文摘

WD40-repeat突变蛋白62 (WDR62)通常与主头小畸型和其他发育皮质畸形有关。我们使用人类多能干细胞(hPSC)检查WDR62函数在人类早期的人类corticogenesis神经分化和模型。Neurospheres缺乏WDR62表达式显示中间祖标记的表达减少,TBR2,胶质标记,S100β。相比之下,c-Jun n端激酶抑制物)信号在神经分化诱导upregulation hPSC WDR62增加相应的神经和神经胶质祖标记,分别PAX6和EAAT1。这些发现可能意味着一个角色的WDR62指定中间神经和神经胶质祖细胞在人类多能干细胞分化。

1。介绍

WD40-repeat蛋白62 (WDR62)是常见的基因突变导致的人类常染色体隐性主头小畸型(MCPH)为特征的神经发育障碍显著降低出生时大脑皮层大小(1]。WDR62突变也涉及其他皮质畸形,表明多效性的功能在大脑发育(2,3]。Wdr62 microtubule-associated脚手架蛋白是由分层c-Jun n端激酶(物)信号模块4,5]。Wdr62涉及胚胎小鼠的大脑和人类细胞系的研究显示其动态细胞随周期变动的锭杆定位和有丝分裂功能(3,6]。击倒Wdr62表达在老鼠胚胎扰乱神经祖细胞的细胞分裂心室(VZ)和subventricular (SVZ)区,导致减少增殖和过早分化(4]。其他研究Wdr62突变小鼠神经祖细胞的减少归因于增加所导致的细胞死亡细胞周期阻滞而不是改变分化的祖细胞(7]。综上所述,这些研究支持WDR62在神经发生在大脑发育的作用虽然WDR62函数的精确作用和范围仍不清楚(2- - - - - -4,8,9]。

在研究老鼠和永生化细胞系大大有助于我们理解WDR62在神经发生的作用,进一步研究其功能是很重要的人体模型的上下文中系统。人类多能干细胞(hPSC)可能利用模型过程与皮质相关开发和相关体外神经发育障碍(10,11]。因此,在这里,我们调查了在规范WDR62神经的作用,通过使用一个星形胶质细胞祖细胞诱导WDR62-depleted hPSC线和实施完善的协议产生皮质神经和神经胶质祖细胞。的差别我们的研究结果表明,对这些WDR62导致减少中间神经和神经胶质祖细胞来自hPSC。与这些研究结果一致,具体的抑制物WDR62 hPSC-derived神经文化增强表达的信号,引起神经和神经胶质祖细胞的增加。总的来说,这些发现表明,WDR62需要规范的早期神经和神经胶质祖细胞作用物信号的负调节WDR62 hPSC。

2。材料和方法

2.1。维护hPSC与一代的shRNA击倒

这个项目是墨尔本大学的人类伦理委员会批准(1545384)。H9 (WA-09 WiCell)细胞株培养馈线免费使用MTeSR-1 vitronectin-coated盘子上定义媒体根据制造商的指示(干细胞技术)和维持在37°C 5%的二氧化碳。殖民地机械切割每7天,转移到新涂层板。细胞培养媒体每天都改变了。

shRNA击倒了使用SMARTchoice诱导慢病毒小发夹RNA(成分)针对人类WDR62 (H15) (Dharmacon、目录号:VSH6376)。H9细胞被镀在器官培养皿和转导按照制造商的说明我的0.5和0.5选择使用μ克/毫升嘌呤霉素。在第七天,转导hPSC (hPSC-H15)暂时接受1μg / ml强力霉素(阿霉素)诱导表达GFP和进一步执行手动选择。

2.2。神经和神经胶质分化

神经诱导H9细胞和/或WDR62 shRNA-transduced H9细胞被设置为所描述的德纳姆Dottori,通过一些轻微的修改(12]。hPSC和/或hPSC-H15机械切割成碎片大约0.5毫米宽度和转移到laminin-coated机关文化板块N2B27中包含1:1的混合neurobasal中等DMEM / F12培养基,补充胰岛素/转铁蛋白硒,1% 1% N2, 1% retinol-free B27, 0.3%葡萄糖,25 U /毫升青霉素,25岁μg / ml链霉素(生命技术/表达载体)。皮质神经元分化的小分子抑制剂SB431542 (10μM, Tocris)和‘诺金’(500 ng / ml, Peprotech)被添加到媒体第一个7天之后,添加纤维母细胞生长因子(FGF) (20 ng / ml, Peprotech)剩下的7天。神经诱导的2周后,神经祖细胞机械收获,在悬浮培养的神经基础媒体(现)补充FGF (20 ng / ml, Peprotech)和表皮生长因子(EGF) (20 ng / ml, Peprotech)促进neurosphere (NSP)形成13]。神经胶质细胞分化,神经感应块殖民地被镀到fibronectin-coated器官培养板包含非补充FGF (20 ng / ml, Peprotech)、表皮生长因子(20 ng / ml, Peprotech)和PDGF-AA (20 ng / ml, Peprotech)额外一周接着一周没有补充。0.5 shRNA-transduced hPSC细胞不断地对待μ克/毫升嘌呤霉素。阿霉素治疗开始从一开始就没有阿霉素的感应控制并行设置。媒体改变了每隔一天。在实验结束时,样本固定和准备疣状或处理实时定量PCR (Q-PCR)表达分析。

2.3。疣状

细胞层和NSPs固定在4% PFA在4°C为20分钟,然后洗在PBS短暂。NSPs是嵌入在10月Tissue-Tek化合物(Labtek)和减少15岁μ米在低温恒温器,部分放在superfrost幻灯片。在PBS洗涤后,部分或文化菜是permeabilized PBS triton - x - 100 0.1% (PBT) 5分钟,然后屏蔽10%胎牛血清中PBT在室温下为60分钟。样本然后孵化主要抗体(稀释块缓冲区)一夜之间在4°C。以下主要使用抗体:山羊anti-SOX2(1: 200年,研发系统),鼠标anti-PAX6(1: 80年,DSHB),兔子anti-TBR2(1: 1000年,Chemicon),鼠标anti-TUJ1(1: 1000年,微孔),兔子anti-KI67(1: 600年,Abcam),和鼠标anti-S100β(1:500年,σ)。三个5分钟洗在PBT, ALEXA萤石二级抗体(生命技术/英杰公司)(1:1000稀释块缓冲区)申请1小时在室温下。所有样品都是复染色与49岁的6-diamidino-2-phenylindole (DAPI;1μg / ml, Sigma-Aldrich)。样本然后安装到玻璃幻灯片5μl (moviol水mountant其次是观察和图像捕获蔡司Axio观察者z1荧光显微镜下用禅宗成像软件。

2.4。基因表达分析

细胞收获和加工使用PureLink总RNA提取RNA迷你工具(技术)。RNA质量检查在NanoDrop 2000分光光度计(热科学)_260/280比从1.95到2.05不等。2μg的RNA被用来合成第一链cDNA使用SensiFAST互补脱氧核糖核酸合成装备(Bioline)。Q-PCR反应和数据收集进行ViiA7实时PCR系统(技术)使用普遍掌握混合(应用生物系统公司),和原始数据导出到Microsoft Excel进行进一步分析。循环参数如下:50°C 2分钟,10分钟95°C激活DNA聚合酶,然后40 95°C的周期为15秒,1分钟和60°C。ΔCT值是通过规范化的意思是三个内部参考GAPDH基因,hmb, ELF1。接下来,ΔΔCT值是通过规范化ΔCT值适当的控制样本。相对基因表达值(褶皱变化)然后使用2计算^−∆∆CT方法(14]。统计显著性进行了测试使用未配对t以及和单向方差分析与事后Bonferroni多重比较。

2.5。规划的尺寸测量

比较大小的hPSC-H15-derived NSPs接受阿霉素和强力霉素治疗,为每一个独立的实验(),brightfield图像被随机采取至少3 NSPs每个条件使用蔡司Axio观察者z1荧光显微镜和禅宗成像软件。所有的图片都在为每个实验一致的放大。ImageJ软件被用来估计每个NSP的最大直径,简而言之,通过手动绘制一条直线的长度在规划的中心和中记录μm。统计显著性测试是使用Mann-Whitney执行测试。

2.6。S100的量化β

WDR62 shRNA-transduced hPSC接受神经胶质分化了两周,然后对S100免疫荧光染色处理β如上所述。S100β阳性神经元在强力霉素和强力霉素治疗治疗进行分析从至少3复制。采用20 x目标图像进行分析蔡司Axio观察者z1荧光显微镜和禅宗成像软件。ImageJ软件被用来量化综合S100的密度β染色中为每个复制图像。阿霉素治疗的结果比较的标准化的结果没有强力霉素组(100%)。双尾t以及用于确定统计学意义。

2.7。物抑制

物抑制剂EMD得到微孔(产品目录号:420135),重组在二甲亚砜(DMSO) 50 mM,并使用在50岁μm . H9神经又各自从第0天物抑制剂处理的神经感应,和DMSO-treated控制一直是并行设置。实验至少进行三次。文化被收获Q-PCR分析。双尾t以及用于确定统计学意义。

3所示。结果

3.1。WDR62表达在神经感应与早期神经祖细胞

确定WDR62在hPSC神经分化,调节内源性WDR62表达式是衡量Q-PCR hPSC神经诱导和分化阶段期间神经和神经胶质祖细胞。协议用于神经感应双重SMAD抑制涉及治疗hPSC成骨蛋白的抑制剂和/或苯丙酸诺龙/节点信号通路,‘诺金’,和SB431542,分别为7天之后,FGF 7天(15]。hPSC-derived祖细胞在rosette-like组织形态表达端脑的初祖PAX6标志和中间祖TBR2标志(图1)。神经祖细胞机械收获和培养悬浮和FGF补充EGF一周形成规划的总量。NSPs培养一周由早期的种群混合中间和postmitotic神经和神经胶质祖细胞的表达SOX2, PAX6, TBR2, TUJ1和S100β(图1)[16,17]。

WDR62表达显著调节在早期阶段的神经感应在第七天(方差分析,,),co-coincided SOX2发病和PAX6表达式(图1 (f))。WDR62表达当时年底显著降低神经感应(方差分析,,),还在规划阶段(方差分析,,),这与在TBR2表达式,TUJ1, EAAT1和S100β(图1 (f))。这些发现表明WDR62调节hPSC神经感应,发病的关联与早期神经祖细胞的规范。

3.2。诱导期间击倒WDR62表达式hPSC神经感应

鉴于WDR62表达调节神经诱导的早期阶段,我们探讨了减少hPSC WDR62表情神经分化的影响。这些分析,hPSC转导与WDR62 Dox-inducible慢病毒成分构造(H15) coexpress GFP。使用双重SMAD hPSC-H15接受神经诱导和分化抑制协议,如前所述,要么存在与否的强力霉素(阿霉素/不强力霉素)(图2)。阿霉素治疗有效地诱导普遍GFP表达hPSC-H15-derived神经祖细胞在神经诱导阶段,和GFP表达1-week-old NSPs(图中维护2 (b))。在神经诱导阶段,Dox-treated hPSC-H15表现出显著的减少意味着在WDR62的表达(40%)相对于没有强力霉素治疗(双尾t以及,,)(图2 (c))。同样在该规划阶段,WDR62表达降低了70%以上Dox-treated hPSC-H15-derived NSPs相比没有Dox-treated NSPs(双尾t以及,,)(图2 (c))。尽管NSPs生成与减少WDR62条件表达式,它们的大小明显小于无Dox-treated控制(Mann-WhitneyU测试中,)(图2 (d)网上,补充表1https://doi.org/10.1155/2017/7848932)。总的来说,这些结果证实,阿霉素诱导WDR62成分是有效减少内源性WDR62表达hPSC-derived神经干细胞和祖细胞。

3.3。期间Downregulation WDR62神经分化早期神经和神经胶质祖细胞减少

做进一步调查的观察效果WDR62损耗导致新型干法粉碎,我们分析的表达神经干细胞和祖标记Dox-treated hPSC-H15文化由Q-PCR神经诱导和分化的规划阶段。我们没有观察到显著的增殖标记基因表达的改变KI67或细胞死亡标记半胱天冬酶3 (CASP3)减少WDR62表达式(数字3(一个)和3 (b))。表达mitotically活跃的神经祖细胞标记,SOX2 PAX6,也不会显著改变(数据3(一个)和3 (b))。相比之下,TBR2,标记中间神经祖细胞,胶质S100标志β在神经感应文化既显著降低(双尾检验,TBR2和对S100β,n≥3)和NSPs(双尾t以及,TBR2和对S100β,n≥3)后Dox-induced WDR62击倒(数字3(一个)和3 (b))。有趣的是,减少TBR2和WDR62表达NSPs与增加的趋势TUJ1表达式,postmitotic神经元(图的标记3 (b))。综上所述,这些研究结果表明在hPSC WDR62神经分化的作用,特别是在hPSC规范早期神经和神经胶质祖细胞。

3.4。WDR62胶质种群分化所需

进一步确定减少WDR62表达影响的分化hPSC胶质祖细胞,hPSC-H15分化神经胶质在强力霉素和强力霉素治疗条件。神经胶质差异化协议类似于上述神经感应协议;然而14天后细胞是通过在纤连蛋白底物与FGF媒体补充,EGF, PDGF-AA一周后跟媒体没有补充了一个星期(图4(一))。发现Dox-treated胶质分化文化,WDR62表达减少,导致S100的数量显著下降β-阳性细胞相比,控制(双尾t以及,,)(图4)。这一发现进一步支持的要求WDR62 hPSC胶质细胞分化的早期阶段。

3.5。抑制物增强WDR62和PAX6的表达

进一步调查机制WDR62函数,我们检查物活动的贡献WDR62 /物信号交互以前在皮质的发展发挥重要作用[4,18]。因此,我们在分化系统减毒物活动kinase-specific化学抑制剂(物抑制剂八世,50毫米)在剂量之前证明减毒WDR62 /物信号下游底物(6]。然后我们评估WDR62和候选基因的表达与神经和神经胶质分化,细胞死亡,由Q-PCR扩散。我们的结果显示显著增强表达WDR62(双尾t以及,,)物抑制后,而DMSO-treated控制样品(图5)。这是伴随着显著增加PAX6(双尾的表情t以及,,)和功能性神经胶质标记EAAT1(双尾t以及,,)(图5)。此外,有一个趋势S100增加β物抑制。这些发现符合物被消极的监管机构的报告WDR62有丝分裂功能和表达和符合的角色WDR62神经——gliogenesis [6]。

4所示。讨论

这项研究是第一个利用hPSC-based造型系统调查WDR62在神经发生的作用。我们表明,WDR62 hPSC-derived神经祖细胞中表达最高的表达发生在神经感应与早期的发病早期神经祖标记SOX2和PAX6。这与先前的报道是一致的描述Wdr62表达式在VZ前兆进行有丝分裂,SVZ,皮质板(4,8]。其他人也在postmitotic神经元表达WDR62报道(7]。在这里,我们表明,击倒WDR62表达hPSC-derived神经文化导致改变分化早期神经和神经胶质祖细胞由TBR2和S100的表达式表示β。有关这些发现,以往的研究Wdr62突变小鼠皮层缺陷即PAX6和Tbr2表达显著降低皮质区域内;然而,没有明显差异Tbr2表达式内专门VZ地区(4,7]。伴随着这种消耗的神经祖细胞,一项研究观察细胞增殖减少和增加过早神经元分化而另一项研究报道有丝分裂延迟和增加细胞死亡(4,7]。这些研究结果相比,Jayaraman等人发现TBR2比率的增加⁺/ SOX2⁺祖细胞和增加Ki67⁺PAX6⁻细胞在胚胎第14天除了VZ和SVZs Wdr62零老鼠和降低整体皮质厚度没有增加细胞死亡的证据。这使得作者得出这样的结论:损失Wdr62导致细胞命运改变特别是从PAX6 Tbr2祖细胞无细胞死亡,导致过早分层PAX6祖细胞从登陆19]。在我们的研究中,我们没有观察到任何差异的标记细胞增殖或细胞死亡在WDR62击倒hPSC文化,尽管NSP规模较小,这表明只有祖细胞各亚群的差别的影响对这些WDR62。根据这些结果,我们建议WDR62规范中可能发挥重要作用的早期神经和神经胶质祖细胞。

在皮质的发展过程中,PAX6放射状胶质细胞表达驻留在VZ进行自我更新和/或分化产生中间神经胶质祖细胞,postmitotic皮质神经元或神经胶质20.- - - - - -23]。中间神经祖细胞被Tbr2的表达,它内部的分裂和分化SVZ产生更多的神经元(20.- - - - - -22,24- - - - - -26]。类似于大脑皮层神经元,星形胶质细胞产生直接从径向神经胶质或间接从在SVZ神经胶质限制中间祖细胞(27,28]。末皮质的发展,大多数的放射状胶质细胞星形胶质细胞表达S100失去身份来区分β(27,29日,30.]。鉴于这种知识,也许WDR62在过渡过程中发挥作用hPSC-derived PAX6神经前体中间神经祖细胞和胶质血统。类似于放射状胶质细胞,可能有hPSC-derived PAX6前体绕过中间TBR2祖的亚种群阶段,直接区分postmitotic神经元,这或许可以解释为什么没有明显变化WDR62击倒NSPs TUJ1表达式。另外,或除了WDR62可能扮演一个角色在中间神经/胶质祖细胞自我更新,但不是在自我更新PAX6神经前体细胞。WDR62表达和功能的进一步深入研究需要确定的潜在机制WDR62调节hPSC神经分化。总的来说,这项研究的结果阐明人类corticogenesis WDR62的角色。

WDR62有丝分裂函数有关的活动物(6,9]。它已经表明,WDR62新兵JNK1专门纺锤体微管在有丝分裂期间,相互地JNK1调节WDR62细胞间分布。具体地说,物的磷酸化WDR62消极与纺锤体微管调节WDR62协会(6]。由于抑制物的信号,它表明WDR62微管协会持续无论细胞周期阶段(6]。我们的研究结果表明,物活动不需要WDR62函数关于指定神经和神经胶质祖细胞来自hPSC。相比之下,JNK-specific抑制剂治疗增加WDR62表达hPSC-derived神经祖细胞和与此同时增强表达PAX6-positive细胞和星形胶质细胞功能EAAT1标志。因此,我们的研究结果表明,物活动也可能负调节WDR62的表达水平。然而,我们的研究在hPSC-derived神经祖细胞表明WDR62表达的规范需要特定的神经和神经胶质血统,这似乎并不需要物信号活动,这一发现与啮齿动物的研究。

5。结论

这项研究表明hPSC作为互补的造型系统的鲁棒性研究的发展角色候选基因主要涉及大脑发育障碍。的差别我们的研究结果表明,对这些WDR62导致减少中间神经和神经胶质祖细胞来自hPSC。与这些研究结果一致,具体的抑制物在hPSC-derived神经文化增强表达式WDR62,引起神经和神经胶质祖细胞的增加。总的来说,这些发现表明,WDR62需要规范的早期hPSC-derived神经和神经胶质祖细胞。

的利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益。

作者的贡献

多米尼克Chi-Hung Ng和Mirella Dottori是相等的资深作者。

确认

本研究支持的墨尔本大学澳大利亚研究委员会未来的奖学金,和沙特阿拉伯的高等教育(沙特阿拉伯)。

补充材料