文摘
干细胞的分化是一个重要的战略中有缺陷的组织干细胞的再生治疗。骨形成protein-2 (BMP-2)是一个著名的成骨分化因素刺激干细胞信号通路激活跨膜受体I型和II型。然而,每个位置有一个非常短的半衰期,并可能迅速失去生物活性。因此,BMP交付系统需要利用一个有成骨分化的影响。以前,BMP交付设计和评估成骨分化,专注于运营商和持续交付的每个版本系统。发送模式的影响在细胞培养板成骨分化潜能没有评估。,调查BM-MSCs的交付模式对成骨分化的影响在本研究中,我们制作的自下而上的释放和自上而下发布系统培养板BMP-2交付。同时,我们选择Arg-Gly-Asp——(RGD)共轭海藻酸凝胶BMP-2交付因为海藻酸能够释放BMP-2以持续的方式,它是一种可以使材料的生物相容性。经过7天的文化,培养板的自底向上释放系统显著刺激碱性磷酸人类骨骼marrow-mesenchymal干细胞的活性。本研究强调了干细胞疗法的潜在价值的工具。
1。介绍
一个体外分化过程来获得所需的特定细胞类型的干细胞干细胞疗法。干细胞可以在体外操作在特定条件下,忙向指定的体细胞分化类型(1]。许多研究证明操纵技术通过使用定义媒体直接干细胞分化,基质和生长因子(2]。特别是,骨形成protein-2 (BMP-2)是一个著名的归纳为各种干细胞的成骨分化生长因子(3]。BMP-2 microdomains结合生物细胞表面相关信号通路,如同源受体,诱导成骨分化(4]。因此,BMP-2绑定表面受体的概率应该最大化提高功效的体外成骨分化BMP-2治疗过程中。
蛋白质输送系统是一种很有前途的方法,生物活性的局部和持续交付BMP-2在目标网站(5]。传统方法包括每日增加BMP-2培养基和BMP-2被认为是均匀以及足够的在中(6]。然而,只有少量到达细胞microdomains生物相关信号通路,因为布朗运动的BMP-2培养基。相比之下,BMP-2释放一个矩阵利用蛋白质输送系统可以有效地与培养细胞上的受体结合。然而,这样的交付系统很少关注单层文化传统的技术。相比之前的研究没有BMP-2交付模式的影响干细胞在单层培养系统提供方便和速度来获得大量所需的细胞,骨细胞等。
本研究的目的是调查BMP-2交付模式的影响人类骨骨髓来源间充质干细胞的成骨分化(BM-MSCs)。为此,BMP-2被加载Arg-Gly-Asp (RGD) peptide-conjugated海藻酸水凝胶。我们选择海藻酸作为BMP-2交付的基材在这项研究因为海藻酸有价值的特性,如生物相容性和gel-forming通过使用钙离子交联性质温和的条件。此外,这个反应快速、选择性和产生高收益。因此,这可以用作载体BMP-2为细胞培养和创建一个合适的环境。人类BM-MSCs被使用自下而上和自上而下的诱导释放系统和细胞特征的碱性磷酸酶(ALP)活性和分化。结果可能会提供一个有用的工具为扩大干细胞疗法的潜在应用。
2。方法和材料
2.1。Peptide-Modified藻酸盐的合成
海藻酸钠(= 200000 - 300000;融合生物聚合物、费城、PA)溶解在2 - (N吗啉代)ethanesulfonic酸在室温下(MES)缓冲区(pH = 6.5, 0.3 M氯化钠)。的肽(甘氨酸)4(-arginine-glycine-aspartic acid-alanine) -丝氨酸2赖氨酸(G4RGDASSK)序列(Anygen、首尔、韩国)海藻酸添加到解决方案的存在N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS;皮尔斯,罗克福德,IL)和1-ethyl-3 - (dimethylaminopropyl)碳化二亚胺(EDC, Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)。的peptide-modified藻酸盐被广泛的透析纯化蒸馏水为5天(截止= 3500)和活性炭处理,然后消毒,0.22μm过滤器。取代度(DS)的肽测定肽的数量每100糖醛酸残留在海藻酸链。在这项研究中,DS 0.15 (7]。
2.2。水凝胶的制备和BMP-2封装
纯化和冻干RGD-modified海藻酸溶解在(60毫克)αmem(3毫升)和混合与中国仓鼠卵巢(CHO)细胞衍生重组人类BMP-2(研发系统、明尼阿波利斯、MN)。硫酸钙(卡索4)解决方案(w / v, 120年的20%μL)添加到第二个注射器。两个注射器与女性连接器,和内容迅速混合。一个包含卡索的藻酸盐的解决方案4形成的凝胶在37°C为20分钟。这种凝胶用于打孔光盘(8毫米直径;0.5、1和2毫米厚度)用于发布测试BMP-2和文化的细胞。
2.3。决心RGD-Alginate BMP-2释放动力学的水凝胶光盘
确定的程度BMP-2释放RGD-alginate水凝胶圆盘2% (w / v)为0.5,1和2毫米厚度,BMP-2-loaded支架沉没在24-well文化板块包含1毫升磷酸盐(PBS, pH值7.4;σ)和文化板块在37°C的环境没有风潮。在预定的时候,酶联免疫吸附试验(ELISA)是为了确定BMP-2释放的动力学RGD-alginate水凝胶具有不同粗细的光盘。在每个时间点,上层的收集和文化板块补充新鲜缓冲区。BMP-2在上层清液的量测量使用酶联免疫试剂盒(人类βBMP-2 Duoset;研发系统)。短暂,ELISA板(NUNC Polylabo,斯特拉斯堡,法国)被涂上一层捕获单克隆抗体,然后阻塞与牛血清白蛋白(1 w / v %)和蔗糖(5 w / v %)为1小时。添加了适当稀释后上层清液,bound-BMP-2检测与biotin-conjugated反BMP-2多克隆抗体。Streptavidin-conjugated辣根过氧化物酶被添加到盘子。酶底物(tetramethylbenzidine和过氧化)是治疗20分钟,并通过添加酸性溶液反应停止。 Absorbance was measured at 450 nm range of PowerWave X340 plate reader (Bio-TEK Instrument, Inc., Winooski, VT). The amount of BMP-2 was calculated from a calibration curve based on known concentrations of BMP-2. Experiments were performed with five replicates of each supernatant.
2.4。细胞培养和分化
人类BM-MSCs购买(Lonza有限公司、Walkersville MD)和培养依照先前所描述的方法(8]。简单地说,细胞被维护αmem (Gibco BRL,宏伟的岛,纽约)补充10% (v / v)胎牛血清(的边后卫;Gibco BRL), 2毫米谷酰胺(Gibco BRL)、青霉素100单位/毫升(Gibco BRL)和0.1毫克/毫升链霉素(Gibco BRL)。在这项研究中,使用BM-MSCs后三到五个段落。干细胞标记(CD 44 (95.39%)、CD 73 (93.13%)、CD 90(98.60%)、105(94.71%)和CD)对BM-MSCs分析荧光激活细胞分类(流式细胞仪)分析特征BM-MSCs通道5通过流式细胞术直方图(见附加图在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/7859184)。
确定RGD改性海藻酸,BM-MSCs被播种到海藻酸的表面水凝胶光盘2×10的密度4细胞/厘米2。光盘被安置在24-well文化板块和37°C下5%孵化有限公司2的气氛。24小时后文化时期,光盘用PBS洗净去除nonadhered细胞,然后BM-MSCs坚持的照片光盘表面被使用光学显微镜(奥林巴斯、东京、日本)。BM-MSCs的成骨分化,BM-MSCs RGD-modified海藻酸凝胶光盘包含BMP-2 (2μg /盘)是应用如图2和3。短暂,BM-MSCs被播种到RGD-modified海藻酸凝胶圆盘BMP-2和培养αmem 7天获得自底向上释放系统。构建自顶向下释放系统,BM-MSCs被播种到RGD-modified海藻酸凝胶光盘没有BMP-2 RGD-modified海藻酸水凝胶与BMP-2被安置在Transwell插入光盘。BM-MSCs的粘附后,细胞培养与Transwell包含与BMP-2 RGD-modified藻酸盐凝胶光盘插入αmem 7天,与文化媒体改变了每隔一天。
2.5。高山化验
调查的影响BMP-2交付模式BM-MSCs成骨分化,高山活动作为早期成骨分化标记测量7天后,细胞藻酸盐凝胶光盘染色时使用一个高山染色装备II (Stemgent,列克星敦,MA)根据制造商的指示。每个藻酸盐凝胶圆盘上的细胞与光学显微镜观察和拍摄(尼康,东京,日本)。此外,细胞细胞溶解量化高山活动如前所述[9]。高山活动规范化的蛋白质含量,使用BCA研究蛋白质测定试剂(皮尔斯化学,罗克福德,IL)。在RGD-modified BM-MSCs培养海藻酸没有BMP-2被用作-控制(补充图)。
2.6。统计分析
定量数据表示为意味着±标准差(SD)。统计分析是由单向方差分析(方差分析)与社会科学统计软件包(SPSS)软件(SPSS Inc .,芝加哥,IL)。的值被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。制备RGD-Modified海藻酸水凝胶对人类BM-MSC文化
我们第一次执行RGD序列包含的化学结合GGGGRGDASSK肽藻酸盐凝胶。因为附件容量的细胞低海藻酸凝胶,它是理想的RGD的调查对细胞粘附的影响。镀适用性检测细胞(2×104细胞/厘米2)在未经修改的(控制)和RGD-modified海藻酸凝胶盘(图1(一))。文化的24小时后,修改的组织表明,细胞仍然悬浮,无法坚持(图1 (b))。相反,细胞粘附在RGD-modified组有利和附加的细胞表现出成纤维细胞的形态(图1 (c))。这个结果表明,海藻酸含RGD肽是成功共轭骨干,导致增强细胞粘附的水凝胶圆盘不自然地拥有胶粘剂性质。
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(c)
(d)
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3.2。的动力学分析BMP-2释放RGD-Alginate水凝胶圆盘与不同厚度
接下来,我们装载BMP-2 (2μg /盘)RGD-modified海藻酸凝胶光盘来确定最优厚度将BMP-2有效释放到细胞培养板。RGD-modified藻酸盐凝胶盘与不同厚度(0.5毫米、1.0毫米、2.0毫米)是捏造的,放置在细胞培养板测试BMP-2释放动力学海藻酸凝胶光盘。从0.5毫米的释放BMP-2 thickness-alginate光盘更快比从2.0毫米thickness-alginate光盘(图1 (d))。几乎所有的BMP-2被释放的藻酸盐凝胶光盘前10天内(图1 (e))。重要的是,释放BMP-2从2.0毫米thickness-alginate水凝胶盘持续了12个小时。BMP-2释放率随着海藻酸凝胶圆盘的厚度的增加而减少。此外,0.5毫米光碟,大约90%的最初加载BMP-2被释放在第一个10天。相比之下,2.0毫米光碟,几乎所有的加载BMP-2被释放在第一个10天。目前的发现表明BMP-2释放藻酸盐凝胶盘的速度可以由水凝胶圆盘的厚度控制。盘2.0毫米的厚度提供了有利BMP-2释放动力学的干细胞成骨分化。
3.3。成骨分化的BM-MSCs BMP-2自顶向下和自底向上释放系统交付
为了调查是否BM-MSCs分化受到BMP-2交付的模式,BM-MSCs培养在自顶向下或自底向上释放系统(图2)。类似于标准协议,自顶向下的方法是通过一个结构化向媒体发布BMP-2 8μ米多孔膜。相比之下,自底向上的系统设置为了使RGD-alginate水凝胶是在接触BM-MSCs BMP-2释放。这种方法利用粘附和邻近为了迫使细胞更互动的蛋白质。BM-MSCs成骨分化的分析使用高山染色和高山活动(毫米/蛋白质毫克)。高山染色结果显示,自底向上释放BM-MSCs培养系统集中彩色相比自上而下发布系统(数字2(一个)和2 (b)),证明BM-MSC分化成成骨发生自底向上释放系统比自顶向下释放系统。此外,我们分析了高山活动(毫米/蛋白质mg)在两个版本系统。产生的自下而上的发布系统相比增加蛋白质水平(图自顶向下释放系统2 (c)),确认分化更有利的自下而上的释放系统。
基于这些结果,我们证实,干细胞的分化受到发布的方法。为了进一步研究这个问题,BM-MSCs在同一文化光盘被分成两个部分组成的一个未经处理的RGD-hydrogel BMP2-RGD-hydrogel和修改。正如所料,高山污渍出现密集的一半的光盘收到BMP-2以自下而上的方式(图3(一个))。然而,很可能BMP-2释放自底向上的系统间接进行的未经处理的部分,这可能影响相邻细胞表现出的区别(图3(一个),黄色箭头)。此外,测量高山活动保持更高的直接接触组无论盘(图3 (b))。
4所示。讨论
我们调查的影响的交付模式BMP-2人类BM-MSCs成骨分化。自顶向下释放系统和自底向上的释放系统被用来调查发布BMP-2模式的影响。两个系统的主要区别是BMP-2是如何传递到细胞。
BMP-2相比传统方法治疗的二维细胞培养,自底向上释放系统显示几个优点。首先,BMP-2似乎更迅速,容易培养上的受体结合干细胞比BMP-2从自上而下发布系统发布。在自上而下发布系统(传统方法),在培养基中公布的BMP-2显示布朗运动(10]。因此,只有少量的BMP-2到达受体与成骨细胞分化途径。相比之下,BMP-2释放自底向上的系统可能会触发细胞信号更有效率。虽然BMP-2发布概要文件在两个系统是相等的,干细胞的成骨分化培养系统自下而上的释放与自上而下的文化优于释放系统(图2)。这可以解释为快速绑定BMP-2释放的藻酸盐凝胶对人类BM-MSCs受体。第二,海藻酸凝胶BMP-2水库可能发挥重要作用在交付现场,以确保适当的生物活性。在这项研究中,一半的细胞培养板涂有海藻酸凝胶含有BMP-2(直接系统)和一半的细胞培养板涂上只有海藻酸凝胶没有BMP-2(间接系统)(图3)。BMP-2释放的藻酸盐凝胶直接系统迅速引发成骨分化的干细胞。直接系统诱导高山活动在更大程度上比间接系统。相比之下,干细胞的成骨分化被打断在间接文化网站相比,直接系统。这表明交付模式BMP-2也可能影响成骨分化的功效。
在这项研究中,每日除了BMP-2不是作为对照组。几项研究已经报道成功的成骨分化使用各种BMP-2释放系统(11,12]。在这些研究中,细胞培养与BMP-2文化板块每天添加到培养基作为对照组BMP-2释放系统的评价。每日增加BMP-2是基于假设的总浓度BMP-2保持不变。然而,实际BMP-2文化媒体不同的BMP-2发布概要文件。因此,传统的控制可能是低效的测试影响成骨分化BMP-2的交付模式。相反,我们有意与平等对照组使用发布概要文件(自上而下发布系统),以避免更平等的比较复杂的系统性因素的两种类型的BMP-2交付模式。
根据类型的细胞,BMP-2参与hedgehog途径,将生长因子信号通路,cytokine-cytokine受体相互作用[13,14]。先前的研究已经报告了其参与胚外内胚层派生从人类胚胎干细胞和chondrogenic msc的承诺以及心肌细胞收缩性(15- - - - - -17]。虽然BMP-2相对广泛的作用,在间充质基质细胞,这是一个重要因素,为成骨的承诺ligand-dependent的方式通过SMAD[激活下游基因调控18)(图4)。因此,我们相信,成骨分化的增强是由于成骨活性的增加BM-MSCs推测BMP-2绑定的增强而引起的自底向上的释放系统。未来的研究需要阐明BMP-2绑定效应的分子机制在自底向上释放系统。
总之,成骨分化BM-MSCs明显增强的自底向上的释放系统相比的自顶向下释放系统。这些结果表明,自下而上的发布系统可以作为干细胞的分化刺激器。因此,这些发现可能是有用的应用程序涉及干细胞文化或细胞分化研究,旨在推进公用事业领域的干细胞疗法。
信息披露
早期版本的这项工作提出了一个抽象的聚合物在韩国社会2014年秋季会议。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
Taekhee荣格和约翰·李圆了同样这项工作作为第一作者。
确认
这项研究支持由下一代BioGreen 21农村发展计划管理(PJ009956)研究中心通过农业畜牧产品高质量,农业部、食品和农村事务部(715003071 hd120),以及生物与医学技术发展计划的国家研究基金会由韩国政府资助,MSIP (nrf - 2016 m3a9b4919616)。
补充材料
在补充图1,BM-MSCs培养五个段落,我们随后检查代表MSC标记流式细胞仪分析。MSC特定标记,CD 44 (95.39%)、CD 73 (93.13%)、CD 90(98.60%)、105(94.71%)和CD,人口在培养强烈的表达。这个结果表明表达的细胞分化相关MSC标记表明细胞拥有MSC的特点。补充图2,因为msc诱导向成骨的命运被强烈表达高山,BCA蛋白质化验试剂用于高山活动正常化的蛋白质含量检查。BM-MSCs培养没有BMP-2 RGD-modified藻酸盐被用作消极的控制。