文摘
沃顿商学院的果冻间充质干细胞免疫调节(WJ-MSC)展览对T细胞反应的影响。WJ-MSC很容易收集、处理和在文化迅速增殖,但个别细胞样本的变化影响信息在体外扩张,免疫调节潜力,仍缺乏和老化过程。我们建议评估免疫调节细胞因子和抑制T细胞增殖能力WJ-MSC进步复制衰老,以分析是否影响预期的反应。我们的结果表明,免疫调节分子的基因表达不同的样品中没有特定的模式。在coculture,所有WJ-MSC能够抑制增殖作用CD3+T细胞增殖,尽管程度不同,每个PBMC反应有不同程度的抑制作用。因此,我们建议每个WJ-MSC显示独特的行为模式的不同细胞因子mRNA表达和免疫调节能力。我们相信,样本之间的差异可能发挥作用在WJ-MSC使用治疗的有效性。
1。介绍
间充质干细胞(MSC)是多功能细胞增殖的能力,自我更新和分化成不同的细胞类型(1,2]。国际社会的最低标准细胞治疗建立,人类必须塑料附着MSC,表现出特定的细胞表面表达谱,并分化为骨细胞,脂肪细胞,软骨细胞在体外(3,4]。骨髓(BM)被认为是MSC派生的“黄金标准”和在临床试验中使用5,6]。然而,从脐带获得MSC墙,沃顿商学院的果冻(WJ-MSC),可以很容易地分离和处理。细胞增殖迅速在文化的附加值是非常年轻的年龄(新生儿),环境保护,从源较低的道德问题。
连同他们的能力分化为中胚层细胞,MSC还显示一个重要特性,即其免疫调节能力(7,8]。事实上,目前的共识是,更有前途的好处出现在患者呈现急性病理炎症组件。在这些条件下,促炎细胞因子,MSC开始产生免疫调节因子,缩减免疫反应(9]。最有可能是由于影响可溶性MSC分泌的因素(10转化生长因子等)β1 (TGF -β1)(11)、白细胞介素- 10”(il - 10) [12),肝细胞生长因子(HGF) [13)、前列腺素E2 (PGE2) [143-dioxygenase),吲哚胺2——(IDO)介导的色氨酸损耗(10),这导致MSC和免疫细胞之间的串扰。MSC的影响免疫系统的细胞通常是抗炎,一直在观察到许多细胞类型。MSC诱导M1, M2巨噬细胞表型转换(15),保持中性粒细胞可行性和功能(16),调节树突细胞(DC)生成和成熟(17),影响B细胞增殖和成熟18),块自然杀伤(NK)细胞活化和细胞毒性19),抑制T细胞增殖(20.,21),抑制同种异体T细胞反应(22),诱导调节性T细胞的增殖(Treg) [23]。此外,研究表明,与干扰素- BM-MSC许可γ(激活产生抗炎细胞因子)在coculture T细胞有抑制能力增加24- - - - - -26]。
由于免疫抑制的潜力和能力维护和修复组织,MSC最近成为一个有前途的工具,用于细胞疗法(27,28]。然而,体外MSC的使用寿命有限,表现出他们的自我更新能力在逐步减少,通常以不可逆逮捕细胞分裂或复制衰老29日,30.]。这一过程的结果是干细胞功能的损失,这些都限制了其用于治疗的目的。此外,衰老MSC与增强的与年龄有关的疾病的进展[有关31日]。相反,大木船等人表明,p16——(CDKN2A)表达从岁人类胰岛β细胞发展到衰老时变得更有效率。衰老β细胞显示增加胰岛素分泌体外指示作用的控制正常细胞功能在组织老化(32]。
内在可变性之间获得的样本来自不同WJ-MSC捐助者已经证明了我们组(33]。为了研究衰老期间每个捐赠者的可变性,我们评估新生儿WJ-MSC,我们表明,这些细胞获得从健康,剖腹产后end-term孕妇年龄相仿的,孤立的,和扩大利率总是相同的技术表现出不同的人口翻了一番,达到在不同的段落衰老。因此,尽管MSC的已知的免疫调节能力,还有待观察不同的概要文件是如何影响MSC的本征函数和老龄化如何影响他们免疫抑制性能和预期的治疗效率。
基于这些结果,本研究的目的是调查如果WJ-MSC从不同的捐赠者,在文化不同数量的通道后,保持相同的免疫调节潜力,如果这不同于捐赠者捐赠。我们选择监控以下分子免疫抑制能力著称:il - 10, IL-11,被罩,HGF, TGF -β生活,以下标准细胞因子由MSC: il - 1α,il - 1β、il - 6和引发由WJ-MSC,最后两个认为是细胞衰老的生物标志物。我们也评估如果WJ-MSC能够抑制phytohaemagglutinin (PHA) mitogen-stimulated T细胞后被干扰素-许可γ如果这些不同的细胞因子概况影响免疫抑制WJ-MSC的潜力。
2。材料和方法
2.1。WJ-MSC隔离
脐带(UC)健康足月出生的捐赠者来自剖腹产交付()。只有健康WJ-MSC甲型肝炎血清反应阴性的样本,B和C;艾滋病毒I和II;HTLV I和II;巨细胞病毒;弓形体病;血红蛋白电泳;恰加斯病;和梅毒包括(ANVISA / RDC号153/2004),遵守评估标准公共脐带血库的医院Israelita阿尔伯特·爱因斯坦(HIAE)。根据我们以前公布的酶协议(33),绳子被绞成碎片5毫米的最大大小3手术刀。酶消化是通过孵化为一小时37°C下温柔的震动,在4% I型胶原酶(200单位/ mg)溶解在nonsupplemented DMEM。接下来,添加50%的边后卫在DMEM和过滤材料是150μ米孔隙大小网格删除组织碎片。细胞被离心机,颗粒进一步补充DMEM洗,并相应地细胞被播种。
2.2。细胞培养
WJ-MSC在DMEM培养在37°C低葡萄糖(表达载体,圣地亚哥,CA),补充10%胎牛血清的边后卫,谷酰胺2毫米/毫升,antibiotic-antimycotic解决方案100 x (100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素,250 ng / mL de两性霉素B)在湿润的气氛中5%的有限公司2。WJ-MSC被播种到25岁或75厘米2组织烧瓶(康宁、圣路易斯、钼)保持4000个细胞密度/厘米2在所有的通道。标准协议包括流式细胞术对细胞表面标记:CD105, CD73, CD29、CD44, CD166 CD90、CD14、CD34、CD45、CD117, CD133, CD31、CD106, CD133, HLA-DR和成骨的脂肪形成的分化。
2.3。隔离和PBMC从Leukoreduction钱伯斯获得的文化
PBMC(外周血单核细胞)隔绝leukoreduction室收集,知情同意后,从健康志愿者血小板捐献者,定期捐助者HIAE的血库。在PBS样本稀释1:5,聚蔗糖梯度添加。离心后97030分钟,单核细胞和50毫升的PBS收集和清洗。球被分离、重组和冻结在1×107细胞/毫升整除。PBMC样本在37°C在DMEM培养低葡萄糖(表达载体,圣地亚哥,CA),补充10%胎牛血清的边后卫,谷酰胺2毫米/毫升,antibiotic-antimycotic解决方案100 x (100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素,250 ng / mL de两性霉素B)在湿润的气氛中5%的有限公司2。
2.4。基底细胞因子分析
WJ-MSC被播种到6好板(康宁,圣路易斯,密苏里州)保持4000个细胞密度/厘米2在所有的通道。样本收集当细胞达到70%的融合。实验研究在早期(通道5),在(15)通过一个中间阶段,在复制衰老(当细胞停止增殖)。信使rna提取,为后续分析的免疫调节分子实时PCR。上层清液的收集和液态氮冷冻立即进行进一步分析CBA的分泌细胞因子。
2.5。Coculture化验
coculture化验,3×104每在附着48-well WJ-MSC细胞被播种盘子。首先,细胞被孵化24小时50 ng / mL的重组人干扰素-γ(IFN -γ)。细胞培养与3×10 72 h5PBMC(比1:10)没有或PHA的存在(Gibco,卡尔斯巴德,CA)。WJ-MSC测试在章节5 (P5)和10 (P10)。3天后,PBMC收集评价T细胞增殖通过流式细胞术和WJ-MSC收集了RNA提取,为后续分析的免疫调节分子实时PCR。上层清液的收集和液态氮冷冻立即进行进一步分析CBA的分泌细胞因子。
2.6。实时定量rt - pcr
WJ-MSC总RNA提取使用RNeasy微工具包(试剂盒、Venlo NV)根据制造商的指示,和500 ng的总RNA的互补脱氧核糖核酸合成使用上标三世逆转录酶工具包(表达载体,圣地亚哥,CA)与低聚糖dT引物。根据Taq人掌握实时PCR进行混合试验协议(美国应用生物系统公司,培育)使用序列检测器的ABI棱镜7500(美国应用生物系统公司,培养)。gene-specific探测器选择使用TaqMan调查数据库从生活技术(CA)卡尔斯巴德。我们使用两步放大协议变性温度为94°C和annealing-extension温度60°C。产生HPRT基因表达作为一个内部参考每个样本。从周期相对基因表达计算阈值(Ct)使用∆∆Ct方法(34]。
2.7。细胞增殖实验
PBMC贴上了点击它®EdU太平洋蓝色™流式细胞术分析工具包(生活技术,卡尔斯巴德,CA),一个标签使用胸苷类似物(EdU)合并的增殖细胞的DNA。协议执行根据制造商的指示。此外,这些细胞被贴上anti-CD3 anti-CD4, anti-CD8抗体评估WJ-MSC在每个T细胞亚群的影响。数据获得使用BD Fortessa (BD生物科学,圣何塞,CA)流式细胞分析仪使用FCS表达和分析流式细胞仪数据分析(新创软件,格兰岱尔市,CA)在10000年收购事件/样本规模日志荧光。
2.8。细胞因子的分泌
评价细胞因子由WJ-MSC,我们使用了仪珠试验(CBA) Flex技术,允许同时多个细胞因子的检测在同一个样本。il - 1的测量α,il - 1βil - 10、il - 6、引发,IL-11执行根据制造商的指示。
2.9。统计分析
所有数据分析使用SAS (SAS研究所,2001)。统计上显著的差异组被线性回归计算。正态分布的标准没有达到时,对数转换使用。的Tukey-Kramer期末测验是用来调整为多个比较。该模型包括干扰素-γ治疗,PBMC样本,细胞通道,WJ-MSC样本,当重要,还包括他们的相互作用。值作为意味着±SEM一井,为每个WJ-MSC样本。在所有分析,被认为是水平的意义。
3所示。结果
3.1。WJ-MSC显示不同的基底细胞因子mRNA表达和蛋白分泌的模式
确定基底的免疫调节细胞因子由WJ-MSC根据以往的文献中,我们选择了以下可溶性分子:il - 1α,il - 1βil - 10、il - 6、引发,IL-11, HGF,制药业,TGF -β我,看好她。从所有基因mRNA除了发现il - 10。il - 1β信使rna是增加通道15但减少细胞衰老。HGF和IL-11沿着通道基因表达降低。令人惊讶的是,衰老导致降低il - 6和引发mRNA的生产。il - 1α基因表达、被罩和生活不同的样品中没有特定的模式(图1(一))。我们观察到在每个样本不同的概要文件。WJ-MSC1促炎(il - 1表示β,il - 6)和抗炎分子(IDO);WJ-MSC2表达主要被罩WJ-MSC3主要表达了促炎细胞因子和不表达被罩。只有il - 6、引发和IL-11在检测大量分泌。IL-11分泌减少几个段落,il - 6和引发(图显示变量的结果1 (b))。在某些情况下,并行复制样本分析产生相似的结果(数据未显示)。
(一)
(b)
3.2。所有WJ-MSC样品目前抑制增殖作用CD3的能力+T细胞增殖,但样本之间的不同
评估潜在的免疫调节WJ-MSC,我们执行一个历史悠久的功能分析35,36)旨在衡量T细胞增殖的抑制。复制两个样本血小板捐献者PBMC与PHA刺激对3种不同的WJ-MSC 72小时和测试。这个实验设计旨在,消除反应的细胞(PBMC)变化,证据WJ-MSC捐助者之间的差异。
所有WJ-MSC样品表现出抑制增殖作用CD3的能力+T细胞增殖(图2)。可以观察到每个WJ-MSC样本表现不同,这取决于PBMC用于挑战,但总是显示一个更高层次的抑制PBMC2 ()。相比WJ-MSC单独或与PBMC1 cocultured, il - 10信使rna也增加的PBMC2(数据没有显示)。
另一方面,尽管抑制效应发生在PBMC,每个WJ-MSC表现出不同的结果。当cocultured WJ-MSC1 PBMC1扩散不明显(39%),WJ-MSC2诱发更大的抑制PBMC2(图2),指示每个WJ-MSC有着独特的响应模式。
3.3。T细胞反应也根据每个PBMC样例呈现不同的概要文件
我们也评估的免疫调节效应WJ-MSC CD3的亚种群+CD4+助手和CD3+CD8+细胞毒性T细胞。两CD3 WJ-MSC能够抑制增殖+CD4+()(图3(一个))和CD3+CD8+()(图3 (b))细胞与PBMC2 cocultured时,无论WJ-MSC样本使用。然而,尽管类似CD4和CD8 T细胞计数在PBMC(数据未显示),WJ-MSC没有抑制CD4细胞+和CD8+T细胞亚群从PBMC1收获。换句话说,这一结果证实了扩展的抑制增生性反应PBMC样本之间明显不同。
(一)
(b)
3.4。通过数量和许可与干扰素γ不影响免疫调节能力,它根据WJ-MSC捐赠吗
研究表明,干扰素-γ需要激活MSC和提高效率,当接触到免疫系统(24,37]。然而,目前尚不清楚后免疫抑制能力维护几个段落。这些实验进行使用段落5和10。P10被选中,是因为通常情况下,在P10 MSC不是完全衰老,10通道后,仍有可能获得足够的细胞在细胞疗法中使用。在临床试验中,1 - 2×106细胞/公斤体重是注射的病人(38]。因此,我们调查是否使用不同的段落和干扰素-预处理γ干涉WJ-MSC函数。三种不同WJ-MSC段落5和10和干扰素-许可γ为24小时。治疗后,WJ-MSC挑战使用进一步PBMC的两个样品,在PHA的存在与否对72小时。我们评估WJ-MSC压制CD3的能力+T细胞增殖(图4),同时相应的CD4细胞+和CD8+亚种群(补充数据网上https://doi.org/10.1155/2017/8492797)。
WJ-MSC能够抑制PBMC3和PBMC4观察非干扰素-γ对待PMBC2,但在不同级别()。WJ-MSC1显示最好的抑制能力PBMC3和PBMC4(92%和90),与段落之间没有观察到显著差异或由于许可与干扰素γ。相比之下,免疫抑制效应时减少WJ-MSC2和3样本cocultured PBMC3和PBMC4通道10。有可能在这种情况下,一种更高级的衰老阶段影响他们的抑制能力。正如我们先前所显示的,WJ-MSC做进步衰老与不同模式(33]。
最后,在分析CD4抑制模式+类似于CD3 T细胞亚群+数据。CD8+T细胞,然而,没有一个一致的模式(补充数据)。
总之,我们的结果加强我们的前提,根据WJ-MSC免疫抑制潜在的不同样本,除了通过使用或许可与干扰素γ(图4)。
3.5。il - 10和语言表达调节所有WJ - MSC样品Cocultured PBMC但不同根据WJ-MSC捐献者
为了增加我们的理解机制与免疫调节相关的潜力,我们调查是否由WJ-MSC分子参与了免疫抑制效应与同种异体PBMC挑战后改变。为此,我们进行了基因表达分析。il - 1α,il - 1β、il - 6、引发IL-11 TGF -β、生活和HGF基因表达没有表现出任何模式之间共享WJ-MSC样本(详细结果可按照客户要求定制)。
o基底资料缺失或很低,被罩和il - 10增加当WJ-MSC cocultured PBMC WJ-MSC相比。coculture,所有WJ-MSC IDO基因表达增加,虽然每个单元是一个独特的形象。用干扰素治疗,γ增加被罩mRNA表达的存在与否coculture (),在这两个段落5和10(图5(一个))。
(一)
(b)
il - 10的反应表现出不同的模式。没有il - 10表达仅在WJ-MSC即使许可与干扰素γ。然而,coculture后,所有三个WJ-MSC开始表达il - 10在不同层次(图5 (b))。细胞接触PBMC4始终比细胞il - 10表达cocultured PBMC3 ()。没有显著的相关性被罩和il - 10 mRNA表达抑制T细胞增殖可能被发现。
4所示。讨论
理解这些变化发生在WJ-MSC免疫调节特性在衰老的进程是一个重要的步骤来达到改善这些细胞在治疗中的应用方法。本研究调查如果内在可变性WJ-MSC对其免疫调节潜在的影响。我们评估的影响细胞衰老和干扰素-γ许可WJ-MSC功能,以T细胞增殖和生产的分子参与了免疫抑制。
多项研究表明,MSC可能出现免疫抑制或促炎的概要文件39- - - - - -42]。据报道,MSC分泌细胞因子自发或其他细胞因子诱导后,和相信的效果是由局部微环境条件决定的。沃特曼等人表明炎症环境中与高水平的肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ,MSC可能表现出一种抗炎分泌PGE2,被罩,TGF -βHGF,抑制T细胞增殖和诱导激活Treg细胞(39]。当MSC检测不到发炎的迹象环境TNF水平较低α和干扰素-γ,他们可能获得炎性表型、分泌趋化因子,招募T细胞的炎症和增加免疫反应(40,41]。相反这些概要文件之间的平衡可能是重要的促进体内平衡防止组织损伤和支持组织再生和修复。
按照我们先前的研究显示内在可变性在扩张能力和细胞寿命33),我们的研究结果表明,每个WJ-MSC示例展示一个独特的基底的免疫调节分子。WJ-MSC1显示,促炎和增加免疫抑制分子,WJ-MSC2表现出更大的免疫抑制分子的表达,和WJ-MSC3显示增强基因表达促炎的相关活动。干扰素-后γ刺激,细胞因子模式也相当变量WJ-MSC样本在早期和后来段落(补充数据)。值得注意的是,所有的样品都种植遵循同样的标准协议和使用统一的试剂(包括捐赠PBMC)。新生儿来源,此外,从同一供者年龄之前确定为一种可变性是消除43,44]。
确认如果不同的配置文件对WJ-MSC的免疫调节能力的影响,我们进行了功能分析,用coculture PBMC测量T细胞增殖和基因表达。我们的数据是按照其他作者(21,22,45在coculture]表明,MSC,在我们的案例中从脐带获得墙,能够抑制CD3+T细胞增殖。Najar等人相比,MSC的免疫调节能力从脂肪组织,获得骨髓,沃顿商学院的果冻。MSC免疫抑制效应并不局限于一个特定的T细胞数量和不同的MSC同样抑制CD4+和CD8+T细胞增殖(46]。然而,我们的研究结果显示有一个不同的模式当CD3 PBMC的反应+,CD4+,CD8+T细胞亚群进行了分析。令人惊讶的是,尽管一个清晰,虽然对CD3较小的影响+T细胞通过三个WJ-MSC样本,没有显著的抑制CD4+和CD8+与PBMC1观察T细胞增殖。我们的研究表明,的功效WJ-MSC免疫调节能力也依赖于受体细胞轮廓。其他研究已经表明,人类BM-MSC不仅抑制T细胞增殖,而且影响生产的CD4细胞因子+和CD8+T细胞(47,48),但在我们的研究中,我们只测量基底细胞因子的生产。
衰老是一个重要的生物过程,发生在许多细胞类型,包括MSC,由不可逆的细胞生长逮捕[49]。尽管如此,一个清晰的了解这一过程会影响WJ-MSC以及是否IFN -免疫调节的潜力γ可以增强的抑制效应老化WJ-MSC仍然缺乏。为了研究衰老和WJ-MSC的免疫调节活动之间的关系,我们集中实验干扰素-γ许可评估WJ-MSC老化的影响。先前的研究表明,辐射诱导衰老人类BM-MSC失去保护性免疫调节功能在脓毒症小鼠模型,虽然部分抑制T细胞增殖能力和调节能力对体外巨噬细胞的炎症反应是保留(50]。我们的数据表明,潜力是保持10通道后体外免疫调节。然而,该活动由WJ-MSC2和WJ-MSC3减少10通道相比,通过5。有趣的是,在一些实验中,干扰素-γ许可增强WJ-MSC抑制活动后通道(见WJ-MSC2图4)。
最近的报告还研究了免疫调节炎性刺激后MSC的潜力。萨博等人表明,老鼠BM-MSC表现出差异的克隆抑制T细胞增殖能力,但与促炎细胞因子MSC预处理后,这些差异消失(51]。Fuenzalida等人表明,预处理,TLR3配体(多聚肌苷酸)增强UC-MSC免疫抑制能力(52]。与这些研究中,我们观察到的变化是与干扰素-预处理后维护的γ,这促炎的刺激似乎并没有加强WJ-MSC在T细胞的抑制能力。然而,它应该考虑,萨博等人进行他们的研究在小鼠BM-MSC, Fuenzalida等人没有区别UC-MSC cocultured PBMC在/缺乏有限合伙人(TLR4配体),也促炎的刺激。我们没有测试TLR配体在我们人类样本,而是选择了使用标准的激活干扰素-γ。还有待观察,如果结果可比。
另一项研究在2013年发表的(53)比较不同MSC样本来源表明,在同一MSC示例中,有两个不同的MSC亚种群,CD106+和CD106−。CD106粘附分子参与和信息联系,因此,扮演着一个重要的角色在MSC-mediated免疫抑制54]。MSC表达CD106表面有更大的il - 1的表达α,il - 1βcox - 2, il - 6,引发、被罩和PGE2和更高的抑制能力CD106相比−细胞。当我们在WJ-MSC样品评估IDO的表达与PBMC coculture后,我们观察到WJ-MSC1 WJ-MSC3表示比WJ-MSC2被罩。此外,治疗后与干扰素-γ,显著降低免疫抑制能力WJ-MSC2 cocultured PBMC3 P5观察。我们也评估CD106表达式;我们的数据表明增加基底的表达CD106 2样品,WJ-MSC1 (13.7% CD106+CD106)和WJ-MSC3 (4.9%+),但低WJ-MSC2 (1.6% CD106+在P5)(数据未显示)。这可能帮助我们理解我们样本的异质性因为有不同的表达式的CD106 WJ-MSC样本。因此,我们的研究结果表明,事实上CD106表达的增加WJ-MSC似乎与伊多免疫调节基因的表达有关。
先前的研究已经发现在基底WJ-MSC条件不表达il - 10 (42,55,56]。符合这些报道,我们发现WJ-MSC单独或与干扰素-刺激γ不产生il - 10。然而,WJ-MSC开始表达il - 10在cocultured PBMC。尽管MSC塑料附着和T细胞悬浮在上层清液,与接触coculture之后,所有的预防措施被WJ-MSC总RNA提取期间试图避免交叉污染。我们相信,即使任何T细胞一直,在少量的WJ-MSC相比显著文化和不会改变结果。
综上所述,我们的研究结果虽然与以前的研究一致(57]表明,MSC抑制T细胞增殖,但这种能力可能会有所不同从细胞到细胞,也是细胞的年龄。
5。结论
我们的结果表明,新生儿,您WJ-MSC显示不同的基底细胞因子mRNA表达和蛋白分泌的模式。WJ-MSC能够抑制CD3+正-后T细胞增殖γ许可,但在不同的层次。此外,T细胞反应也呈现不同的概要文件根据PBMC捐献者。还有待观察,如果标记的细胞衰老可能有助于识别最好的捐助者与接受者的对,一个问题目前仍在研究之中。综上所述,我们的数据表明,治疗使用WJ-MSC可能会受内在变异性在捐助者(WJ-MSC)和接受者(单核细胞和淋巴细胞)。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
安娜·卡拉·戈德堡负责设计和协调目前的研究。费尔南达维埃拉帕拉迪诺和路易斯罗伯托Sardinha进行了实验。费尔南达维埃拉帕拉迪诺,路易斯罗伯托Sardinha,卡拉代理Piccinato负责分析数据。费尔南达维埃拉帕拉迪诺和安娜·卡拉Goldberg写的手稿。费尔南达维埃拉帕拉迪诺,路易斯Roberto Sardinha卡拉德代理Piccinato,和安娜·卡拉·戈德堡负责讨论结果和审查的手稿。
确认
作者要感谢伊希斯Mozetic的贡献,朱莉安娜德·莫拉埃斯罗德里格斯帮助使这个研究成为可能。他们感谢博士Andreia近藤和护士的团队在我们当地公共脐带血库的帮助获得样品。他们感谢她曾马蒂博士和安德里亚Sertie专家技术援助和有见地的建议。FAPESP和斗篷必须占州政府资助研究生奖学金。安娜·卡拉·戈德堡是一个接受者的个人从CNPq奖学金。他们感谢加州大学捐赠者和承认的慷慨支持Ruhman家庭。
补充材料
图1 - WJ-MSC许可IFN-γ抑制CD3 + CD4 + T细胞增殖。WJ-MSC被播种和IFN-γ添加24小时。PBMC与PHA刺激的3天WJ-MSC在场的情况下,使用的比例是1:10 (WJ-MSC: PBMC)。WJ-MSC通道用于实验是P5和P10。T细胞收集,沾染了anti-CD3 anti-CD4, anti-CD8抗体和细胞增殖测定通过流式细胞术使用点击装备。的抑制百分比(Inhib)使用的百分比计算扩散PBMC + PHA + WJ-MSC相比PBMC + PHA的控制。实验进行了一式三份。结果是由平均数±标准差表示。统计上显著差异显示为(*)p < 0.05, p < 0.005(* *)和(* * *)p < 0.0001 (n = 3)。图2 - WJ-MSC许可IFN-γ抑制CD3 + CD8 + T细胞增殖。WJ-MSC被播种和IFN-γ添加24小时。 PBMC were stimulated with PHA for 3 days in the presence of WJ-MSC, the ratio used was 1:10 (WJ-MSC: PBMC). The WJ-MSC passages used in the experiments were P5 and P10. T cells were collected, stained with anti-CD3, anti-CD4, and anti-CD8 antibodies and proliferation was measured by flow cytometry using the Click It Kit. Percentage of inhibition (Inhib) was calculated using the percentage of proliferation of PBMC + PHA + WJ-MSC compared to the control PBMC + PHA. Experiments were performed in triplicate. Results are represented by mean ± SD. Statistically significant differences are shown as (*) p <0.05, (**) p< 0.005 and (***) p<0.0001 (n = 3). Figure 3 - WJ-MCS gene expression of immunomodulatory molecules after IFN-γ stimulation. Cells were seeded and IFN-γ was added for 24 hours. The WJ-MSC passages used in the experiments were P5 and P10. Cells were lysed, total RNA extracted, and real-time PCR performed. IL-1α, IL-1Β, IL-6, IL-8, IL-11, HGF, TGF-Β1, and LIF gene expression from WJ-MSC1, WJ-MSC2 and WJ-MSC3. Gene expression was normalized by housekeeping gene GAPDH and expressed as fold change compared to the control – passage 5 without IFN-γ treatment. Experiments were performed in triplicate. Results are represented as mean ± SD. (n=3).