聚集来自肠道干细胞利基见解在活的有机体内和小说在体外模型

文摘

肠道干细胞位于隐窝的底部和四周都是一个复杂的结构称为利基。这个环境是主要由上皮细胞和基质提供信号控制单元维护、增殖和分化。了解利基调节干细胞的命运通过控制发育的信号通路将帮助我们定义如何干细胞自我更新和分化之间做出选择,以及他们如何保持未分化状态。易处理的在体外试验系统,反映的复杂性在活的有机体内情况但提供更高级别的控制,可能会识别新的球员和机制的关键控制干细胞的功能。肠道干细胞利基聚集的知识在活的有机体内和小说在体外模型可以帮助我们改善治疗肿瘤发生和肠道损伤,使自体小肠移植一个可行的临床实践。

1。介绍

小肠是最积极更新成人组织,它经历了快速周转,以防止破坏压力因素;其组织干细胞是必不可少的组织内稳态的成年有机体(1]。这些未分化细胞驻留的隐窝的底部Lieberkuhn能够产生大量的分化后代以及自我更新。由于他们的相关功能,许多工作已经完成在过去几年来定义的本地化肠道干细胞及其属性。现在有证据表明,至少有两种类型的干细胞在小肠中共存。最好的特点是leucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled受体5-expressing (Lgr5就⁺)干细胞分化大约每24小时,他们分布在终末分化Paneth细胞(2]。的Lgr5就肠道Wnt基因选择的小组目标的限制地穴表达式(柱状基细胞,CBC)和被认定为标志基因的干细胞在小肠和结肠2]。最近发现发现Lgr5就⁺干细胞群不是同质。rna结合蛋白的表达Mex3a标签Lgr5就慢慢地骑车族群⁺isc导致肠道血统。因此,Mex3a Lgr5就定义了一个reserve-like ISC人口⁺室(3]。第二种类型的干细胞是位于+ 4肠隐窝的位置和被称为label-retaining细胞(荣誉奖)时显示长期标签保留在辐照损伤和脉冲与BrdU标记。这些细胞保持静止,作为储备数量,可以引起肠道组织损伤后细胞谱系(4- - - - - -8]。一些报告指出,有一个明显的静止之间的二分法和循环干细胞实际上反映了一个连续的表型由不同阈值的表达式的主要监管机构(例如,信号和/或转录因子),调节干细胞的功能(7,9- - - - - -13]。未来实验更好地识别这些机制和领头的特点+ 4干细胞数量仍然需要为了理解肠道组织诱导再生的能力,反应在辐射诱导组织损伤。在本文中,我们将主要关注在活的有机体内和在体外模型肠CBC干细胞利基。

控制增殖、自我更新和血统的规范在隐窝干细胞被认为是由一个积极监管过程基于信息和cell-stroma交互(14]。ISC利基或微环境由上皮和底层nonepithelial细胞内板propia填充基质,免疫,内皮细胞和神经细胞旁分泌和自分泌信号(图的支持1)。ISC利基也包括细胞外基质(ECM),一个高度动态的结构,不断经历控制改造,由金属蛋白酶负责ECM降解[15]。ECM利基与不同的细胞调节干细胞的命运(16)(图1)。总的来说,小众的组件紧密调节Wnt,切口,表皮生长因子(EGF)、骨形态发生蛋白(BMP) /转化生长因子(TGF)β和刺猬信号通路来维持增殖和分化的平衡(17- - - - - -19]。

干细胞的功能分析及其环境已经受到缺乏合适的在体外系统允许长期文化,直到几年前,唯一可能的策略来分析这种相互作用的潜在作用肠道开发、体内平衡,损伤或肿瘤发生是耗时的组织小鼠模型。例如,Achaete-scute复杂同族体2(Ascl2)据报道,负责控制肠道干细胞的命运通过使用转基因小鼠(20.]。2009年,两组建立了一个三维(3 d)文化模型的新孤立从小鼠小肠和结肠隐窝细胞21- - - - - -23),后来成立了这个方法对人类样本(24,25]。这些化验维持基本crypt-villus生理学和允许长期肠上皮扩张sphere-like瀑样。基底膜基质干细胞是嵌入式,老鼠肉瘤细胞分泌的一种凝胶状的蛋白质混合物包含结构层粘连蛋白等蛋白质,entactin,胶原蛋白结合几个增长刺激必不可少的地穴扩散(Wnt受体激动剂R-spondin1、EGF和BMP抑制剂‘诺金’)。Single-sorted Lgr5就⁺干细胞是足以引起瀑样文化中包含所有分化谱系:Paneth细胞底部的墓穴和enteroendocrine,杯状细胞、肠上皮细胞迁移向上绒毛。重要的是,这些文化使肠道干细胞体外监测功能对自我更新和生产的快速分裂地穴祖细胞和分化血统,因此类似在活的有机体内情况(21]。在本文中,我们将比较在活的有机体内模型最小说在体外技术,将改善在未来几年我们理解干细胞的行为。

2。在活的有机体内模型的干细胞利基

2.1。CBC上皮利基

干细胞需要相邻的上皮细胞的支持来维持其功能。上皮利基调节几个信号级联,Wnt通路的干细胞自我更新的主要监管机构。Wnt通路的基因缺失的主要球员(β连环蛋白Tcf4基因敲除模型)或异位表达分泌Wnt拮抗剂Dickkopf-1 (Dkk1)破坏肠道上皮内稳态,从而导致地下室损失,减少了扩散,和改变分化26- - - - - -28]。同样,overactivation Wnt通路的老鼠,Wnt超表达的受体激动剂屋顶plate-specific spondin 1 (R-spondin1)和R-spondin3或删除腺瘤息肉病杆菌(Apc)、驱动增生和增加肠道干细胞利基市场的扩张29日- - - - - -31日]。Wnt目标基因,EphB2,EphB3及其配体ephrins迁移和扩散的关键协调员在干细胞利基。EphB淘汰赛中显示这些蛋白质确定肠道上皮细胞沿着crypt-villus轴定位(32]。此外,EphB信号促进细胞循环再入祖细胞,导致成年小鼠小肠和结肠的促有丝分裂的活动(33]。

“什么是Wnt信号在肠上皮的主要来源?“细胞分泌Paneth毗邻cbc分泌Wnt3,他们构成的一个重要组成部分小肠干细胞利基。他们已知生产杀菌产品,如溶菌酶和cryptdins / defensins,此外,他们还可以产生TGFα、切口(Dll4)和表皮生长因子因素调节干细胞的维护(34,35]。减少Gfi1 Paneth细胞的数量^−−/小鼠模型,白喉毒素的转基因表达下Paneth特异性cryptdin 2启动子(CR2-tox176),和条件删除Sox9表明,干细胞是巧合的数量减少(34]。一些研究表明,这些细胞是可有可无的小肠内稳态;然而,它也应该确定额外的小鼠模型能够实现总中断Paneth细胞(36]。虽然,这个类型的细胞没有出现在冒号,克拉克的小组发现,杯状细胞和Lgr5就互相交叉⁺干细胞,包含一个独特的cKit / CD117⁺地下室基础分组人口表示缺口配体Delta-like (Dll) 1, Dll4和EGF。在活的有机体内,这结肠cKit人口受Notch信号(37]。后来,聪明的实验室等价描述细胞再生islet-derived家庭成员(Reg) 4⁺表达深深的墓穴分泌(DCS)细胞(称为Paneth /球形细胞)与Lgr5就混在一起的⁺结肠干细胞底部的墓穴。这些细胞也产生Wnt和切口因素支持至关重要的增长和维护信号。在这些老鼠的实验中,这些类型的细胞的烧蚀导致干细胞功能的受损和破坏结肠内稳态的38]。当Paneth或DCS细胞分类Lgr5就在一起⁺细胞,它们提供的信号明显增加从单个干细胞分化和瀑样增长在体外文化(34,38]。新的数据表明,Paneth和DCS细胞也分泌磷脂酶A2 (sPLA2s),通过细胞内激活Yap1抑制Wnt通路。重要的是,这种级联影响干细胞利基在体内平衡(39]。

数个级距小鼠模型的证据这一途径的影响上皮干细胞利基。事实上,Lgr5就⁺干细胞是极度依赖缺口,这依赖于Paneth细胞直接接触和信息的主要来源是Notch信号(40- - - - - -46]。这是同步的情况下失活Dll1和Dll4导致增殖祖细胞的完整转换成postmitotic杯状细胞,相伴Lgr5就的损失⁺SCs [41]。负调控机制Wnt和切口的影响肠道干细胞在肠道很好地显示了田et al . Notch通路阻塞时,它扰乱肠道干细胞功能导致脱抑制Wnt通路,导致misexpression prosecretory基因。然后,衰减的Wnt获救与切口封锁相关的表型(43]。

其他的研究显示富亮氨酸重复和immunoglobulin-like域(Lrig) 1目标,直接Myc基因作为负反馈循环的一部分,调节肠道祖细胞的扩散。Lrig表皮生长因子受体基因敲除小鼠诱发upregulation, ErbB2, ErbB3促进下游内原癌基因的激活肠道干细胞和祖细胞17,47]。表皮生长因子通路影响干细胞的功能通过调节磷酸肌醇3-kinase (PI3K),增殖蛋白激酶(MAPK),和/或蛋白激酶C (PKC)通路等瀑布48]。这些和进一步的研究方向可能导致下一代干细胞疗法。

2.2。CBC Nonepithelial利基

有力的上皮细胞之间的串扰和底层nonepithelial利基要求定义crypt-villus轴。已是不争的间质细胞分泌骨形态发生蛋白拮抗剂如小鬼1和小鬼2底部的隐窝支持划分(49]。因此,BMP信号抑制对肠道上皮细胞更新。的确,鼠标转基因BMP拮抗剂的大脑影响地下室的过度扩张和干细胞数量增加50,51]。此外,遗传模型携带BMPR1A失活或缺乏下游效应器PTEN显示BMP信号的抑制增强AKT激活和Wnt信号增加1,50]。刺猬信号调制也参与这个相声基质最佳管理(52]。Wnt和BMP的梯度扩散途径的配体在细胞分化的地下室作为平衡/扩散。Wnt高地下基地,而BMP通路,抑制增殖,相反的表达模式(1)(图1)。

间充质细胞也分泌Wnt蛋白质,R-spondins已发现在肠道间质(19,53- - - - - -55]。实验通过使用诱导小鼠删除(只有上皮细胞)的豪猪(内质网居民O-acyltransferase必不可少的所有实际上Wnt)的分泌和活动表明,细胞增殖和分化正常,表明上皮Wnt对干细胞是可有可无的维护。然后,它从内部观察到肠间质细胞表达实际上wnt和R-spondin3支持的增长Porcupine-deficient瀑样体外,指出基质的生产实际上wnt可以完全支持小鼠肠道内稳态56]。

这些数据表明,Wnt信号Paneth细胞可以取代基质,所以nonepithelial Wnt通路的激活可能支持肠道干细胞的维护。在这个方向,最近的研究表明,一个族群间充质细胞的winged-helix转录因子Foxl1在维持干细胞是至关重要的。这些细胞产生Wnt因素,及其消融减少地穴增长。然而,有必要更好地识别这个子集间充质细胞(57]。此外,自分泌分泌的ANGPTL2牙龈myofibroblasts影响BMP生产然后调节肠道瀑样增长和规模。此外,肠道损伤Angptl2基因敲除小鼠能够减少cbc和Wnt通路的影响;然而,肠道内稳态[ANGPTL2是可有可无的58)(图1)。

值得注意的是,其他一些细胞群的利基(免疫、内皮细胞和神经细胞)也影响干细胞的行为通过调制不同的信号级联。他们分泌生长因子、细胞因子和配体改变干细胞的命运(19,59]。即将到来的工作是需要显示更详细的理解这个复杂的细胞网络的相互作用和组件。

3所示。在体外ISC利基的模型

3.1。肠道瀑样

动物模型提供了宝贵的见解肠道干细胞的性质和特点,以及微环境的输入控制其行为和构成肠道干细胞(ISC)利基。然而,除了道德和实际考虑,动物性研究遭受了多重限制范围内他们可以解决的科学问题。特别是,小鼠模型通常不承受的动态和多因子的观测和控制所需isc获得全面的理解和他们的利基。进一步,而小鼠的肠道是一个适当的近似人类,几个关键发育和组织学差异存在60),和鼠标研究提供洞察力可能有所欠缺,也与人类有关。在体外模型的ISC利基规避这些问题通过提供一个级别的可访问性和温顺是困难的或不可能实现在活的有机体内。

推动基础研究和治疗目标,研究人员培育出干细胞在体外几十年。十年前,Sasai证明,除了导演多能干细胞承诺向某种血统,因此获得种群的分化细胞,干细胞和他们的后代可以追随他们的先天发育程序和自组织结构,模拟多个器官的组织学和功能方面(61年,62年]。这些器官模拟生成在体外被称为瀑样。

肠道瀑样,或“miniguts”,生成在汉斯聪明的实验室,是最早类型的干细胞瀑样报告(21,24]。佐藤等人表明,肠道隐窝或single-dissociated Lgr5-expressing isc嵌入人工基底膜和提供利基市场信号,包括R-spondin1,‘诺金’,EGF,不仅生存和繁殖,也接受形态发生和分化产生结构近似成人肠:crypt-like预测从球形上皮结构向外辐射,围绕一个中心腔。除了骑自行车isc,住的近端结束crypt-like味蕾,肠道瀑样包含所有肠道细胞类型分化,这表示在本机肠中的比率63年),在空间安排,密切模仿crypt-villus轴的模式。重要的是,这些结构重建的主要几何、建筑,和细胞特征的ISC niche-Lgr5-expressing ISC附加到基底膜状般的水凝胶。isc Paneth细胞数量和比率反映这些表示在活的有机体内,从而形成一个芽结构相似的形状和大小的肠道隐窝。文化protocol-notably小修改,添加Wnt3a-allow文化的成人ISC-derived肠道瀑样(24]。然而,应该强调,这些结构特征圆,囊性结构,从而错过了crypt-like域的小鼠肠道瀑样。

除了成人isc,肠道瀑样已经产生诱导多能干细胞(已经),使用一个协议灵感来自人类胚胎发育(64年]。已经被认为是第一次接受苯丙酸诺龙诱导形成明确的内胚层,随后驶向中期/治疗FGF4和Wnt3a后肠的命运。培养产生的中/后肠球状体在基底膜基质,用于成人isc的文化条件下和隐窝21),引起肠道瀑样。值得注意的是,人类PSC-derived瀑样被组织成墓穴villus-like域,包含主要分化上皮细胞类型,有趣的是,间质鞘包围着,由myofibroblasts和平滑肌细胞,从而概括ISC利基的另一个方面。

除了承诺改革基础和临床研究,作为模型的发展和疾病,药物发现平台和毒性屏幕和组织来源的细胞疗法(23,65年),肠道瀑样补在活的有机体内研究在我们寻求解剖ISC利基和定义机制,发挥其影响干细胞。事实上,证明Paneth细胞构成了ISC利基,正如上面所讨论的,鼠标模型结合肠道瀑样(34,66年]。同样,瀑样在阐明各种基因的角色,包括R-spondin和Lgr4/5 [67年,68年和笨蛋69年,70年ISC命运的]的规定。

常见的格式瀑样文化模型允许相对容易和日常操作的可溶性isc的微环境。除了一组可溶性线索,干细胞利基还包括粘附和机械信号从周围ECM (71年),这可能是一样重要形态因子和生长因子在调节ISC命运(72年- - - - - -75年]。典型的肠道瀑样模型,然而,雇佣Matrigel-an ECM富含蛋白质的水凝胶来自Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma-as 3 d矩阵。基底膜基质,同时清晰地提供必要的胶粘剂和机械信号,而瀑样不可能形成,仍然是一个黑盒中贡献ISC利基。即基底膜基质是一种复杂的多组分混合物ill-fined和变量生物化学和生物物理属性(76年,77年)和特定的组件和机制,这种材料影响ISC的命运尚不明朗。在下面几节中,我们将讨论最近的进步使用生物材料和生物工程方法来克服人工基底膜的限制,获得一个更全面的理解,并引入额外的控制水平ISC利基。

3.2。对合成ISC利基:使用解构本机肠道ECM合成矩阵

合成水凝胶,包括water-swelled聚合物网络,可以使生物相容性和摘要的基本生物信号和用作定义良好的替代动物ECM凝胶,如胶原蛋白和人工基底膜(78年- - - - - -80年]。此外,这些材料提供一个生物“空白”的3 d环境中生物化学和生物物理因素中发现原生组织可以介绍系统和控制方式多样,因此询问细胞的影响和评估潜在的干细胞利基组件。

我们最近利用聚(乙二醇)(挂钩)水凝胶来识别ECM组件控制ISC命运和使用这些知识来构造矩阵定义良好和可调的文化ISC和肠道瀑样81年)(图2)。灵感来自他们的本地化的基底膜老鼠和人类肠道隐窝在活的有机体内(60,74年,82年- - - - - -85年),我们评估的影响层粘连蛋白- 111,collagen-IV,纤连蛋白,透明质酸,和perlecan ISC自我更新、分化、和瀑样在3 d环境中形成水凝胶挂钩。我们发现所有组件增强ISC生存和集落形成;层粘连蛋白- 111、collagen-IV和纤连蛋白显示最强的积极作用。值得注意的是,fibronectin-derived RGD肽(Arg-Gly-Asp)足够支持ISC扩张合成矩阵。另一方面,层粘连蛋白- 111 ISC的共同周期至关重要的自我更新、分化、和驱动瀑样形态发生的形成;没有其他ECM组件测试甚至最小有效。虽然丰富,但我们的研究调查的影响发现只有少数ECM组件在活的有机体内。未来的研究不仅可以系统级测试方法和扩展ECM的数量因素也调查潜在的多个组件的交互影响。先进的高通量方法生成和分析多因子的环境中,那些已经被用于研究其他干细胞系统(86年,87年),似乎适合进一步解构ISC利基的复杂性。

除了可溶性和拴在分子因素,isc在活的有机体内体验物理信号的微环境,包括周围的ECM的机械性能。机械环境是现在公认的主要外在监管多个干细胞系统(88年]。我们理解的潜在物理监管者ISC命运很小,由于执行机械扰动控制的难度在小鼠模型和Matrigel-based瀑样的文化。然而,最近在活的有机体内研究提供线索,机械力可能直接控制ISC扩散在结肠89年]。我们使用机械可调挂钩矩阵检查矩阵力学性能的影响对ISC扩张和瀑样形成(81年和观察到的深远的影响。特别是,我们发现相对僵硬(~ 1 kPa)的剪切模量矩阵最优ISC扩张,而ISC生存和集落形成软矩阵是非常低的。相比之下,ISC分化和瀑样形成被僵硬的矩阵和受损的只发生在软的。我们再次利用的多功能性盯住水凝胶系统阐明分子机制机械对ISC扩张和瀑样形成的影响,而令人惊讶的是还占刚度的看似矛盾的影响这两个过程。特别是,我们发现矩阵力学调节ISC行为通过控制活动Yes-associated蛋白1(废话),这是一个已知的mechanotransducer在其他细胞系统(90年,91年ISC所需,也扩张和瀑样形成(69年,70年,81年]。我们表明,僵硬的矩阵提高ISC集落形成诱导核易位的狂吠single-embedded ISC。然而,继续ISC僵硬的环境导致细胞内扩散限制和压缩,进而导致渐进YAP失活。建立矩阵,最初是足以引起YAP激活但软化僵硬控制的方式,防止细胞压缩获救YAP失活和支持ISC扩张和瀑样的形成。因此,我们使用模块化PEG-based刚度矩阵推出矩阵ISC利基(作为另一个重要组成部分81年]。

3.3。未来的视角:使用微工程学建立稳态ISC利基在体外

一个关键的区别肠道利基在活的有机体内和当前瀑样模型不仅可用利基组件的类型的模式。当前瀑样文化包含基本利基信号,包括Wnt和Notch通路受体激动剂,和BMP抑制剂。然而,这些可溶性组件都包含在细胞培养基,在他们最终达成统一的浓度。相比之下,主监管机构肠道生物学在活的有机体内提出了独特的时空模式,这是至关重要的区域化肠和ISC利基市场的建立。例如,Wnt信号在活的有机体内是由Paneth和牙龈间质细胞,从而限制隐窝的底部,他们是至关重要的维持isc自我更新状态(92年]。骨形成蛋白(BMP)和声波刺猬(嘘)信号,另一方面,绒毛地区丰富,抑制增殖并确保分化为功能性肠上皮细胞(92年]。这种差异表现的可溶性信号可能占肠道瀑样不断扩大结构,与新crypt-like芽形成永远。因此,肠道瀑样目前模拟发展或再生,而不是一个自我平衡的状态,在ISC自我更新被分化和凋亡来建立一个稳定平衡的利基(肠道隐窝)。

工程师们已经开发出一种可溶性的时空模式控制策略在媒体软3 d和系留线索,类似于瀑样所需的矩阵的形成。Microfluidically生成形态梯度可能是最普遍的方法。在这里,3 d水凝胶微观结构使用光刻[93年- - - - - -95年)或烧蚀96年)技术。由此产生的渠道都含有感兴趣的分子,通过渗透凝胶周围形成一个梯度。梯度的形状,因此,生物分子的时空模式交付封装细胞可以通过改变分子的浓度控制在源(英吉利海峡),流量和扩散渗透介质的属性。甚至Photopatterning方法提供更好的空间和时间控制机械和固定分子信号的分布三维凝胶。这些策略使用照明控制局部改变水凝胶的性能,设计含有感光构件(97年- - - - - -99年]。分子变化诱导分子可以用来添加或删除或改变所需的地区的机械刚度,在所需的时间。我们相信,这些和其他方法控制空间和时间的扩散或固定化线索可能用于分离分子的生成区域的本地肠,这反过来又有助于创造一个更为现实在体外模型的稳定,稳态ISC利基(图2)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

引用

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