文摘

间充质干细胞(msc)已确定在人类口腔组织。牙髓干细胞(DPSCs)在MSC家庭分类,是多功能的,可以从成人牙齿,孤立的,并已被证明能够区分,在特定条件下,在不同的细胞类型包括成骨细胞。在这项工作中,我们研究如何控制DPSCs向成骨细胞的分化过程。最近的文献数据归因于相关的核受体1 (NURR1),仍然在成骨细胞分化澄清的作用,而NURR1主要是参与了多巴胺能神经元分化和活动。因此,为了验证如果NURR1 DPSC成骨细胞分化的作用,我们沉默相比,它在所有的流程和控制的主要成骨细胞的标记物的表达文化。我们的研究结果表明,抑制NURR1显著增加成骨细胞标记胶原蛋白的表达我和碱性磷酸酶。此外,在长时间的文化中,矿物基质沉积在NURR1-silenced强烈增强文化。这些结果表明,NURR1在交换中发挥着关键作用DPSC向成骨细胞分化,而不是神经甚至其他细胞系。总之,DPSCs的差别代表osteoblast-like细胞的来源和对这些NURR1强烈促使他们向osteoblastogenesis分化过程。

1。介绍

再生医学是增加兴趣使用成人干细胞再生的矿化组织。具体来说,各种各样的产后msc已确定在牙科组织在过去的十年。特别是DPSCs可以从成人的牙髓,孤立的组织包含dentinogenic血统,因此生理上的祖细胞参与牙质的修复过程1- - - - - -3]。尽管牙质/纸浆的再生过程复杂的原因还不是很清楚,众所周知,修复牙本质是被作为一个保护屏障的纸浆由于外伤或腔(4,5]。DPSCs通常是静止的,但伤害导致成牙质细胞死亡后,他们可以恢复其生物活性。因此,为了刺激位于pulp-dentin接口,DPSCs招募网站的病变和分化成成合成修复象牙质和保护牙齿的生命力。以前的工作表明,DPSCs可以考虑成牙质细胞/成骨细胞前体,因为他们表达成骨的标记和响应许多生长因子对骨的/牙原性的分化(6- - - - - -8]。此外,牙髓细胞能够形成矿物矩阵结节(2,9- - - - - -11]。事实上,它已经表明,DPSCs可以向多个细胞谱系分化;因此,当刺激与适当的文化媒体,他们显示能力分化成位于,adipocyte-like, osteoblast-like细胞(12- - - - - -17]。一致,更多的研究表明,DPSCs,适当的刺激时,可以被诱导分化成neuronal-like和胶质细胞表达的典型标志巢蛋白和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP) [18- - - - - -21]。此外,DPSCs显示分化成osteoblast-like细胞,表达的主要骨基质蛋白胶原蛋白我(Col1),典型的成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)的酶,并形成的矿化结节矩阵(2,15,22- - - - - -24]。这表明不同细分市场的祖细胞和干细胞的存在在纸浆multipotency分化,可以截获并被适当的刺激。形态特征的DPSCs相比从骨髓间充质干细胞(msc);(比较显示很多相似之处2,13];也相关基因表达谱的两个细胞群是非常相似的(25- - - - - -27]。DPSCs的分化潜能的发现使得科学家们认为他们作为替代的产后干细胞来源。特别是,分化成osteoblast-like细胞的能力,能够矿床矿化矩阵,彻底改变了牙科研究打开了新的视角重建手术和钙化组织生物工程。文献数据牙齿干细胞非常有前途,美国公司,与美国食品和药物管理局(FDA)批准,提供服务的隔离和保护这些细胞疾病的发作会使他们在治疗中使用有益。虽然DPSCs的可塑性和能力产生许多不同的细胞系是已知,哪些基因参与multilineage分化能力的细胞和成骨细胞的分化过程尚不清楚,需要深入调查,因为osteoblastogenesis受到许多细胞因子和基因(28,29日]。我们在前一个工作报告DPSCs表达NURR1核受体在基底和成骨的条件(23),一个令人惊讶的发现,考虑到NURR1核类固醇/甲状腺受体超家族成员,主要表达在中枢神经系统,对多巴胺神经元的生存和发展功能至关重要的大脑腹侧核(30.]。的确,NURR1已经描述的表达在DPSCs和棚屋,但受体的作用主要是由于在分化向神经细胞表型(19,31日- - - - - -33]。实际上,工作报告,在小鼠颅顶的成骨细胞和MC3T3-E1 NURR1增加成骨细胞的标记物的表达(34,35]。相反,最近的一个工作描述NURR1和之间的相声β连环蛋白在NURR1抑制β-catenin-mediated表达和β连环蛋白能够抑制NURR1[的转录活动36]。到目前为止,在DPSCs NURR1表达,但在成骨分化的作用仍有争议,需要更多的调查。因此,建立DPSCs是一个很好的模型来研究成骨细胞分化[2,15,22- - - - - -24),在这个工作中,我们在DPSCs NURR1打倒,通过基因沉默技术,阐明NURR1在成骨细胞分化的影响和作用。

2。结果

2.1。成骨的引发DPSCs抑制神经元标记表达式

确认DPSCs,成骨分化治疗后,致力于成骨细胞的谱系,失去多能——我们分析神经蛋白的表达巢蛋白和GFAP星形胶质细胞标志。细胞培养的成骨的媒体,和总细胞溶解产物收集在不同的时间点(T0、4、8和12天)通过免疫印迹分析。图1表明,巢蛋白和GFAP表达在第一阶段的成骨分化,但他们的表达成为8天后,极大地降低了文化。这些结果表明,在第一天(4 - 8)的成骨分化,DPSCs继续保持神经电位,也许并不是所有的细胞已经提交,8天后文化在成骨的媒介,DPSCs出现潜在的神经完全抑制。


图1
GFAP的表达和DPSCs巢蛋白在成骨分化。免疫印迹显示GFAP蛋白表达的趋势和巢蛋白在DPSCs培养成骨的条件4、8和12天。蛋白质都表示在第一阶段的成骨分化(4 - 8天),但他们的表达显著下降后8天的文化。数据意味着±SE 3独立的捐助者。 与T0相比。统计:未配对的学生t以及。
2.2。NURR1表达式在DPSCs撞倒了

我们以前的工作,这表明NURR1 DPSCs表达于基底条件和仍然存在时,细胞分化成osteoblast-like细胞(23),促使我们深入调查的角色NURR1在DPSCs对成骨细胞的谱系分化。为了这个目的,我们使用核击倒NURR1表达DPSCs从时间0 (T0)在整个分化过程。细胞被播种在成骨的介质和沉默序列NURR1 (SIL)或争夺(CTR)添加每48小时以保持NURR1表达下调。所有细胞溶解产物收集并受qPCR显示显著减少的Nurr1信使rna沉默样本相对于CTR在所有时间点分析(2、4、6和8天)(图2(一个))。检测NURR1蛋白质含量是由西方墨点法,确认NURR1沉默中的蛋白质细胞的减少(图2 (b))。

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图2
影响NURR1 short-interfering击倒。(一)qPCR DPSCs分化成骨的条件和转染NURR1-specific核(黑条)或炒序列控制(白色酒吧)显示,有效的NURR1 mRNA击倒。时间进程表明,NURR1表达式仍然沿着文化表达下调。表达式是GAPDH规范化。 CTR相比。(b)确认和验证了差别NURR1信使rna对这些西方墨点法表明NURR1蛋白质被撞倒了。每个图形代表意味着±SE的3个独立的捐助者。 CTR相比。学生的以及用于单一的比较。
2.3。支持差别NURR1对这些DPSCs的成骨分化

一旦证实NURR1expression沉默DPSCs成骨细胞的分化过程中,我们分析了NURR1击倒如何DPSCs成骨分化的影响。成骨细胞的标记,如高山、Col1、Runx-2 osteoprotegerin(功能),骨桥蛋白(OPN)和骨钙素(OCN)研究了qPCR:一个示意性的结果如表所示1。

表1
成骨的标记DPSC文化:NURR1沉默和点击率数据。

然而,成骨的标记已经差别明显受到NURR1对这些在下面详细描述。典型的表达成骨细胞ALP早期标记Col1和由qPCR(图3)。Col1 mRNA水平增加CTR细胞,分化分析步骤(图3(一个)),以及高山(图3 (b)),确认DPSCs培养成骨的媒介获得典型成骨细胞的功能。有趣的是,Col1的表达显著增加在NURR1沉默细胞相对于CTR细胞显著的趋势在6和8天,高山一样在8天,这表明支持差别NURR1对这些DPSCs的成骨分化。的表达趋势Col1进一步证实,在NURR1沉默和CTR细胞,免疫印迹分析。如图3 (c)Col1 NURR1沉默细胞中蛋白质含量增加,如果相对于CTR细胞2 - 6天,从而确认mRNA的数据。高山的分子结果趋势是进一步支持的组织化学评价高山表达式。组织化学分析是进行DPSCs CTR siNURR1后成骨分化(图8天4(一))。紫色染色,显示的高山表达更丰富siNURR1细胞相对于CTR(~ 150%)确凿的想法NURR1表达式必须下调促使细胞成骨的血统。

(一)
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(b)
(b)
(c)
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图3
在成骨细胞的差别影响NURR1对这些标记。(a) (b) qPCR si-NURR1上执行或CTR细胞显著增加差别表明NURR1对这些基因的表达这两个成骨细胞标记高山(8天)(a)和Col1(6 - 8天)(b), GAPDH表达规范化。 CTR相比。(c)免疫印迹证实Col1蛋白的表达增加NURR1沉默细胞相对于CTR细胞( )。每个图形代表意味着±SE的3个独立的捐助者。统计:未配对的学生t以及。
(一)
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(b)
(b)
图4
在高山和差别NURR1对这些矿化的影响。(一)高山组织化学分析(紫色染色)上执行DPSCs转染NURR1-specific siRNA或炒序列和维护在7天内成骨的条件。图代表了积极的染色的量化比例相比CTR ( 3),代表独立的捐助者。数据意味着±SEM。学生的以及用于单一的比较。(b)矿物基质沉积化验siNURR1 ARS(红染色)和CTR细胞后21天在成骨的条件。图表显示了OD量化提取染料的染色细胞层比例相比CTR ( 3),代表独立的捐助者。数据意味着±SEM。学生的以及用于单一的比较。
2.4。Downregulation DPSCs NURR1的倾向于矿物基质沉积能力

进一步调查DPSCs NURR1在成骨细胞分化中的作用,我们培养的CTR NURR1沉默细胞矿化条件。沉默序列(siNURR1)或争夺(CTR)添加每48小时以保持NURR1表达下调。组织化学试验是用于分析NURR1击倒如何影响DPSCs采集矿物的能力。作为显示在图4 (b),DPSCs采集矿物是高度增强的能力NURR1沉默细胞相对于CTR细胞(200%)。这些结果符合成骨细胞表达的增加标记Col1和高山,证实了发现NURR1表示在未分化的DPSCs,但受体的水平促使细胞向成骨细胞分化的血统和矿物基质沉积。

3所示。讨论

到目前为止,NURR1被认为是主要参与了多巴胺能神经元分化和活动。有趣的是,一个关键的角色的受体是由于在DPSCs向神经细胞的分化表型(19,31日- - - - - -33]。事实上,NURR1对多巴胺能神经元函数[至关重要37),其故障与神经和炎性疾病(38,39]。相比之下,文学资料NURR1成骨细胞作用是有争议的:对小鼠的研究强调了提高成骨细胞的表型的效应主要文化和成骨细胞的细胞系(34,35),而最近的工作表明,NURR1下调主要成骨细胞的分化途径,涉及β连环蛋白在人类成骨细胞的细胞系(36]。此外,我们发现msc如DPSCs表达NURR1基底和成骨的条件(23]。因此,NURR1 DPSCs表示,在神经元分化具有重要作用,但其作用在成骨分化需要更多的调查。符合基本NURR1在神经组织所扮演的角色,我们推测,如果分子可以在某种程度上,影响DPSC向成骨细胞的分化表型,更准确地说,如果NURR1抑制干扰DPSC osteoblastogenesis。首先,我们研究了神经元标记巢蛋白和神经胶质DPSC成骨过程中G-Fap标志。DPSCs表达的标记都是在第一阶段的成骨分化,可能是细胞仍保留神经效力,但文化8天之后显著下降,表明成骨细胞分化的预期结果触发DPSC神经元减少的潜力。组织再生,基于成人干细胞的方法,仍面临战略直接控制和提高其分化能力;因此,目标分子调节的发现,为了满足期望的承诺,仍然是一个开放的挑战[40]。主要,MSC multipotency再生疗法对细胞分化的问题正确的血统,重建组织预期的成熟。NURR1在成骨细胞分化的作用尚不明确,是有趣的,因为它是表示在msc osteoblastogenesis [23,34,36),但它也参与神经元分化(19,41]。明确建立这种受体的作用在msc成骨分化,我们所有的过程中抑制NURR1提交DPSCs重复多步消声处理。NURR1沉默治疗为主,我们检查了成功的每一次实验。因此,主要的成骨的标记进行了研究。Col1表达式表明DPSCs收购能力分泌骨基质的主要蛋白质和我们发现NURR1沉默mRNA和蛋白表达增加。高山mRNA水平大幅度增加沉默细胞和组织化学分析证实了不同的酶量,表明有强烈的影响差别NURR1对这些分子的表达成骨细胞在基质沉积的关键。最后的骨再生过程中关键的一步是无机基质形成(42]。因此,成熟的成骨细胞分泌的有机基质成分后,矿化阶段开始。msc从牙科组织已经被证明是正确进行矿化过程(43):一些物质,如维生素D可能增加矿物基质沉积(44];我们发现抑制NURR1增强DPSC矿化。总之,NURR1 DPSCs表达,但追求细胞向更大的矩阵沉积,适当的成熟的成骨细胞、受体表达下调。MSC分化命运可以人为调节,在体外,通过适当的培养条件和化合物。显然,表观遗传科学表明,不同的刺激可以影响基因表达;体内,这个问题也将细胞分化。总之,我们的研究结果显示,DPSCs确认巢蛋白和GFAP的表达他们的神经潜力。此外,我们表明,神经和神经胶质等标记仍在成骨分化的第一步,这表明DPSCs仍保持相当multipotency或许并不是所有的细胞文化还致力于成骨的血统。8天后,这些标记的表达显著下降,表明细胞失去神经的潜力。以同样的方式,我们发现NURR1 DPSCs表达,但降低其表达在成骨分化,典型成骨细胞的标记的表达增加,并在更高的生产矿化矩阵。 We demonstrated that one of the mechanisms regulating MSC plasticity, influencing their phenotype, is NURR1 expression; in particular, its inhibition promotes osteoblastogenesis and enhances mineral matrix deposition. Discovering an appropriate in vivo method for inhibiting NURR1 during MSC osteogenic differentiation could improve an adult stem cell based tissue engineering, enhancing bone tissue regeneration.

4所示。患者、材料和方法

4.1。细胞培养

人类髓组织收集从第三臼齿二十健康18至26岁的年轻人。该研究机构审查委员会批准的牙科牙周病学科学和外科小组,巴里大学;病人给书面知情同意。一旦提取牙齿,牙髓组织解剖,保持酶的消化,过滤获得单细胞悬浮体。DPSCs收获被播种和扩大如前所述2,23,45,46]。向成骨的谱系分化,细胞培养基补充了10−8M地塞米松和50μg / ml抗坏血酸(西格玛奥德里奇、米兰、意大利)。矿化诱导矩阵,我们补充细胞培养基和10−850 M地塞米松,μg / ml抗坏血酸,10毫米β甘油磷酸盐。

4.2。Short-Interfering RNA击倒

DPSCs转染与NURR1-specific siRNA或炒序列控制(50 nM)(技术)使用RNAi马克斯Lipofectamine(技术)。具体和控制序列被添加在每个介质改变每2天,直到最后的文化,为了保持蛋白表达下调,达到最优的击倒NURR1信使rna和蛋白质(数字2(一个)和2 (b))。

4.3。实时rt - pcr

总RNA分离使用旋转列(RNasy、试剂盒、希尔登,德国)根据制造商的指示和反向转录(2μg)使用上标合成第一链系统工具包(美国生活表达载体技术,卡尔斯巴德,CA);由此产生的cDNA (20 ng)受到定量PCR描述。实时PCR分析mRNA进行使用BioRad CFX96实时系统使用SYBR绿色PCR方法根据制造商的指示(BioRad iScript逆转录Supermix猫。170 - 8841)。平均周期阈值(Ct)一式三份样品被用来计算基因表达,和PCR产品规范化GAPDH水平为每个反应。

4.4。免疫印迹

得到了总细胞溶解产物如前所述[44,45]。总蛋白浓度测定使用Bio-Rad蛋白质化验设备,和细胞溶解产物被sds - page分离之前在硝化纤维膜转移(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。与相应的抗体,免疫印迹后免疫复合物被孵化与可视化IRDye-labeled二级抗体(680/800CW) (LI-COR生物科学,NE)。免疫印迹,奥德赛红外成像系统(LI-COR Corp .林肯,NE)。

4.5。碱性磷酸酶(ALP)

成骨细胞的生化标志物的水平活动,高山,测试在DPSC文化分化成骨的因素,使用白细胞碱性磷酸酶工具包(西格玛奥德里奇)。细胞被固定,轻轻地洗去离子水,沾染了高山的解决方案根据制造商的指示15′。孵化后,细胞被用水冲洗,晾干,然后在显微镜下分析。ALP-positive细胞显示紫色。高山量化是由ImageJ,分析彩色像素的数量对应于阳性染色细胞。

4.6。茜素红染色(ARS)

分化的能力DPSCs生产富含钙的存款用茜素红染色法进行了分析。PBS的细胞被轻轻冲洗,10%福尔马林固定在室温下10分钟,然后用去离子水冲洗了。染色是由添加1%的ARS溶液在室温下10分钟。丢弃ARS的解决方案后,井与去离子水冲洗两次并风干。富含钙的存款出现红染色。如前所述,提取染料染色细胞层和化验量化在405纳米46,47]。短暂,10%醋酸添加30分钟在室温下用颤抖的,解决方案孵化10分钟在85°C,然后继续湿冰5分钟。阅读前光密度在405 nm, 10%氢氧化铵中和酸。统计分析的结果进行评估。

的利益冲突

作者声明没有冲突的财务或其他利益发生冲突。

作者的贡献

阿德里亚娜迪Benedetto和弗兰西斯卡Posa同样这项工作。

确认

这部分工作授予Ministero戴尔'Istruzione,戴尔'Universita e德拉Ricerca-PRIN 20098 km9rn,和乔治•森(Progetto di Ricerca d 'Interesse Nazionale-Grant 2009)。