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干细胞国际/2017年/文章
特殊的问题

基础的修改:干细胞功能和疾病的监管

把这个特殊的问题

研究文章|开放获取

体积 2017年 |文章的ID 8596135 | https://doi.org/10.1155/2017/8596135

阿卜杜拉国王法鲁克Rashid Hassaan Mehboob Awan,姗姗,小林Wang Liang,通用电气山, ”出局区RNA解旋酶DDX3与m6一个RNA Demethylase ALKBH5”,干细胞国际, 卷。2017年, 文章的ID8596135, 11 页面, 2017年。 https://doi.org/10.1155/2017/8596135

出局区RNA解旋酶DDX3与m6一个RNA Demethylase ALKBH5

阿卜杜拉国王,1 Farooq拉希德,1 Hassaan Mehboob Awan,1 胡姗姗,2,3 小林王,1 梁陈,1 和 通用电气山1

1中科院重点实验室的先天免疫和慢性疾病,中科院卓越中心的分子细胞科学,生命科学学院中国科学技术大学,合肥,中国

2安徽省重点实验室的脑功能和脑疾病,合肥,安徽230001年,中国

3神经外科学系,安徽省医院隶属于安徽医科大学,合肥,安徽230001年,中国

学术编辑器:茎的李
收到了 2017年5月16日
修改后的 2017年7月27日
接受 2017年8月17日
发表 2017年11月23日

文摘

DDX3是出局区RNA解旋酶家族的成员。DDX3是一个多方面的解旋酶和扮演着重要的角色在细胞周期等关键生物过程,压力反应,细胞凋亡,RNA代谢。在这项研究中,我们发现DDX3与ALKBH5, m6一个RNA demethylase。ATP域DDX3和DSBH ALKBH5领域不可或缺的相互交互。此外,DDX3可以调节mrna的脱甲基作用。我们还表明,DDX3调控小分子核糖核酸的甲基化状态和DDX3和AGO2之间有一个互动。m的动力学6RNA修改仍然是一个字段要求进一步调查,这里,我们添加一个链接,显示RNA脱甲基作用可以由DDX3等蛋白质。

1。介绍

(死)- Asp-Glu-Ala-Asp -框(DDX)蛋白质是RNA解旋酶(最大的家庭1]。这个家族在细胞中扮演多向性的功能由一个与其他蛋白质或RNA不同形式的交互,维护RNA的二、三级结构的完整性,促进多个RNA加工过程(1- - - - - -3]。这些解旋酶含有一个高度保守的催化核心领域产生的atp酶和解旋酶活动以及守恒的N和c终端越少,这被认为赋予功能特异性和亚细胞定位个人的DDX解旋酶(4- - - - - -6]。DDX3是多功能和广泛表达于多种组织(7,8]。细胞核和细胞质之间的蛋白质航天飞机可以本地化P-bodies压力条件下(9- - - - - -12]。过去几年,DDX3报道扮演重要的角色在细胞周期进程等关键生物过程,细胞凋亡,癌症、应激反应、缺氧,应对辐射(8,13- - - - - -15]。DDX3参与许多步骤的RNA代谢包括RNA转录RNA拼接,信使RNA交通、翻译起始(10,16- - - - - -19]。多个证据表明特定的代数余子式可以修改DDX3的功能,如DDX3表单功能复杂的转录因子SP1(特异性蛋白1)和增强其同源启动子的表达活动(16]。

6-methyladenosine (m6)RNA甲基化是最普遍和丰富修改编码和非编码RNA (20.- - - - - -26]。米6约占50%的总甲基化核苷酸和存在于0.1% - -0.4%的腺苷细胞总rna (20.,23,24]。米的存在6影响核保留pre-mRNA拼接,mrna的稳定,稳定的小分子rna (22,27- - - - - -29日]。ALKBH5增强的可拆卸的mRNA出口到细胞质(29日),而损耗METTL3抑制mRNA出口(30.]。demethylase FTO(脂肪量和肥胖相关)调节可变剪接通过移除6绑定的网站拼接,通过抑制丝氨酸-和arginine-rich剪接因子2 (SRSF2) [31日]。米的存在6在5′UTR(翻译区)改善cap-independent翻译(32],eIF3(真核生物启动因素3)提出与m6马克和促进核糖体加载(33]。

米6在mrna影响细胞分化,许多基因的表达,包括转录因子(34]。例如,米6一个影响preadipocytes在脂肪生成的分化31日,35]。暴露的乳腺癌干细胞(BCSC)缺氧诱发m6脱甲基的多能性的关键因素,NANOG, ALKBH5 [36]。脱甲基NANOG增加记录稳定和促进BCSC扩散(36]。甲基转移酶的损耗Mettl3(methyltransferase-like 3)Mettl14(methyltransferase-like 14)导致低水平的m6一个和减少小鼠胚胎干细胞的自我更新37]。

m6修改是由多组分甲基转移酶转录后的安装复杂的至少有三个核心蛋白,即METTL3, METTL14,霍奇金病的肿瘤1-associating蛋白质(WTAP) [38,39]。近年来,发现两个m RNA6demethylases FTO,烷基化DNA修复蛋白AlkB同族体5 (ALKBH5),证明m6RNA修改可以抹去29日,40]。

在这项研究中,我们已经表明,DDX3 ALKBH5彼此互动和DDX3可以调节6脱甲基的rna。因为m的动力学6RNA修改主要是难以捉摸的,在这里,我们表明,RNA脱甲基作用可能受到监管。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和转染

HEK293T和海拉细胞培养在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)补充1%的抗生素和10%胎牛血清的边后卫。细胞培养在37°C湿润5%(/卷卷)有限公司2孵化器。小干扰rna转染质粒或使用Lipofectamine 2000(英杰公司)根据制造商的协议。

2.2。质粒构建

质粒都是由重组方法和/或限制性内切酶消化和连接。全身和删除构造成DDX3克隆p3xFLAG-Myc-CMV向量(Sigma-Aldrich)。甲基转移酶的完整长度和所有删除构造和demethylases克隆到pKH3-HA向量。所有结构经测序。引物序列和其他低聚糖一起使用的信息包含在网上补充表S1https://doi.org/10.1155/2017/8596135。

2.3。免疫沉淀反应

这些细胞被洗两次冰冷的PBS和交叉与紫外线12000 J /厘米2在PBS 2分钟。冰的细胞被孵化修改里帕裂解缓冲(150毫米氯化钠,50毫米三pH值8.0,1%诺乃清洁剂p 40, 0.5%脱氧胆酸盐,和蛋白酶抑制剂混合物(罗氏应用科学,曼海姆,德国))20分钟和旋转4°C 10分钟。然后,溶解产物通常用了5分钟振幅30%,其次是6秒的休息时间3秒脉冲。明确溶菌产物离心20分钟14000转4°C。五十(50μl) Dynabeads蛋白G磁性粒子resuspended(表达载体),500年μl(裂解缓冲。然后,1.5μ克各自的抗体被添加到珠子和孵化一个旋转轮在室温下30分钟。珠子被磁铁沉淀最后resuspended再次清除细胞溶解产物和孵化2 h在4°C。在最后一步中,珠子resuspended在50μl(裂解缓冲和接受西方的印迹。

2.4。西方墨点法

蛋白质从细胞溶解或从IP珠子受到sds - page分离,然后转移到一个聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)。之后,探讨了膜阻止使用相应的初级抗体在一夜之间在4°C。HA-Tag (C29F4)兔单克隆,单克隆anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich),鼠标DDX3 (c - 4)马伯,兔多克隆anti-ALKBH5 (Sigma-Aldrich),和鼠标anti-GAPDH抗体(Signalway)。洗后,膜与二次孵化辣根peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白g (1: 5000;zb - 2301)或anti-mouse免疫球蛋白抗体在室温下2小时。增强化学发光底物(EMD微孔)被应用,和信号检测使用化学发光成像系统(ChemiDoc™MP成像系统;Bio-Rad实验室Inc .)。

2.5。RNA提取和实时定量PCR(存在)

从细胞总RNA是孤立使用试剂盒试剂(英杰公司)根据制造商的协议。核糖核酸的浓度是由分光光度计。互补脱氧核糖核酸的合成中存在由GoScript总RNA逆转录系统(Promega)根据提供的协议使用随机六聚体底漆和低聚糖dT。qPCR与去执行Taq qPCR大师混合(Promega) PikoReal实时PCR系统(热科学)根据标准程序。

2.6。微rna和保利(A) mRNA隔离

微rna和聚(A) mRNA从细胞中提取使用mirVana™MicroRNA的隔离设备和PolyAT束mRNA隔离系统(Promega),分别根据制造商的协议。

2.7。蛋白质复杂的建模

复杂的造型是由ALKBH5对接190 - 293对DDX3211 - 402罗塞塔的web服务器上(http://rosie.rosettacommons.org/docking2)。用于对接的参数设置为默认值(41- - - - - -43]。对接结果向公众开放。ALKBH5的对接工作190 - 293对DDX3211 - 402被分配一个ID(33161)或者可以访问以下链接吗http://rosie.rosettacommons.org/docking2/viewjob/33161。模型与PyMOL最好的分数进行了分析软件(PyMOL分子图形系统,版本1.8薛定谔,LLC)。结构用于造型获得蛋白质数据银行,加入数字2 i4i DDX3211 - 402(44ALKBH5], 4061190 - 293(45]。

2.8。分析m6使用点状试验水平

m6上进行点状Bio-Dot装置(Bio-Rad实验室Inc .)。总之,RNA样本变性,发现在真空下硝化纤维膜。紫外线交联后膜在80°C烤1小时,和亚甲蓝染色法被用来检查等于RNA加载。检测m6一个水平,兔子anti-m6抗体(微孔σ)是稀释1:500年0.1% TBST和5%脱脂奶粉和孵化一夜之间膜(4°C)。广泛的洗涤TBST 0.1%后,污点是孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭anti-rabbit免疫球蛋白二次抗体为2 h 25°C。膜又洗了有0.1% TBST和ECL免疫印迹检测可视化工具包(热科学)。点与imageJ量化。

2.9。细胞增殖实验

细胞生存能力与MTT测定细胞增殖和细胞毒性检测设备(Keygentec、南京、中国)根据制造商的建议。在镀96 -孔板的细胞密度2×103每口井。细胞被转染siRNAs或紧急控制。MTT试剂被添加在表示时间点。四小时后,浮在表面的删除,添加DMSO溶液溶解蓝色沉淀。活细胞的数量决定了OD值,这是衡量一个盘子读者(MultiSkan去,热科学)。

3所示。结果

3.1。DDX3与ALKBH5

推出在RNA DDX3甲基化的角色,我们开始确定DDX3身体与m6甲基转移酶和demethylases。我们构建表达质粒METTL3 METTL14 WTAP, FTO, ALKBH5。我们cotransfected HEK293T细胞个体表达质粒一起DDX3表达质粒(数字1(一),1 (b),1 (c),1 (d))。成功的超表达证实了实时qPCR和免疫印迹(数据1(一),1 (b),1 (c),1 (d))。然后我们进行免疫沉淀反应(IP)来检查他们的交互与DDX3(数据1 (e),1 (f),1 (g),1 (h),1(我))。发现METTL3 IP, METTL14, WTAP或FTO co-IP DDX3(图1 (e))。相比之下,IP ALKBH5可能co-IP DDX3(数字1 (f)和1 (g))。此外,IP DDX3可能co-IP ALKBH5(图1 (f))。这些数据表明,ALKBH5是唯一的蛋白质在五甲基转移酶和demethylases与DDX3互动。

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图1
DDX3与ALKBH5相互作用的识别。(一)FLAG-DDX3 HEK293T细胞中过度表达,相对DDX3 mRNA(上半部分)和蛋白质水平(下图)。(b) HA-ALKBH5 HEK293T细胞中过度表达,ALKBH5 mRNA(上半部分)和蛋白质水平(下图)。(c)过度的甲基转移酶和demethylases HEK293T细胞,由qPCR mRNA水平检查。(d)超表达相应的蛋白质(用箭头指示)检查由西方的屁股。(模拟)电动车,空向量;OE,超表达。(e)与METTL3 DDX3没有交互,METTL14, WTAP,或FTO,研究了IP和co-IP。(f)的交互ALKBH5 DDX3检查FLAG-DDX3 IP和HA-ALKBH5 co-IP海拉细胞。(g)之间的相互作用与DDX3 ALKBH5核糖核酸酶的存在与否,检查HA-ALKBH5 IP和FLAG-DDX3 co-IP HEK293T细胞。 (h) The interaction of ALKBH5 with DDX3 in the presence or absence of RNase A, examined with FLAG-DDX3 IP and HA-ALKBH5 co-IP in HEK293T cells. (i) Endogenous DDX3 interacted with endogenous ALKBH5, examined with IP and co-IP; two known isoforms of ALKBH5 are indicated with arrowheads. IP and co-IP were performed in triplicates, and representative results are shown. ; 值和双尾学生的决定t以及;误差线代表标准偏差(SD)。

之间的交互DDX3 ALKBH5并没有RNA依赖的,有或没有的交互本质上是不变核糖核酸酶治疗(数据1 (f)和1 (g))。我们进一步检查他们是否互相开通过执行IP与抗体DDX3事实上ALKBH5可能co-IPed(图1 (h))。

3.2。ATP DDX3域与DSBH ALKBH5的领域

我们进一步问DDX3与ALKBH5互动领域。为此,5部分删除构造DDX3构造(图2(一个))。这些结构被用来执行IP,并完整ALKBH5当时检查的co-IP HEK293T细胞(数字2(一个),2 (b),2 (c),2 (d))。在这些结构中,删除的n端结构域,链接器领域,解旋酶域,或c端域仍然显示与完整的交互ALKBH5(图2 (b))。然而,经磷酸腺苷域(DDX3-ΔATP),删除绑定ALKBH5被废除(图2 (c))。完整的IP ALKBH5也没有co-IPed DDX3-ΔATP(图2 (c))。有趣的是,DDX3本身的腺苷结合域可以与全长ALKBH5(图2 (d))。这些结果表明,ATP -绑定域而不是其他领域与ALKBH5 DDX3是不可或缺的。

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图2
决心与ALKBH5 DDX3绑定域名的。(一)原理图长篇DDX3和相应的部分删除构造;总结与ALKBH5互动的结果也显示。(b) n端结构域的删除链接器领域,解旋酶域,或c端域与全身ALKBH5 DDX3显示交互,与IP和co-IP检查。(c)被废除的交互ATP DDX3域删除时,与IP和co-IP检查。(d) ATP DDX3领域单独与全身ALKBH5互动,与IP和co-IP检查。所有的IP和co-IP表现在一式三份,代表结果显示。
3.3。DSBH ALKBH5域与ATP DDX3领域

接下来,我们绘制了域与DDX3 ALKBH5负责其交互。为此,4部分删除构造ALKHB5构造(图3(一个))。然后,每个构造研究与全身DDX3交互使用co-IP分析。在这些结构中,n端结构域的删除,D-domain或c端域绑定效率没有影响DDX3(图3 (b))。然而,当ALKBH5 DSBH域的删除,交互与全身DDX3被废除(图3 (c))。此外,DSBH ALKBH5域就可以与全身DDX3(图交互3 (d))。这些结果表明,DSBH ALKBH5域与DDX3是必要且充分的交互。此外,磷酸腺苷DDX3域和DSBH域ALKBH5可能相互作用(图3 (e)和3 (f))。

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图3
决心与DDX3 ALKBH5绑定域名的。(一)原理图长篇ALKBH5和相应的部分删除构造;总结与DDX3交互显示的结果。(b) n端结构域的删除,D-domain,或与全身DDX3 ALKBH5显示c端领域的互动,与IP和co-IP检查。(c)删除ALKBH5废除其DSBH域的交互与IP和co-IP DDX3当检查。(d) DSBH ALKBH5领域单独与全身DDX3互动,与IP和co-IP检查。(e) ATP DDX3域与DSBH ALKBH5领域,与IP和co-IP检查。(f) DSBH ALKBH5域与ATP DDX3领域,与IP和co-IP检查。(b-f)所有IP和co-IP进行了一式三份,并代表所示结果。(g)的预测DDX3 (DDX3 ATP域之间的相互作用211 - 402)和DSBH ALKBH5 (ALKBH5领域190 - 293)。DDX3211 - 402用绿色标记,ALKBH5190 - 293用红色标记。圆圈表示这两个域的相互作用的区域,和一个放大视图显示残留参与分子间氢键的形成。提出了氢键在蓝色的虚线。

一个模型说明DDX3之间的相互作用211 - 402和ALKBH5190 - 293被罗塞塔对接预测服务器(图3 (g))。结果意味着DDX3和ALKBH5之间的直接交互。残留可能对于DDX3-ALKBH5循环地区定位这两个蛋白的相互作用。该模型显示之间的氢键发生残留Arg218 DDX3和Glu293 ALKBH5 ALKBH5 Arg291之间和Asp398 Glu399 DDX3,分别。

3.4。DDX3调制米6一个RNA脱甲基

我们进行siRNA-mediated击倒DDX3 ALKBH5,分别在HEK293T细胞。DDX3或ALKBH5的信使rna和蛋白质水平显著下调(数字4(一)和4 (b))。然后分析了米6修改总RNA,信使RNA, microrna。ALKBH5或DDX3击倒后,增加了m6修改信号观察(图4 (c))。因此,DDX3积极调制脱甲基的效果。据报道之前,DDX3 AGO2 colocalize彼此(46促使我们决定DDX3可能身体与AGO2交互。事实上,在co-IP实验,AGO2蛋白质与DDX3(图所示4 (d))。这些证据暗示DDX3在microrna的脱甲基的作用可能是通过与AGO2交互。

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图4
DDX3调制米6一个RNA脱甲基作用。HEK293T细胞(a) DDX3击倒,相对DDX3 mRNA(上部面板,qPCR)和蛋白质水平(较低的面板中,西方墨迹图)所示。HEK293T细胞(b) ALKBH5击倒,ALKBH5 mRNA(上部面板,qPCR)和蛋白质水平(较低的面板中,西方墨迹图)所示。左面板(c):点状分析m6孤立的总RNA水平,信使RNA, microrna ALKBH5击倒,DDX3击倒和控制(数控,siRNA炒序列)细胞。右面板:亚甲蓝染色显示RNA加载。(d) IP的内生DDX3 co-IP内生AGO2,和IP的内生AGO2 co-IP内源性DDX3 HEK293T细胞。(e)量化后的细胞增殖(MTT试验)击倒DDX3或ALKBH5 HEK293T细胞。(f)量化后的细胞增殖(MTT试验)击倒DDX3或ALKBH5海拉细胞。点的屁股、IP和co-IP进行在一式三份,结果显示和代表。争夺siRNA炒序列。 , ,和 。 值和双尾学生的决定t以及。误差线代表标准偏差(SD)。
3.5。击倒DDX3和ALKBH5减少细胞增殖

米6核糖核酸甲基化是影响干细胞更新和分化34,35]。调查DDX3和ALKBH5细胞生长的影响,DDX3和ALKBH5表达下调与siRNAs HEK293T和海拉细胞。MTT试验表明,显著降低两个细胞系的生长曲线(数据4 (e)和4 (f))。这些结果表明DDX3的潜在作用,ALKBH5在调节细胞生长,高度可能通过调节m6的水平和细胞增殖。

4所示。讨论

我们的研究结果表明,DDX3与RNA demethylase ALKBH5 AGO2。这些交互和对m DDX3影响的结果6水平建议一个诱人的工作模型,DDX3作为“中介”的调制mrna或小分子核糖核酸的脱甲基ALKBH5(图5)。


图5
工作模型ALKBH5的角色和DDX3 m6一个RNA脱甲基作用。DDX3与ALKBH5调节mRNA脱甲基,此外,通过与AGO2互动,可以调节微rna脱甲基作用。之间是否有直接的交互ALKBH5和AGO2需要进一步调查。

m6一个是守恒的编码和非编码rna转录后的修改,在多个细胞过程有重要作用(20.,21,47- - - - - -49]。最近的研究已经证明了m细胞和生理角色6(27,28,50]。认为这是件好事6一个甲基化在信使rna剪接和翻译中扮演关键角色27,28]。小分子核糖核酸的甲基化也被证明有功能的影响(25,26]。各种细胞条件表现出米的变化6核糖核酸甲基化,与甲基转移酶的表达变化和demethylases [22,32,34,50]。然而,的分子调节机制添加或移除6修改需要进一步调查。我们的结果表明,DDX3可能调解或者至少调整脱甲基ALKBH5活动。似乎对ALKBH5 DDX3相当具体的甲基转移酶和demethylases测试(图2)。人们很容易认为其他甲基转移酶或demethylases也可能相应的特定的调节器。

DDX3扮演不同的细胞功能,通过其不同领域不同的蛋白质相互作用。在目前的研究中,我们描述了一种新的角色DDX3与m RNA脱甲基的物理交互6一个RNA demethylase ALKBH5 AGO2。ATP域DDX3 (AA 212 - 403)和DSBH域(AA 191 - 292) ALKBH5负责他们的交互(数字2和3)。守恒的核心部分DDX3 (AA 227 - 534)负责与PABP1 [19]。DDX3 c端地区需要260 - 517 AA片段与CRM1协会(9]。DDX3专门压制帽依赖翻译通过绑定eIF4E通过其氨基端100个氨基酸片段(18]。因此,DDX3涉及在许多生物过程中通过不同的领域与不同的蛋白质。

米6核糖核酸甲基化是影响细胞更新和分化31日,35]。在目前的研究中,我们已经表明,击倒DDX3或ALKBH5减少两HEK293T细胞增殖和海拉细胞系(数字4 (e)和4 (f))。有趣的是,之前的研究表明,在缺氧条件下BCSCs更高水平的ALBKH5 HIF-1表达式α- - - HIF-2α端依赖方式,最终导致浓缩的BCSCs缺氧肿瘤(36]。另一方面,以前的研究也表明,甲基转移酶的损耗Mettl13或Mettl14降低鼠标的ESCs的自我更新(37]。

在这项研究中,我们已经确定了DDX3 ALKBH5作为合作伙伴和AGO2调节mrna的脱甲基和microrna。进一步的研究将有助于阐明如何将这些相互作用导致的监管动态m6epitranscriptome和功能相关性和生理角色的上下文中DDX3 m6一个修改。

5。结论

在这项研究中,我们发现DDX3与ALKBH5, m RNA6demethylase。我们发现ATP DDX3域和DSBH ALKBH5领域不可或缺的相互交互。此外,DDX3可以调节mrna的脱甲基作用。我们还发现DDX3之间的交互和AGO2 DDX3可以调节microrna的脱甲基作用。m的动力学6RNA修改主要是难以捉摸的,在这里,我们表明,RNA脱甲基DDX3等可以由蛋白质。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

阿卜杜拉国王法鲁克拉希德,Hassaan Mehboob Awan贡献同样这项工作。

确认

这项工作得到了中国国家基础研究计划(2015 cb943000 Ge山),中国国家自然科学基金委Ge山(31471225),合肥的重大创新项目开发基础物理科学和技术中心(2016 fxcx006 Ge山),和中科院重点实验室开放项目的先天免疫和慢性疾病(kliicd - 201603通用电气山)。

补充材料

选项卡。S1。研究中使用的寡核苷酸。

  1. 补充材料

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