治疗的潜力Multilineage-Differentiating Stress-Enduring细胞的骨软骨修复大鼠模型

文摘

Multilineage-differentiating stress-enduring(灵感)细胞是胚胎antigen-3 stage-specific (SSEA-3)阳性细胞存在于间充质干细胞(MSC)的人口。缪斯细胞具有多能性胚胎干细胞分化成所有胚芽层。在这项研究中,我们旨在调查缪斯细胞移植骨软骨缺损修复的功效。人类骨髓msc缪斯细胞被隔绝。创建一个骨软骨缺损在免疫缺陷鼠膝沟。之后,细胞注入了,老鼠被分成3组:对照组,大鼠的PBS注射;non-Muse集团由5×10⁴SSEA-3负non-Muse细胞;和缪斯集团由5×10⁴SSEA-3积极缪斯细胞。白色修复组织的大部分平滑同质表面在缪斯组12周治疗后,虽然没有修复组织中检测出控制和non-Muse组。组织学评估显示更好的修复软骨缺损处缪斯组相比其他组在4和12周后治疗。缪斯细胞可能是一个新的有前途的治疗骨软骨缺损的细胞来源。

1。介绍

软骨病变造成关节残疾,由于他们的内在的自我修复能力有限,减少关节的反射函数,相当于重大残疾特别是老年患者(1]。

几个临床试验使用marrow-stimulating技术和骨软骨移植等方法进行,试图改善软骨修复,但成功是有限的。1994年,Brittberg等人进行的第一代细胞疗法命名自体软骨细胞移植(ACI) [2),并使用atelocollagen Ochi等人修改ACI,凝胶结合软骨细胞产生一个好的临床结果(3]。然而,成功仍然是有限的,由于发病率的完整的软骨,去分化,两级手术。

在过去的十年中,间充质干细胞(msc)被广泛用作细胞治疗临床应用;由于这样的事实,他们可以很容易地孤立,他们很可以从不同的组织,他们有一个高膨胀率和扩散。此外,三胚层的分化可广泛执行(4]。异构原油人群的msc、有新颖的多能干细胞,最初是与人类骨髓和皮肤成纤维细胞在细胞应激条件下(低营养或胰蛋白酶孵化)和被称为multilineage-differentiating stress-enduring(灵感)细胞。缪斯细胞具有多能性胚胎干细胞分化成所有胚芽层。这些是双阳性表达CD105和stage-specific胚胎antigen-3 (SSEA-3)。细胞- MSC SSEA-3标记的人口被称为non-Muse细胞(5]。最近,缪斯细胞被隔绝人类脂肪组织由另一个研究小组(6),也隔绝商用人类脂肪干细胞(对asc) [7]。缪斯细胞不仅从人类分离还报道在山羊模型(8]。细胞移植的发展经历了最近的研究使用脂肪和骨头marrow-Muse细胞治疗皮肤溃疡和脑梗塞,分别为(9,10]。在这项研究中,我们旨在阐明人类缪斯细胞的治疗潜力而non-Muse细胞在免疫缺陷鼠修复骨软骨缺损模型。

2。材料和方法

本研究的所有程序按照指南进行动物实验,广岛大学。所有协议被委员会批准和执行实验动物科学研究机构,生物医学科学研究生院,广岛大学。

2.1。细胞来源

购买后人类骨髓msc (hBMSCs;Lonza、巴塞尔、瑞士),他们在37°C,培养公司5%₂在最小的基本媒介鹰(αmem)含10%胎牛血清的边后卫,0.1毫克/毫升卡那霉素和1% Glutamax(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)。hBMSCs是亚文化的比率1:2达到90 - 100%融合后使用0.25% trypsin-ethylenediaminetetraacetic酸。根据之前的协议设计的黑田et al。11),简单地说,hBMSCs被分为缪斯细胞(SSEA-3 +)和non-Muse细胞(SSEA-3−),根据是否有SSEA-3的表情。hBMSCs孵化了SSEA-3抗体(1:100;默克密理博,达姆施塔特,德国),检测到allophycocyanin-conjugated antirat IgM(杰克逊ImmunoResearch西树林,PA)抗体的稀释剂和按特殊顺序排序研究产品FACSAria II (Becton Dickinson,富兰克林湖,新泽西)。

2.2。细胞注入缺陷的网站

本研究进行了免疫缺陷鼠(32膝盖)16日(F344 / NJcl-rnu / rnu)年龄在10周。一个骨软骨缺损(2毫米直径,2毫米深度)成立双边在股骨髌骨沟使用商用金属钻globe-shaped 1毫米直径的顶端。膝关节后立即关闭,老鼠的膝盖被分为3组(表分配不平等1):控制group-PBS注入;non-Muse团体为non-Muse关节内注射细胞(5×10⁴);和缪斯的团体为缪斯关节内注射细胞(5×10⁴)。细胞悬浮在50μPBS的l。

2.3。宏观和组织学评估

在4和12周治疗后,老鼠被牺牲的一个致命剂量的戊巴比妥钠腹腔内注射,然后使用宏观股骨髁部进行评估宏观上评分系统与14个最好的最糟糕的(表和02),由韦恩et al。12,13]。然后,修复组织固定在4%多聚甲醛磷酸缓冲溶液1天,和样本与EDTA脱钙10% (Nacalai Tesque Inc .,京都,日本)4周,之后他们嵌入在石蜡块。样本切成5μ矢状部分。组织学评价,部分被沾染了红色染料O /快速绿色污点(Muto纯化学品有限公司、日本)在卖方生产组织学评分量表(表3)[14]。苏木精和伊红染色(圆))也用于评估修复组织的细胞密度。

2.4。疣状

在4和12周治疗后,部分是用抗原检索预处理试剂(Immunoactive Matsunami玻璃,大阪,日本),沉浸在0.3% H₂O₂阻断内源性过氧化物酶活性。被封锁的部分屏蔽解决方案(蛋白质块无血清;Dako Carpinteria, CA)和孵化鼠单克隆抗体针对I型胶原蛋白(1:250年,福岛第一核电站精细化工、富山、日本)和II型胶原蛋白(1:250年,福岛第一核电站精细化工)。可视化的反应是使用一个avidin-biotin过氧化物酶系统执行(Vectastain精英ABC设备;向量实验室,伯林盖姆,CA),部分颜色有3,3′-diaminobenzidine(过氧化物酶底物装备,矢量实验室Inc .)。

2.5。统计分析

组织学得分被克鲁斯卡尔-沃利斯和Steel-Dwass测试分析,95%的置信区间。的值 被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。宏观研究

修复组织在不被察觉的情况下,利润率和缺陷很容易识别的膝沟控制和non-Muse组。此外,在4和12周,骨关节炎的变化包括相邻的变性软骨增加相比,对照组与缪斯和non-Muse细胞实验小组。在12周,缺陷的深度降低non-Muse组满了褐色组织,而在缪斯集团有证据的完整填写缺陷与白色组织,具有表面光滑均匀的按照周围组织,使其很难清楚地识别缺陷边缘(图1)。宏观上得分,没有显著差异在三组在治疗后4周(控制0.8±0.4,1.3±0.5 non-Muse,和缪斯1.8±0.8)。然而,缪斯的宏观结果组明显优于其他组在12周的治疗后,由缺陷填充(控制0.5±0.6,1.5±0.5 non-Muse,和缪斯10.0±1.5)(图2)。宏观的个人参数表所示4。

3.2。组织学研究结果和评分

牺牲时在控制和non-Muse组,有少量纤维组织,但没有修复组织缺损。缪斯小组4周,有缺陷的部分修复涉及修复软骨软骨下骨不重复的。然而,在12周,骨软骨缺损的修复与完整的软骨下骨修复被确认,但它是覆盖着纤维组织,除了集成,一个骨软骨观察结(图3(a))。在4和12周,以下结果记录基于卖方规模:控制(4 W 26.2±1.6, 12 W 27.8±1.5), non-Muse (4 W 27.2±1.2, 12 W 25±0.6),和缪斯组(4 W 17.4±0.6, 12 W 11.8±2.0)。non-Muse集团产生更好的结果比对照组治疗后12周。此外,缪斯组的得分显著优于其他组4和12周治疗后(图4)。个人卖家评分参数表所示5。在12周)染色显示更高的修复组织细胞密度缪斯组与其他组相比(数字3(b)和3(c))。

3.3。I和II型胶原免疫染色

在4和12周治疗后,受伤部位的表面不沾胶原蛋白II型的组。相比之下,受伤部位的表面沾有胶原蛋白类型我在所有组除了缪斯组在12周。缪斯组在12周,受伤部位布满了胶原蛋白I型和II型负组织(图5)。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们证明了一个缪斯关节内注射细胞来源于hBMSCs改善骨软骨缺损的修复与non-Muse msc。

到目前为止,还没有研究体内评估缪斯的效应细胞作为新一代的细胞疗法尤其对中胚层血统像软骨细胞,骨细胞和脂肪细胞肌肉骨骼疾病。最近的研究表明,缪斯细胞来源于人口对asc悬浮在透明质酸有有益的治疗效果与糖尿病皮肤溃疡的愈合细胞压力条件下(9]。骨marrow-Muse细胞也可以集成到一个梗塞的老鼠大脑和分化成Tuj-1 NeuN-expressing替换丢失的神经元细胞,而non-Muse细胞产生营养因素,没有发现在大脑组织(10]。的内胚层的血统,片瞳等人发现骨marrow-Muse细胞能够修复肝静脉注射后,组件的集成能力部分肝切除术后受伤的区域(15]。目前的研究是第一个报告显示缪斯细胞在骨软骨修复的功效。

先前的研究表明,MSC人口多效性的行动,这使融入受损组织及分化成特定的细胞虽然组织归巢机制是未知的(16]。先前的报道与我们的假设一致显示相同的宏观参数发现,包括缺陷填充和颜色相关修复组织的质量(17]。在目前的研究中,良好的修复的缺陷在缪斯集团证实宏观上,虽然我们的假设是反驳的事实软骨修复并不是令人满意的组织学检查。然而,尽管软骨修复在我们的研究中没有完美的软骨下修复(卖家的软骨下骨修复;在对照组4.0±0,3.0±0 non-Muse组,和0.3±0.5缪斯组);值得广泛开展进一步研究chondrogenic缪斯细胞的潜力,特别是考虑到其独特的属性,如多能性和缺乏畸胎瘤的形成,与iPS和ES细胞。Wakitani等人证明是不可能修复膝关节软骨的已被胚胎干细胞由于肿瘤形成18]。缪斯细胞显示低增生性和端粒酶的活动,以及所谓的山中因素的低表达与iPS细胞相比,这是更明显比non-Muse细胞(5]。这些结果揭示了一个中间的平衡缪斯细胞多能性和畸形发生畸胎瘤的取消信息。

从上述结果,我们推测,骨头marrow-Muse细胞往往表现出成骨的而不是chondrogenic潜力。同样,骨marrow-MSCs更有亲和力成骨的比chondrogenic潜力。与non-Muse细胞,adipose-Muse细胞高效对脂肪细胞,肝细胞或神经感应。此外,与BM -和dermal-Muse细胞,adipose-Muse细胞表现出更高的中胚层的血统,他们表达成骨,肌原性的,和脂肪形成的基因7]。然而,adipose-Muse细胞有一个相对较低的许多基因表达参与组织发展,细胞功能和细胞对asc自行车相比。多能性标记的灵感来自成纤维细胞和骨髓细胞是调节(5]。同时,外胚层的血统是调节相关基因水平的BM - dermal-Muse细胞对于adipose-Muse多细胞(7]。缪斯细胞的分化并不是很高,细胞因子和营养因素结合缪斯细胞导致超过90%的缪斯细胞分化到目标细胞(16]。

必须使用non-Muse细胞生产营养因素催化地要求,为了有一个进步缪斯软骨形成的细胞。先前的研究显示,缪斯细胞来源于对asc分泌大量生长因子如TGF -β、bFGF和TNF -α,特别是在低氧条件下(1%啊₂)[12]。msc的关节内注射是最方便的软骨修复的方法,虽然还没有令人满意的成功,因为缪斯女神的存在细胞没有BM-MSC超过1%的人口分布在整个关节,存活率较低(< 3%)在高压力的环境中,如心肌梗死缺血,中风和实验(19,20.]。在未来,缪斯细胞可能产生比msc由于他们的能力更好的临床结果整合在一个不利的环境中,与msc与他们倾向细胞死亡在同等条件下(21]。因此,进一步的研究是必要的检测准确的缪斯/ non-Muse细胞之间的比率。

通过我们的研究潜在的局限性已经变得明显。少量的动物被用在每组但可以避免进一步的实验。获得从骨髓msc需要一个极其侵入性方法。宏观和组织学评估unthematic因为选取的评估。即便如此,缪斯细胞作为修复细胞,我们不能简单地实现良好的修复与本机。

5。结论

缪斯的关节内注射细胞是一种很有前途的方法来修复骨软骨缺损,特别是软骨下骨由纤维组织。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢Takako Miyata技术支持。作者想表达他们的感谢动物设施的自然科学基础研究和发展中心在广岛大学使用他们的设备。这项工作是支持的部分科研补助金第三Ochi教授从教育部,文化、体育、科技、日本(没有。25253089)。

引用

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