HLA-DRB1呈正相关,软骨修复吗在活的有机体内,mRNA的表达TMEM155和表达mir - 486 - 3 - p, mir - 148 b, mir - 93, mir - 320 b与软骨修复负相关。

在体外chondrogenic分化的能力,这是一种细胞外基质生产的指数,是在细胞增殖,高的CFE和GR。然而,我们发现,细胞增殖和chondrogenic分化不能用于msc的质量评估基于软骨修复的功效在活的有机体内。因此,CFE,基因的表达MYBL1和RCAN2,蛋白质TIMP-1和VEGF的表达可用于msc的质量评估基于扩散和chondrogenic再生的能力,但不是质量评估的msc基于软骨修复的功效。以前的研究报道,主要由MSC移植可能是推动组织再生介导通过间接旁分泌机制而不是直接再生移植MSC (28- - - - - -31日]。我们之前研究的内注入绿色荧光蛋白(GFP)表达大鼠msc为大鼠软骨缺损模型还显示,GFP-positive电池可以观察到受伤的网站在4周后,但无法检测到在8到12周的治疗后的标本(5]。这可能是之间的差异的原因在体外chondrogenic msc和软骨修复的能力在活的有机体内。另一方面,的表达水平HLA-DRB1,TMEM155,mir - 486 - 3 - p, mir - 148 b, mir - 93, mir - 320 b可能用于msc的质量评估基于软骨修复的功效。HLA-DRB1家庭的一部分基因被称为人类白细胞抗原(HLA)复杂的免疫系统有至关重要的作用。HLA-DRB1据报道,参与风湿性关节炎的pathopoiesis [32,33]。然而,的功能HLA-DRB1在msc还没有被报道。的功能在msc TMEM也是未知的。mir - 93已涉及多个细胞进程,包括增殖、凋亡,入侵,细胞外基质降解34- - - - - -37]。江京和报道,mir - 93低人类退化性髓核组织和它的水平与椎间盘退化等级有关。此外,过度的mir - 93 II型胶原蛋白的表达增加针对MMP3和可能从而促进软骨修复(38]。另一方面,mir - 486的功能——3 - p, mir - 148 b, mir - 320 b与msc或软骨没有先前的研究。我们发现特定的mrna的表达和microrna hMSCs与软骨再生的能力。这些基因可能是用于质量评估hMSCs之前用于治疗软骨修复。

在这项研究中,软骨修复在活的有机体内MSC移植后是不完整的。骨髓间充质裸大鼠异种移植的人类不足存在的原因可能是关节软骨的修复。另一个可能的原因不够修复关节软骨是使用hMSCs购买。商业化hMSCs非常扩大和冻结。这可能有不良影响的hMSCs质量软骨修复。在下一步中,品质的hMSCs参加临床试验的患者应以同样的方式评估。

5。结论

的细胞增殖和分化chondrogenic hMSCs在体外没有相关性与软骨再生在活的有机体内。另一方面,我们发现的表达HLA-DRB1,TMEM155,mir - 486 - 3 - p, mir - 148 b, mir - 93, mir - 320 b在hMSCs有关软骨再生的能力。这些因素可能有用的质量评估hMSCs之前用于治疗软骨修复。

信息披露

早期版本的工作提出了海报在口服补液盐2017年会,2017年3月19日至22日。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持的科研补助金从高速公路第三Ochi项目实现再生医学。