文摘

大量的细胞是必要的治疗棘手的肌肉疾病与细胞治疗杜氏肌萎缩症等。然而,起始原料等细胞治疗产品的成肌细胞,骨髓基质细胞,月经血液细胞,placenta-derived细胞寿命有限,并停止在体外增殖。观点的制造和质量控制、长寿命的细胞更适合作为起始物料。在这项研究中,我们为将来的成肌细胞生成的基质细胞治疗工作细胞库的人类胚胎干细胞(ESCs)。的ESC-derived CD105⁺与广泛的体外细胞体外增殖能力表现出肌细胞生成和遗传稳定。这些结果暗示ESC-derived CD105⁺成肌细胞的细胞是另一种细胞来源的细胞治疗基因肌肉疾病患者。自从ESCs是不朽的,间充质基质细胞产生的ESCs可以在大规模生产在一个很多制药用途。

1。介绍

杜氏肌萎缩症是一个棘手的遗传性疾病,有效的治疗方法还没有被开发出来。新方法治疗杜氏肌萎缩症包括小分子、基因治疗、生物制剂等细胞因子和细胞疗法(1,2]。在这些先进的治疗方法,再生疗法一直关注的最新进展与不同类型的多能干细胞重编程技术(3,4]。干细胞体外质量受控的扩张和退化性疾病患者移植到同种异体的方式可以是一个理想的治疗方案。体细胞如肌母细胞、骨髓基质细胞,月经血液细胞和胎盘(羊膜、胆盐板、脐带)介绍了派生细胞作为细胞治疗产品的原料(5- - - - - -9]。然而,这些体细胞体外具有有限的寿命,并停止增殖,因此,不能准备足够数量的细胞治疗全身的肌肉细胞疗法。从这个角度来看,长寿命的细胞更适合起始原料。

人类多能干细胞,如胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞)的细胞则是不朽的,因此可以大量的细胞治疗产品的良好来源与一个许多基因肌肉疾病(1]。ESCs除了不朽,和万能干细胞具有多能性,也就是说,能力从理论上区分成几乎所有类型的细胞包括肌母细胞和他们的祖细胞(10]。细胞治疗产品,成肌细胞和间充质基质细胞被认为是最合适的。在这项研究中,我们从ESCs的间充质基质细胞产生细胞治疗产品的生产治疗患者遗传肌肉疾病(11,12]。我们开发了一个新的协议制造间充质基质细胞从ESCs认证材料,分析了病毒。

2。结果

2.1。代的间充质基质细胞

从人类的ESCs生成间充质基质细胞,我们传播sees2细胞在小鼠胚胎成纤维细胞(mef)和胚状体形成的身体(EBs) 4天馈线一层镀新鲜gamma-irradiated小鼠胚胎成纤维细胞(图1)。EBs被转移到collagen-coated烧瓶和培育60至70天。上粘附细胞层是分离获得间充质基质细胞的一个资源。

2.2。间充质基质细胞的繁殖

我们从sees2重复代间充质基质细胞细胞在4种不同的独立实验(# 3,# 14 # 23日和# 25)和研究间充质基质细胞的增殖率(# 3,# 14 # 23日和# 25)超过50天(图2(一个))。间充质基质细胞迅速在文化和传播不断发展迅速,然而停止复制,成为广泛而平坦,SA -展出β牛乳糖活动的蓝色染色的细胞质通道11(数字2 (b)和2 (c))。passage-dependent细胞的扩大规模。

2.3。流仪和核型分析

流仪分析表明,间充质基质细胞# 2和# 3阳性CD90、CD105, HLA-ABC和消极HLA-DR(图3(一个))。这些标记物的表达水平和模式保持不变后3或4通道(12或16个人口倍增,resp)。间充质基质细胞的核型分析# 2和# 3进行段落3和2,分别(图3 (b))。他们发现是二倍体,不要表现出任何重大异常。# 2和# 3的染色体数目是46无一例外。

2.4。全球经济前景的层次聚类和主成分分析(PCA)

探讨肌原性的潜力,分析了间充质基质细胞,根据基因表达水平。层次聚类分析基于探针,mesenchyme-associated基因,阻止细胞相关基因表明间充质基质细胞被分为同一组passage-dependent方式(数字4(一),4 (b),4 (c))。同样,层次聚类分析和主成分分析对肌原性的和cardiomyogenic基因的表达模式也显示passage-dependent分类(数字4 (d)和4 (e)补充表可以在网上https://doi.org/10.1155/2017/7541734)。感应后,间充质基质细胞开始形成多核肌管(图4 (f))。

3所示。讨论

细胞肌原性的基因治疗策略的发展障碍,不朽的细胞作为原材料需要获得足够数量的细胞,因此详细的研究基本对分化的间充质基质细胞的特点。本研究证明的详细变化间充质基质细胞在扩张从P0侯在单层培养。间充质基质细胞的命运产生的ESCs取决于通道或人口数量翻倍水平的文化。在我们之前的研究中,我们表明,人类骨髓基质细胞和脐带血液细胞衰老,展览大型平面形态在段末,和有不同的特征,根据通道数量和人口倍增(13,14]。肌原性的能力ESC-derived间充质基质细胞可能是与表面标记,形态、细胞因子、分化能力。c - kit、CD34和CD140作为良好的标记来区分小鼠间充质细胞,多能——也就是说,间充质干细胞(15]。+ CD29、CD44 +、CD59 +和经血CD90 +细胞能够分化成肌细胞/细胞和赋予人类肌营养不良蛋白表达在杜氏肌萎缩症的小鼠模型6]。在这项研究中,我们为未来的成肌细胞生成高纯度间充质基质细胞疗法ESCs工作细胞库。广泛的ESC-derived CD105 +细胞体外增殖能力表现出肌细胞生成和体外遗传稳定性,暗示ESC-derived CD105 +细胞是另一种细胞来源成肌细胞在细胞治疗患者遗传肌肉紊乱。自从ESCs是不朽的,间充质基质细胞产生的ESCs可以在大规模生产的制药用途很多。

间充质基质细胞来源于ESCs从分化倾向的观点,研究表面标记,增殖,形态10,16- - - - - -20.]。他们表现出多能——也就是说,脂肪形成的,体外成骨,chondrogenic分化10]。他们也显示肌原性的体外分化像骨髓间充质干细胞来源于,经血,胎盘(6,8,13,21- - - - - -23]。这些间充质基质细胞可以用于治疗药物或运载工具移植物抗宿主病的患者,缺血性心脏病和溶酶体储存障碍。描述的健壮的可伸缩的生产过程在这项研究中,ESC-derived CD105 +细胞作为这些可能的细胞治疗药物的原料。ESC-derived CD105 +细胞是凡人而ESCs的原始(sees2)是不朽的。细胞,因此,nontumorigenic因为他们达到衰老或停止分裂后有限数量的复制。这个有限的电池寿命可以从肿瘤发生学的角度是一个优势,但劣势可伸缩的细胞疗法产品的制造业的发展。iPSC-derived间充质基质细胞表现出几乎相同的表型分化倾向,表面标记,增殖,形态ESC-derived CD105 +细胞(19,24]。综上所述,没有大区别间充质基质细胞来源于ESCs的质量属性,则和各种组织。

植入ESC-derived的成肌细胞诱导间充质基质细胞在遗传肌肉疾病患者确实是一个理想的策略,从自从的角度,可持续供应大量的便宜,质量受控的细胞。不太可能有可能准备影响体细胞在足够的数量,需要使用合适的干细胞,具有成本效益的同种异体来源,如ESCs和万能。ESCs的细胞治疗产品,则可以覆盖全身的肌肉因为他们的不朽。此外,扩散能力和遗传稳定性的ESC-derived间充质基质细胞打开再生医学的重要新的可能性。ESCs可以是一个有前途的细胞来源细胞疗法治疗杜氏肌肉营养不良症,致命的人类疾病的有效治疗目前存在(11,12]。

4所示。材料和方法

4.1。道德的声明

人体细胞在这项研究中进行完全符合临床研究的伦理准则。hESC线进行的培养完全符合“人类胚胎干细胞的来源和分布指南(教育部通知,文化,体育,科学,和技术在日本(下边了))”和“指南利用人类胚胎干细胞(下边了通知)。“实验程序批准的机构审查委员会(IRB)在国家儿童健康与发展中心。动物实验是根据协议执行机构的动物保健和使用委员会批准的国家儿童健康研究所和发展。所有的老鼠实验的3 R考虑(减、精炼和替换),和所有的努力都是尽量减少动物痛苦和减少实验用动物的数量。

4.2。hESC文化

sees2和sees5常规培养到支线层镀新鲜gamma-irradiated小鼠胚胎成纤维细胞(mef),隔绝ICR胚胎12.5妊娠,hESC文化媒体。hESC媒体由淘汰赛™杜尔贝科修改鹰的介质(KO-DMEM)(美国CA生命技术;数量10829 - 018)补充20% 35 kGy的辐照淘汰赛™血清替代(KO-SR;数量10828 - 028),2毫米Glutamax-I(35050 - 079), 0.1毫米不必要的氨基酸(NEAA;数量11140 - 076),50 U /毫升penicillin-50μg / ml链霉素(Pen-Strep)(15070 - 063),和重组人类全身bFGF (Kaken制药有限公司)在50岁ng / ml。细胞被重组扩大使用酶使胰蛋白酶(美国印第安纳波利斯罗氏诊断)。

4.3。制造过程

生成EBs, sees2和sees5 (5×10³/)被分离成单个细胞与0.5毫米EDTA(生命技术)在暴露于岩石抑制剂(和光,y - 27632: A11105-01 kouichi日本)和培育96 -孔板(热费希尔科学)EB介质(76%的淘汰赛DMEM, 20%的35 kGy的辐照Xeno-free淘汰赛血清替代(XF-KSR,生命技术、钙、美国),GlutaMAX-I 2毫米,0.1毫米NEAA, Pen-Strep,和50μg / ml l-ascorbic酸2-phosphate (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国))为4天。EBs被转移到T25烧瓶内涂有NMP胶原PS(日本肉类包装工Inc .)和培养XF32介质(85%的淘汰赛DMEM, 15%的35 kGy-irradiated XF-KSR, GlutaMAX-I 2毫米,0.1毫米NEAA, Pen-Strep, 50μg / ml l-ascorbic酸2-phosphate 10 ng / ml heregulin-1β(重组人类NRG-beta 1 / HRG-beta 1 EGF域;Wako、日本),200 ng / ml重组人类igf - 1(长R3-IGF-1;人类bFGF Sigma-Aldrich)和20 ng / ml (Kaken制药有限公司))60至70天。烧瓶轻轻地震动分离细胞。分离细胞聚合,因此可以很容易通过吸管。剩下的附着在烧瓶内细胞间充质基质细胞用于资源。贴壁细胞被传播αmem培养基补充10%的边后卫(Gibco或HyClone)和1% Pen-Strep体外进行进一步分析。

4.4。核型分析

核型分析是外包给日本基因研究实验室有限公司(日本仙台)。中期利差从细胞准备接受100 ng / ml的秋水仙胺(Karyo马克斯,Gibco有限公司BRL) 6 h。这些细胞被固定用甲醇:冰醋酸(2:5)三次,玻璃上放置幻灯片(日本基因研究实验室Inc .)。染色体的利差是染色带状和拍照。至少10中期利差分析每个样本和使用染色体核型成像分析仪系统(应用光谱成像,卡尔斯巴德,CA)。

4.5。基因芯片分析

总RNA提取使用试剂盒试剂(热费希尔科学Inc .)根据制造商的指示。RNA数量和质量是决定使用Nanodrop nd - 1000分光光度计(热费希尔科学Inc .)和一个安捷伦生物分析仪(安捷伦科技,圣克拉拉,CA)。总RNA放大并贴上青蓝3 (Cy3)使用安捷伦低输入快速Amp标签设备,一种颜色(安捷伦科技)后,制造商的指示。简而言之,总RNA反转录使用聚双链cDNA dT-T7发起人底漆。底漆、模板RNA和质量控制记录已知的浓度和质量是第一变性在65°C 10分钟和孵化2小时40°C和5 x第一链缓冲区,0.1德勤,10毫米混合核苷酸,AffinityScript核糖核酸酶块组合。AffinityScript酶灭活在70°C,持续15分钟。互补脱氧核糖核酸的产品也被用作体外转录模板来生成荧光cRNA。互补产品和转录大师的T7 RNA聚合酶和Cy3-labeled CTP和孵化40°C 2小时。标签cRNAs使用试剂盒纯化的RNeasy迷你旋转30列和筛选了μl nuclease-free水。放大和标签后,cRNA数量和青蓝合并使用Nanodrop nd - 1000分光光度计测定和安捷伦生物分析仪。对于每个杂交,0.60μ克Cy3-labeled cRNA支离破碎和杂化在65°C 17个小时的安捷伦SurePrint G3人类通用电气v3 8 x60k微阵列。洗后,微阵列使用安捷伦DNA微阵列扫描仪进行扫描。每个扫描特性的强度值量化11.5.1.1使用安捷伦特征提取的软件版本,执行背景减法。我们只使用特性的标记为没有错误(检测到标记)和排除功能不积极,不重要,不统一,没有背景,人口饱和,离群值(没有发现和妥协旗帜)。执行规范化使用安捷伦GeneSpring软件13.0版本(每个芯片:标准化75百分位的转变)。总共有58201探针在安捷伦SurePrint G3人类通用电气v3 8 x60k没有控制探针微阵列。层次聚类分析和主成分分析进行使用NIA阵列分析(https://lgsun.grc.nia.nih.gov/ANOVA/)。

的利益冲突

作者宣称没有利益上的冲突。

作者的贡献

Akihiro Umezawa设计实验。于安藤,玛丽齐藤,东京电力公司主席高桥,Masakazu町田进行了实验。Akihiro Umezawa、于安藤和玛丽齐藤分析数据。Masashi丰田提供的试剂、材料和分析工具。Hidenori Akutsu动向Yoshida-Noro、Akihiro Umezawa Masashi丰田章男,和Yu安藤讨论了数据和手稿。齐藤Akihiro Umezawa和玛丽写的手稿。

确认

这项研究受到了教育部的资助,文化,体育,科学,和日本技术(下边了);由卫生部、劳动和福利(MHLW)科学研究资助;在健康科学研究资助重点药物创新的日本健康科学的基础;促进项目的基本健康科学的药品和医疗器械的研究机构;和授予的国家儿童健康中心和发展。计算时间提供的计算机集群HA8000 / RS210再生医学中心的国家儿童健康与发展研究所。作者扩大承认在沙特国王大学院长以来科研资助这项研究通过国际宏基因组研究项目”。“Akihiro Umezawa感谢沙特国王大学,利雅得,沙特阿拉伯王国,客座教授。作者想表达衷心感谢y高桥和h安提供技术援助他们的专家,k . Miyado的富有成果的讨论,c . Ketcham英语编辑和校对,铃木和k齐藤秘书工作。

补充材料