血小板裂解物：颌骨细胞矿化的更好选择

抽象的

此前，我们通过拉曼光谱证实了无血清培养的颌骨骨膜细胞(JPCs)可形成高质量的矿物质，但矿化程度并不令人满意。在本研究中，我们分析了人血小板裂解液(hPL-)培养的JPCs与fcs培养的JPCs的增殖和矿化潜力。通过细胞阻抗测量，我们检测到与fcs培养的JPCs相比，pl培养的JPCs的数量显著增加了一倍。然而，这一结果并非基于低增殖活性，而是基于PL培养下JPCs形成的细胞大小减少。代谢活性的测定清楚地表明，PL培养下的细胞增殖率显著提高。间充质细胞标志物CD29、CD45、CD73、CD90和CD105水平相当，但在PL培养下MSCA-1水平显著升高。在FCS培养条件下，JPCs仅偶尔矿化，而PL培养条件下矿化潜能显著增强。此外，在5个被分析的患者细胞中，有4个细胞证实添加地塞米松对于pl培养的JPCs的强矿化不再是必要的。我们得出这样的结论:在体外具有血小板裂解物的JPC培养是FCS培养条件的合适替代品，以及使用钳口骨膜细胞开发高质量TE构建体的强大工具。

1.介绍

为了使组织工程构建物的临床应用安全，我们建立了无血清培养条件，并观察到无血清培养的JPCs较早但较弱的矿化潜力[1］.通过拉曼光谱，我们识别并强调了在含fcs和不含fcs培养下细胞外形成的晶体的生化组成的差异[2］.JPC钙化程度的降低以及胶原蛋白产量的显著减少可能导致骨形成不令人满意，从而严重影响未来使用这种细胞类型的组织工程应用的成功。

从细胞培养技术开始到现在，使用胎牛血清仍然代表金标准在体外细胞培养。然而，相对年轻的组织工程领域的发展，包括创新的3D生物打印和微流控方法，导致了标准的长期变化在体外细胞培养技术/媒体。

与此同时，各种公司提供无血清细胞培养基;然而，具有这些介质的一些原代细胞的培养并不琐碎。通常，足够的细胞粘附需要培养皿的涂层，通过无血清培养细胞的细胞外基质的产生通常会降低，并且可以实现更低的细胞密度。如前所述，无血清培养的JPCS显示出降低的矿化电位，一种观察结果可以通过细胞外基质形成的改变来分析。

近年来，人们考虑使用人血小板裂解液作为FCS的合适替代品，从而避免了在细胞治疗过程中动物成分的传播和/或触发免疫反应的问题。在PL制造过程中，血小板被裂解，以实现从血小板颗粒中释放生长因子[3.］.在单采和过滤程序后，细胞碎片和白细胞将被清除[3.- - - - - -5］.

为了评估人血小板裂解物的适用性，用于JPC的体外培养和骨质发生分化，我们在本发明的研究中分析了PL和FCS培养条件下这些细胞的增殖和矿化能力。对于增殖分析，进行了两种完全不同的方法：一方面，通过测量电阻抗测定群体倍增时间，另一方面，进行代谢细胞活性的测量。另外，进行细胞分化实验，分析并定量矿化能力以及通过PL和FCS培养的JPC的间充质干细胞标志物表达。

2.材料和方法

2．1.JPCs的细胞分离与培养

根据当地的道德委员会（批准第194/2008bo2）和获得书面知情同意，汇集了5名捐助者的JPCs均纳入本研究。将钳口骨膜组织用手术刀切割小块，并用Xi型胶原酶（1500u / ml，Sigma-Aldrich，Steinheim，德国）酶活化酶活化90分钟。酶促分离的细胞在DMEM / F12 + 10％胎牛血清（FCS）中膨胀，最多4个通道，直至在通过5的通道5中用于所有分化和增殖比较测定。根据使用的方法，JPC以不同的孔格式培养。对于用于MTT测定的MTT测定的96个孔板和用于Xcelligence测量的电子板，选择每孔2000个细胞的细胞密度。用于差异化实验，6孔板，起始密度为4×10⁴细胞/使用。流式细胞术分析表面抗原表达，将JPCs生长在75 cm²培养瓶，起始密度为5 × 10⁵细胞/瓶。JPCs在含有10% FCS (Sigma-Aldrich, Steinheim，德国)的DMEM/F12 (Invitrogen-BioSource Europe, Nivelles，比利时)或含有1%两性霉素B和青霉素/链霉素(Biochrom，柏林，德国)的10%血小板裂解液中培养。使用过的PL是由临床实验输血医学研究所(Tübingen)提供的，不含肝素，根据没有隔离的时间，被称为研究裂解物。使用胰酶-versene EDTA (1x, Lonza, Basel, Switzerland)传代dmems培养的细胞，每周更换培养基3次。

成骨条件进行了如图所示的实验1- - - - - -6通过添加地塞米松(4μ.m），β-甘油磷酸(10 mM)和l -抗坏血酸2-磷酸(100μ.这些成骨疾病列于表格左列3.如表中所示，除其他实验中，除了其他实验中，还取出了一组或两种骨质骨质增压。

２.２.利用xCELLigence实时监测细胞增殖

使用RTCA DP分析仪（OLS Omni Life Science，Bremen，Germany）进行细胞阻抗的测量。在开始Xcelligence测量之前两小时，将该装置放入培养箱中以在37°C下进行平衡。所需的电子板配备有镀金电极，以实现基于电阻抗的非侵入性监测。执行电阻板测试后，100 μ.l FCS或pl含(10%)DMEM/F12培养基填充到e板中进行背景测量。平板在测量前平衡2小时。在下一步，100μ.l含2000个细胞，移液至e板每孔。在RT孵育半小时后，以一小时的测量间隔启动实时监测。经过一夜的潜伏期后，开始成骨诱导。每2天进行中度改变。提取3个时间点(第5天、第10天、第14天)的数据进行种群倍增次数的计算。种群加倍时间定义为细胞指数加倍所需的时间跨度，并由设备特定的软件计算。

２.３.EZ4U比色法分析细胞活力

使用EZ4U测定（BioMeDica GmbH，Vienna，Vienna，Vienna，Vienna，Vienna，Vienna，Vienna，Vienna，Vienna，Vienna，Vienna，奥地利进行）进行细胞活力测量，该细胞线粒体活性活性衍生衍生物衍生物。在加20时在3个时间点（第5,10天和20天）进行终点测量 μ.L到200μ.l每孔含有DMEM的FCS / PL和4小时的孵育时间。使用ELX800读者（Biotek Instruments，Bad Friedrichshall，Germany）以450nm的波长测量光学密度，其参考波长为630nm。

２.４.含PL和fcs培养条件下JPC数量的统计及生长速率和种群倍增时间的计算

JPC的密度为5×10^3.细胞/厘米²并且在PL和10天后进行细胞计数，并在JPC的胰蛋白酶化后培养的FCS（ 捐赠者， 计数每个患者和培养条件)。基于成骨诱导的JPC不易分离得到单细胞悬液的事实，我们选择体外培养第5天、第7天、第10天为未处理和成骨诱导的JPC早期检测时间点进行细胞计数。

计数4次(每个患者和培养条件各4次)。增长率(1）和人口倍增时间（2）使用以下公式计算： 在哪里增长率为(h⁻¹)，人口倍增时间（h），是细胞群 ，是细胞群 ，和是时间（h）。

对5例患者的生长速率和群体倍增次数取平均值(±标准差)，见表1和表格2,分别。

2.5。PL-和FCS培养的JPC的细胞大小的测量

基于PL培养下电池尺寸的强烈减少的视觉印象，进行了使用细胞预混物和LAS EZ软件的全长细胞尺寸的测量。因此，来自3个捐助者的FCS和PL型JPC（ 每个供体)用于未经处理和成骨培养基条件( 对于每个培养条件)。

2.6。流式细胞术分析表面抗原表达

在未分化的和成骨条件下培养的PL-和FCS培养的JPC从细胞培养烧瓶中分离并离心（3507分钟），并重新悬浮在20ml 10％Gamunex（人免疫球蛋白溶液，Talecris Biothealseputics，Frankfurt，Germany）中，并在4℃下孵育15分钟。与特异性植物（PE-）孵育标记的小鼠抗人类CD29，CD45，CD73，CD90（BD Biosciences Pharmingen，San Diego，USA），CD105（ABD Serotec）和MSCA-1（Macs Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国）在FACS缓冲液（PBS，0.1％BSA，0.1％叠氮化物）中，将细胞在4℃下孵育15分钟。在具有FACS缓冲液的两次额外洗涤步骤后，进行了与Guava Easyte 6ht-2L仪器（Merck Millipore，Darmstadt，德国）的流式细胞术测量。

2.7。通过茜素染料染色量化检测细胞矿化

PL和fcs培养的来自5个供体的JPCs被诱导成骨(每个培养条件6孔板中3孔)24天，细胞单层用4%福尔马林固定20分钟。PBS洗涤两步后，在单分子膜中加入1 ml pH为4.2的40 mM茜素染料溶液摇晃20分钟。然后，用dest水洗涤未结合的染料4次，洗涤15分钟。在单分子膜中加入10%乙酸溶液，摇匀后茜素染料溶解20 min，刮除细胞层。样品在85°C剧烈混合和加热10分钟后，放在冰上冷却5分钟，在20.000离心20分钟。上清液通过加入10%的氢氧化铵来中和。然后在405 nm波长下进行光度钙定量。

2.8。统计分析

对于数据的评价，用均值±标准差表示，对于统计分析，用双尾Student 'st测试。一个值<0.05被认为是显著的。

3.结果

３．１．使用实时监测系统的JPC人口倍增的测量

将JPCs接种到e板培养皿中，在未经处理(Co)和成骨(Ob) PL和FCS培养条件下持续评估细胞阻抗。基于细胞阻抗数据，使用设备专用RTCA软件1.2.1计算3个时间点(第5、10和14天)的细胞倍增(PD)次数。如图所示(患者细胞编号1、2、3和4)1在未分化(Co)条件下，我们检测到几乎所有病例(两个例外:第14天第3号和第10天第4号，均在未分化(Co)条件下)中，pl培养的JPCs在未分化(Co)和成骨(Ob)条件下显著提高了PD倍。这些数据表明，在FCS培养下，JPC的增殖活性显著提高。

３．２．含PL和fcs培养条件下JPC代谢活性的测定

与通过细胞阻抗测量PD时间相比，我们检测到pl培养的JPCs明显更高的代谢活性，这是由基于mtt的方法测量的，图中分别显示了4个分析的患者细胞2．在未分化的（CO）和/或osteogensic培养条件下（OB）下检测到产生的显着差异。

3.3。计算含有含FCS培养条件下的JPC号码的计数

x-CELLigence和代谢活性测定的结果不能准确反映JPC的增殖率。

通过简单的细胞计数，在未处理和/或成骨条件下添加PL培养JPCs，在所有分析时间点(第5、7和10天)，我们获得了显著较高的细胞数量。具有代表性的显微图像如图所示3.．与FCS补充相比，我们在PL补充剂（在未处理的情况下在未处理的9倍和9倍的细胞数下较高的细胞数下的7倍）后检测到最高的增殖率。然而，在体外细胞培养的第7天和第10天，PL补充和FCS补充剂之间的差异似乎变小。尽管如此，我们根据PL补充未处理和破坏性诱导的JPC的平均3倍的较高细胞数。计算的增长率和人口倍增时间（PDT）列于表格中1和2．体外培养5天后，pl培养的JPCs的PDTs明显高于fcs培养的JPCs(3倍)。体外培养7天后，未经处理的JPCs的PDTs增加了5倍，而添加PL后成骨诱导的JPCs的PDTs增加了6倍。再次体外培养10天后，pl培养的JPCs的PDTs比fcs培养的JPCs高3倍。有趣的是，在FCS培养下，pdl的标准偏差非常高，而在PL补充下则是相当中等的偏差。

3．4．含PL和fcs培养条件下JPC细胞大小的分析

xCELLigence所得到的PD时间的结果与我们的观测结果相当矛盾。通过大量细胞计数和显微镜观察，在PL培养下观察到高度增殖细胞的发育，细胞大小明显减小。因此，我们对3例患者(每个患者10例)的JPCs进行了测量，测量条件为未经治疗/骨生成诱导的含PL和fcs培养( 对于每个培养条件)。如图所示4在未处理和骨性诱导细胞的PL培养下检测到显着减少的细胞尺寸。培养的JPC似乎平均比FCS培养细胞小于25％，并且该尺寸的差异在培养条件下实现了显着的值（FCS CO：225.24±58.59与PL CO：165.11±36.40; ；FCS OB：219.08±50.53 VERSUS OB：167.65±35.66; ）.

3.5。含PL和FCS培养条件下的间充质细胞表面标志物表达的流式细胞术分析

在PL和FCS培养条件下，分析了未处理和成骨诱导的JPCs(来自5个供体)中间充质干细胞标记物的表达。平均标记表达式级别如图所示5．在未分化和成骨诱导的JPCs下，PL-和fcs培养的JPCs的CD29、CD73、CD90和CD105表达水平相当。所有细胞的白细胞标记物CD45几乎完全阴性。

MSCA-1细胞表面表达差异有统计学意义。在未分化培养条件下，仅在PL培养第10天检测到较高的MSCA-1水平(Co第5天:FCS 16.82±16.40 vs PL 45.12±35.07;Co第10天:FCS 25.22±23.78 vs PL 64.1±21.45; ）.在成骨培养条件下，在PL培养下的MSCA-1表达的两个分析时间点均检测到较高的JPC阳性程度(Ob第5天:FCS 17.06±14.70 vs PL 60.14±23.48; ；第10天:FCS 55.32±17.53 vs PL 86.32±2.93; ）.

3.6。含PL和fcs培养条件下JPCs的矿化潜力分析

在图中6，与JPCs(4个供体)的FCS培养(左图)相比，具有代表性的显微图像显示，PL(右图)下的磷酸钙沉淀明显更多。随后定量茜素红B染色结果显示钙浓度有显著差异(μ.M，对数标度)，以及成骨培养条件下(Co: FCS 0.025±0.017μ.M与PLUSUS 0.031±0.015 μ.M;Ob: FCS 0.058±0.022μ.M vs PL 4.77±1.74μ.m），如图所示7．

3.7。不同成骨诱导条件下JPC矿化分析

桌子3.显示5种不同的含地塞米松(dexamethasone, dexa)的成骨培养基条件，β甘油磷酸盐(β-糖)和抗坏血酸(抗坏血酸)的不同组合测试矿化诱导来自5个供体(编号1-5)的JPCs。在FCS培养条件下，5个患者细胞中只有3个在加入所有三种成骨诱导物后矿化程度较低。相比之下，pl培养的JPCs在这些条件下矿化，矿化程度要高得多。此外，fcs培养的5号细胞在添加后也可以矿化β-glyc和抗坏血酸。

在Pl培养下，5例患者细胞中的2个强烈矿物质，而不加入抗坏血酸，而它们在加入德克萨时，它们都不在FCS培养下矿化。β-glyc。最有趣的是JPCs的矿化能力β-glyc和抗坏血酸。5个患者细胞中的4个在PL培养下显示出强烈的矿化，而不会加入地塞米松。此外，莫的JPC衍生自第4号也可以在个人添加后矿化β-glyc。

4。讨论

由于动物疾病的监管事务和传播，或导致免疫反应，使用FCS用于未来细胞疗法的间充质基质细胞的体外扩张。为了获得关于血小板裂解物的适用性作为FCS替代颌骨细胞的体外培养，我们在FCS和PL培养下这些细胞的本研究细胞功能和矿化潜力进行了比较。由于无血清培养JPCs选择性地促进了整个细胞群体内的骨催促剂[1]，并对形成的矿物进行生物化学分析，利用拉曼光谱法阐明其高质量[2]，矿化程度并不令人满意。据我们所知，我们在本研究中首次分析了血小板裂解物的高潜力，用于骨膜细胞的体外培养和矿化。

对于人血小板裂解物的加工，已经建立了几种方法，最常见的是，它们的实施是一种或多种冻融循环，以诱导血小板裂解和丰富的生物活性分子的释放[6］.然而，仍然缺乏确定最佳冻融循环次数的系统分析[3.］.在最近的一项研究中，Bernardi和他的同事可以证明，这种生产方法影响了人类PL对骨髓源性间充质干细胞扩展和分化的功效[7］.

我们分析了由多米尼加和MSCS的共同素管定义的细胞表面标记表达[8］.所有标记均显示出与FCS或PL栽培无关的可比水平。唯一的显着差异被称为MSCA-1表面表达，其在PL培养的JPC中的显着较高水平下检测到。我们已经在前一种研究中展示了MSCA-1阳性细胞在整个JPC细胞群体中将骨催化剂标记为[9］.源自二手PL的生长因子可能引发MSCA-1阳性细胞的增殖，因此部分是本文分析的JPC的更高稳定性效力的原因。

在PL培养下，我们观察并量化了细胞大小的显著减少。在JPCs无血清培养下也进行了类似的观察[1］.这一事实通过改变电极板内的电阻明显地影响电池阻抗测量。xCELLigence软件计算的fcs培养的JPCs的PD时间显著高于通过代谢活动测量和显微镜观察得到的PD时间。结果表明，该装置不适用于不同培养基条件下原代细胞的比较，可能影响原代细胞的大小。另外，由设备专用软件计算PD时间应该通过包含考虑单元大小的校正因子来改进。

由于Xcelligence System和MTT测定都不可以在FCS和PL培养下准确地测量细胞增殖的确切差异，我们进行了简单的细胞计数，并在所有分析中检测到显着更高的细胞数（3-9倍）时间点。在PL培养的PL培养后，在5至10天后，在5至10天后，在5-6倍后，将种群倍增时间计算为3倍，5-6倍。

大量研究已经证明hPL对MSCs扩展的潜力[10.]源自脂肪组织[11.- - - - - -13.，脐带血和骨髓[14.，15.］.在本研究中，我们另外证明了HPL用于JPC增殖和矿化的效力。在4种不同培养基的培养和包括FCS，人AB血清和人PL（包括FCS，人AB血清和人PL）的培养下，对MSCs的体外增殖进行了广泛的比较研究。16.］.在添加了pl的培养基中，MSC增殖效果最佳α.MEM。研究人员评估了可促进MSC增殖的可溶性因子库，并建立了一种鸡尾酒，该鸡尾酒与高达1.2%的PL结合，可以取代添加到培养基中的5% hPL。开发的重组人因子鸡尾酒还含有激素，如地塞米松，胰岛素和促甲状腺激素。Fiorentini和其他研究人员证实，地塞米松的加入确保了骨髓间充质干细胞矿化[17.］.有趣的是，在我们的研究中，添加10％HPL可以代替向骨开发培养基中添加地塞米松，以获得JPC的鲁棒矿化，其中来自5个测试的供体中的4个，表明使用的HPL含有可以取代地塞米松的天然糖皮质激素。我们进一步遵守了这一点β-甘油磷酸是必不可少的，当在成骨培养基中缺乏磷酸盐来源时，会导致JPC矿化缺失。

另一个有趣的方面可能是在原代组织分离后，在添加hPL的情况下直接进行体外JPC培养。在本研究中，从第2代开始的冷冻JPCs在添加FCS的条件下被解冻和扩大，直到获得足够的细胞数量用于比较实验。从JPC开始使用PL在体外培养可以加速和改善使用这种细胞类型的组织工程构建体的产生。

综上所述，我们在本研究中证明了补充人血小板裂解液而不是常用的FCS的高潜力在体外JPC的培养与临床组织工程应用。此外，在HPL补充后可能不再需要添加皮质类固醇地塞米松。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

参考文献

1. D. Alexander, M. Rieger, C. Klein, N. Ardjomandi，和S. Reinert，“通过一种特定的无动物培养基从颌骨骨膜中选择骨祖细胞”，普罗斯一体，第8卷，第2期第12条e81674条，2013年。查看在：出版商的网站|谷歌学者
2. E. Brauchle, D. Carvajal Berrio, M. Rieger, K. Schenke-Layland, S. Reinert，和D. Alexander，“颌骨骨膜细胞矿化的拉曼光谱分析”，干细胞国际， vol. 2017, Article ID 1651376, 12页，2017。查看在：出版商的网站|谷歌学者
3. T. Burnouf, D. Strunk, M. B. Koh，和K. Schallmoser，“人血小板裂解液:取代胎牛血清作为人类细胞增殖的金标准?”生物材料，第76卷，第371-387页，2016。查看在：出版商的网站|谷歌学者
4. A. Altaie, H. Owston，和E. Jones，“使用血小板裂解液进行骨再生——我们准备好临床转化了吗?”世界杂志的干细胞，第8卷，第2期2, pp. 47-55, 2016。查看在：出版商的网站|谷歌学者
5. D. T. Shih和T.Furnouf，“人体血小板裂解物补充剂的制备，质量标准和性质体外干细胞扩张。”新的生物技术，第32卷，第2期1, pp. 199-211, 2015。查看在：出版商的网站|谷歌学者
6. K. Schallmoser和D. Strunk，“作为动物无血清人类干细胞培养的有效补充的汇集人类血小板溶解物(pHPL)的制备”，可视化实验杂志， 不。2009年32日。查看在：出版商的网站|谷歌学者
7. M.Bernardi，F.Agstini，K.Chieregato等，“”生产方法影响血小板衍生物在体外扩大间充质基质细胞的功效“转化医学杂志，第15卷，第5期。1，p。90,2017。查看在：谷歌学者
8. M. Dominici，K.Le Blanc，I. Mueller等，“定义多能间充质基质细胞的最小标准”。国际细胞治疗立场陈述的社会，“Cytotherapy，第8卷，第2期4, pp. 315 - 317,2006。查看在：出版商的网站|谷歌学者
9. D.亚历山大，F.Schafer，M. Olbrich等，“人颌骨细胞的MSCA-1 / TNAP选择改善了它们的矿化能力”细胞生理学和生物化学第26卷第2期6，第1073-1080页，2010。查看在：出版商的网站|谷歌学者
10. C. Doucet, I. erou, Y. Zhang等，“血小板裂解物促进间充质干细胞增殖:在细胞治疗应用中动物血清的安全替代品”，细胞生理学杂志，卷。205，没有。2，pp。228-236,2005。查看在：出版商的网站|谷歌学者
11. I. S. Blande, V. Bassaneze, C. lavinii - ramos等，“在添加了自体人血小板裂解液的动物无血清培养基中脂肪组织间充质干细胞的扩增”，输血，卷。49，没有。12，pp。2680-2685,2009。查看在：出版商的网站|谷歌学者
12. B. A. Naaijkens，H.W.Niessen，H.J.Prins等，“人类血小板裂解产物作为胎牛血清替代物改善了人类脂肪衍生的基质细胞培养，用于未来的心脏修复应用，”细胞与组织研究，卷。348，不。1，pp。119-130，2012。查看在：出版商的网站|谷歌学者
13. S. F. Trojahn Kolle, R. S. Oliveri, P. V. Glovinski等人，“汇集人类血小板裂解液与胎牛血清——研究用于临床的人类脂肪组织来源干细胞的增殖率、染色体稳定性和血管生成潜力，”Cytotherapy，第15卷，第5期。9, pp. 1086-1097, 2013。查看在：出版商的网站|谷歌学者
14. M. a . Avanzini, M. E. Bernardo, a . M. Cometa等人，“血小板裂解液存在下的间充质基质细胞的生成:脐带血和骨髓源性祖细胞的表型和功能比较，”Haematologica，卷。94，否。12，PP。1649-1660,2009。查看在：出版商的网站|谷歌学者
15. K. Bepack，A. Hecker，A. Kocaomer等，“胎儿牛血清的人类替代品，用于扩增骨髓间充质基质细胞”干细胞第27卷第2期9，第2331-2341页，2009。查看在：出版商的网站|谷歌学者
16. N.Fekete，M.T. Rojewski，R. Lotfi和H. Schrezenmeier，“Exvivo BeSenchymal基质细胞的基本组分”，组织工程。第C部分，方法，卷。20，没有。2，pp。129-139,2014。查看在：出版商的网站|谷歌学者
17. E. Fiorentini, D. Granchi, E. Leonardi, N. Baldini, and G. Ciapetti，“成骨分化诱导物的影响在体外扩大的成人间充质基质细胞国际人工官杂志，卷。34，不。10，pp。998-1011，2011。查看在：出版商的网站|谷歌学者

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