文摘
横纹肌肉瘤(RMS)是最常见的软组织肉瘤的孩子,可分为两种主要的亚型:胚(erm)和肺泡(武器)。在肿瘤细胞的异质性,一小部分细胞的存在被称为癌症干细胞(CSC),被认为是负责癌症的发生和传播,已经证明在某些肿瘤。尽管CSC已经报道了erm的存在,他们的存在在手臂,最恶性的亚型,迄今为止尚未被证实。由于缺乏合适的标记来识别这个族群的手臂,我们使用癌症富含干细胞supracellular结构(球体和holoclones)来研究这个程序。这个策略允许我们演示的能力双臂和erm细胞形成这些结构和保持自我更新能力。此外,细胞包含在球体和holoclones显示重大Hedgehog途径诱导,(药物或基因)的抑制损害holoclones和球的形成。我们的发现指出,这个途径的关键作用在维护这些结构和表明,CSC Hedgehog途径针对可能有很大的潜力在预防局部复发和转移。
1。介绍
横纹肌肉瘤(RMS)是最常见的软组织肉瘤的孩子,被认为是最流行的儿童颅外的实体肿瘤。RMS可分为两个主要病理亚型:胚和肺泡(erm和手臂,职责)。这些亚型在他们的临床表型和分子特征明显不同。从分子的角度来看,大多数的武器(80%对85%)包含一个互惠的染色体易位:t (2; 13) (q35; q14)或t (1; 13) (p36; q14)。这些易位产生异常融合基因PAX3-FOXO1和PAX7-FOXO1分别为(1,2]。但是,没有在erm特征描述了易位。胚胎性亚型特点是染色体的短臂上的杂合性丢失11 (11 p15.5) (3]和增加染色体2、7、8、11、12、13日和17日(4]。
所有的肿瘤细胞中都不相同,表现出不同的增殖和分化潜能,一个功能通常被称为肿瘤的异质性。的存在的一小部分细胞癌症干细胞(CSC)——层次组织和负责第一次证明了癌症的发生和传播在急性髓系白血病(5]。后,癌症干细胞的存在也描述了在前列腺癌等实体肿瘤(6],黑色素瘤[7),脑部肿瘤(8和乳腺癌9]。根据克隆演化模型,一些肿瘤细胞获得序列突变逐渐赋予他们一个增长的优势,从而促进肿瘤进展(10,11]。另一方面,癌症干细胞假说表明一种罕见的族群的存在的细胞与正常干cells-self-renewal,属性的高分化潜力,扩散,chemoresistance-able启动肿瘤和产生细胞异质性。因此,这个模型指出,癌症干细胞是唯一与实际致瘤的潜在细胞类型。此外,这种分组人口也可以,总是根据这一理论,形成局部复发和转移10- - - - - -12]。然而,这两个模型并不相互排斥,因为肿瘤干细胞也可能接受克隆进化。
童年癌症有特定的特征定义为实体不同强烈从成人恶性肿瘤由于他们不同的病因,生物学,对治疗的反应和结果。考虑到这些差异,我们必须质疑在小儿癌症癌症干细胞的存在,如果是这样,是否它们的功能在儿童和成人恶性肿瘤相似。RMS的特定情况下,争议存在适合干细胞的标记隔离。因此,Hirotsu et al。13)首先描述erm肿瘤起源细胞的存在并提出FGFR3标记适合他们的孤立。之后,沃尔特等人驳斥了利用FGFR3的可能性在RMS干细胞标记,并提出CD133/2作为隔离这个族群的标志(12]。Pressey et al。14)证实的存在CD133-positive肌原性的前体在RMS细胞系。然而,最近的研究表明,CD133-positive无法更有效地生成肿瘤细胞在免疫缺陷小鼠(比CD133 -细胞)。这些作者提出了转录因子SOX2在RMS癌症干细胞标记,尤文氏肉瘤和骨肉瘤15]。有趣的是,CSC的存在在肺泡RMS迄今尚未证明尽管科学界的努力在这个领域工作,指示的可能性缺乏合适的标记来识别这个罕见的族群。
干细胞富集的方法,基于能力的神经干细胞悬浮生长,形成球状体特点,首次描述了雷诺和维斯16]。认为只有干细胞有能力形成球体播种时低密度(17]。近年来,这个属性已被证实在不同的神经系统和乳腺癌的恶性肿瘤,其中[18,19]。最近,球体的存在丰富了肿瘤起源细胞和抗原决定基overexpressing CD133/2据报道在erm [12]。另一种测试这些细胞的集落形成能力,取决于选择的细胞的增殖和分化潜能(11]。经典测试涉及种子细胞在低密度、条件下,干细胞形成殖民地有更大的能力。此外,殖民地的形状之间的关系和他们的干细胞的潜力也被描述,从而揭示的存在三种类型的克隆有不同的增殖能力(20.]。根据压实、轮廓和增殖能力的殖民地,这些作者然后分类三种类型holoclones, meroclones, paraclones。holoclones(小而紧凑,形成一个明确的边界)有很好的复制的能力。相反,paraclones通过分散细胞克隆形成不定边界显示非常低的增殖能力。殖民地的第三种类型包含一个混合的细胞有不同的增殖功能是holoclones之间的过渡和paraclones。几年后,另一项研究显示,holoclones产生角质细胞富含干细胞和保存他们的自我更新能力。此外,只有从毛囊干细胞能够形成holoclones [21]。在癌症方面,多项研究表明,holoclones由神经胶质瘤细胞,前列腺癌和胰腺癌是唯一能够致瘤的(22- - - - - -24]。在儿科肉瘤细胞的能力形成holoclones迄今为止还没有被报道。
一些信号通路,为他们安排正常干细胞自我更新和增殖能力,也对管制时启动肿瘤至关重要。其中,刺猬(HH)通路已被证明是优势在干细胞自我更新程序11]。最近,这个途径参与干细胞维护各种癌症也被证明(25]。HH信号最初描述的果蝇(26),HH基因被认为是一些开发流程的主要监管机构。HH信号也扮演着重要的角色在成人干细胞等生物维护、组织修复和再生。在缺乏活跃SMO膜,GLI家庭(gli GLI2,和激活)proteosomically加工。在绑定的HH配体,活跃SMO膜,防止检测GLI变幻虫的处理。GLI然后转移到细胞核,它结合吗GLI您启动子(27- - - - - -29日]。最初的联系HH信号和人类癌症基因突变在人类时成立PTCH1被发现与一种罕见的遗传性疾病叫做戈林综合征。戈林的综合症患者基底细胞癌的发病率高,成神经管细胞瘤和RMS (30.- - - - - -32]。然而,突变的组件的HH通路在RMS是罕见的,除了治疗综合症,占很低的比例的RMS的病人。HH途径改变,典型的损失函数PTCH和SUFU或激活突变SMO,HH,或GLI,被认为是在相当数量的其他癌症(致癌33]。目前,一致的激活途径是完善和普遍接受的RMS (34]。此外,一些出版物结合体外和体内与异种移植RMS模型达成有效地减少肿瘤生长的可能性HH通路抑制(35- - - - - -37]。在肌细胞生成,HH通路参与调节保护,扩张,骨骼肌和分化的祖细胞。RMS的事实提出了一种异常的调节信号通路的表明它可能扮演一个角色在这个肉瘤的起源和维护和改造这个罕见的细胞亚群(38]。Satheesha et al。39)表明,HH信号调节erm肿瘤起源细胞自我更新。但是,没有以前作品研究的激活途径在武器领域或holoclones RMS亚型。
这项工作的主要目的是证明存在的特定人群的细胞在RMS CSC特色描述生成holoclones RMS细胞的能力和范围以及突出HH途径激活这些supracellular结构中包含的细胞中。双臂和erm被发现有不同的细胞群能够形成holoclones, paraclones, meroclones以及球体。的作用HH途径在这些特定的亚种群特征,指出维护这个途径的至关重要的作用。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
RH30(手臂、PAX3 / FOXO1易位)RD (erm), HTB82 (erm)细胞系来自美国类型文化集合(写明ATCC)和CW9019(手臂、PAX7 / FOXO1易位)生成比格尔最后的实验室在她博士。RMS细胞系都生长在MEM媒体(擤鼻涕),补充10%胎牛血清(Sigma-Aldrich), 2毫米谷酰胺、丙酮酸钠1毫米,1 x不必要的氨基酸,100 U /毫升青霉素和链霉素0.1毫克/毫升(所有试剂从擤鼻涕)。细胞被维持在37°C公司5%2水套孵化器。
2.2。药物治疗
的SMO从Selleckchem抑制剂Sonidegib (LDE225)购买。的嘘和本次事件抑制性抗体读出- 5304请MedImmune公司提供的。工作浓度15μSonidegib和30米μ读出- 5304 g / mL。控制盘是平等的对待。细胞进行预处理前48 h所有功能化验。细胞在球体,holoclone-formation化验不治疗。
2.3。分析细胞生存能力
细胞培养与2μg / mL propidium碘和流式细胞术分析了FACSAria血细胞计数器(BD生物科学)。结果分析了FCS表达4流式细胞仪软件(新创软件)。
2.4。质粒、慢病毒生产和转导
基因的抑制HH配体和GLI1是由shrna克隆到慢病毒载体pGIPZ (GE Dharmacon)。空向量被用作控制。短暂,细胞株用于生产慢病毒颗粒(HEK 293 t)与信封质粒转染pMD2G (4μg),包装质粒psPAX2 (8μ向量(12 g), pGIPZ转移μ2000 g),根据Lipofectamine转染试剂制造商的指令(热费希尔科学)。手机媒体含有病毒颗粒在24小时后删除。感染后48 h,积极选择转导细胞嘌呤霉素(1μg / mL, Sigma-Aldrich)。可拆卸的每个成分的效率被免疫印迹分析。克隆选择的通用电气Dharmacon id V3LHS_82400 (shSHH) V3LHS_336297 (shIHH) V3LHS_401021 (shDHH)和V2LHS_262249 (shGLI1)。功能检测进行感染后7天。
2.5。克隆选择
可行的细胞分类和播种密度克隆FACSAria流式细胞术(BD生物科学)在96 -孔板。所有凋亡或不能存活的细胞被丢弃。10天的潜伏期后,克隆分为holoclones, meroclones,或者根据表型paraclones标准。为二级集落形成,克隆在克隆使胰蛋白酶化并再次播种密度96 -孔板。克隆获得的总数量和类型进行评估每个细胞株的一式三份。RNA提取,克隆使胰蛋白酶化和扩大在6-well盘子。
2.6。Sphere-Formation化验
104CW9019和103HTB82细胞生长在neurobasal媒体(热费希尔科学)补充2 x B27 (Gibco), 2毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素,链霉素0.1毫克/毫升(擤鼻涕),20 ng / mL表皮生长因子(EGF、研发系统),和10 ng / mL纤维母细胞生长因子(FGF,σ)6-well盘子和维持在37°C公司5%2水套孵化器1星期。
收集球体,二级球体形成机械分类,播种在上述密度。二次球形成的数量统计1周后孵化。每个单元的sphere-formation效率测试一式三份。
2.7。RNA提取,Retrotranscription和实时PCR
细胞系的总RNA提取使用RNeasy迷你包(试剂盒),遵循制造商的指示。2μ克总RNA孵化用随机引物(表达载体)5分钟在70°C和reverse-transcripted使用200 U Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶(Promega) 1 h在37°C。一个基于TaqMan 40-cycle PCR试验(应用生物系统公司)进行检测嘘,本次事件,DHH,GLI1(Hs00745531_s1 Hs00179843_m1 Hs00368306_m1, Hs00171790_m1 TaqMan化验,职责)。管家基因真沸点(试验Hs00172424_m1)作为内部控制。每个信使rna分析量化的相对水平Livak和Schmittgen(法40]。所有样品都测试了一式三份。
2.8。统计分析
统计分析使用GraphPad棱镜软件。所有数据被当作意味着±SEM。统计学意义是取决于学生的以及。值被认为是重要的;;。
3所示。结果
3.1。RMS细胞能够形成Holoclones和球体
RMS细胞系CW9019 HTB82, RD, RH30被播种在克隆集落形成密度评估其异质性。大约10天的潜伏期后,所有的细胞系表现出三种截然不同的殖民地基于形态学标准。紧凑的殖民地和清晰的轮廓与holoclones,而殖民地与分离细胞形成与paraclones;中间殖民地meroclones(图1(一))。而meroclones和paraclones非常频繁(25 - 60%),holoclones是少殖民地式(1 - 16%)(图1 (b))。paraclones不能无限增长,有趣的是,和从未形成殖民地拥有超过40 - 50个细胞,大约。考虑到他们的能力显然形成了三种类型的克隆,CW9019和HTB82选定的后续研究。两种细胞系也能够形成球体(图1 (c))。细胞系HTB82显示sphere-formation效率5倍大于CW9019细胞(25球/ 1000细胞与5球/ 1000)(图1 (d))。
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(d)
3.2。RMS Holoclones和球体能够自我更新
自我更新是干细胞的标志之一。确认holoclones和球体中包含的细胞自我更新潜能是评估他们的线索干细胞的潜力。三种类型的克隆分离,分类,然后在克隆克隆密度和二级分类和统计。在两个细胞系分析paraclone-derived细胞专门生产paraclones(数字2 (g)和2 (h)),meroclone-derived细胞形成meroclones(30.3%和56.7%,分别地。)和paraclones(69.7%和43.3%,分别地。)(数据2 (e)和2 (f)),而holoclone-derived细胞能够产生三种类型的殖民地:59 - 53.6% holoclones meroclones 24.8 -34.5%和16.2 -11.9% paraclones,分别在细胞株CW9019和HTB82(数字2 (c)和2 (d))。有趣的是,类型学的殖民地形成holoclone呈现显著富集holoclones CW9019(从16%到59%,从9%到53.6% HTB82)相比初始百分比(数字2(一个)和2 (b))。同样,经过解集和重播的球体,球体数量大幅提高观察两个细胞系(数据分析2(我)和2 (j))。
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3.3。的主要效应HH通路(gli)是调节在RMS Holoclones和领域
的mRNA水平HH配体-嘘,本次事件,DHH——的HH目标基因GLI1分析了CW9019和HTB82 holoclones球体和meroclones或贴壁细胞的水平相比,分别。尽管holoclones呈现高表达水平HH配体(结果未显示),他们的水平与meroclones相似,除了DHH显示,明显upregulation HTB82 holoclones(数字3(一个),3 (b),3 (c))。球显示三个HH配体的重要upregulation细胞系(数字3 (e),3 (f),3 (g))。然而,GLI1显然是调节holoclones和球体(数据吗3 (d)和3 (h)),这表明HH具备干细胞途径激活可能扮演重要的角色在维护在RMS细胞。
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3.4。HH通路抑制受损RMS Holoclones和球的形成
的差别基因对这些本次事件,DHH,GLI1的shRNA阻塞的形成holoclones在这两种细胞系,而嘘沉默(数据没有产生影响4(一)和4 (b))。菌落总数并不影响在任何条件(补充图S1, A和B,在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/7507380)。相反,CW9010和HTB82 shRNA-expressing细胞形成球体控制细胞保持相同的能力(与空载体转染)(补充图C和D)。然而,细胞相互作用本次事件,DHH和GLI1shRNA向量显示显著减少球体直径(数字4 (c)和4 (d))。所有成分显示有效减少各自的目标(数字4 (e)- - - - - -4 (h))。药理学HH抑制呈现相似的结果。因此,RMS细胞系使用Sonidegib (SMO抑制剂)或读出- 5304 (嘘和本次事件抑制性抗体)显著减少holoclone数量和相应数量的增加最分化clones-meroclones paraclones-only重要HTB82细胞系(数字5(一个)和5 (b)),在不影响克隆的总数(补充图A和B);最初的为期两天的预处理后,克隆形成进行了化验没有药物,以防止可能的干扰与细胞增殖在克隆的生长。同样,显著减少球的数量(数字5 (c)和5 (d))以及在他们的直径(数字5 (e)和5 (f))后被观察到HH通路抑制细胞系。在观察细胞生存能力没有显著减少Sonidegib或读出- 5304预处理(补充图C和D)。
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3.5。的表达在Holoclones干细胞标记
几个干细胞标记物的表达水平进行评估在CW9019通过PCR和HTB82细胞株。Holoclones细胞系表现出更高水平的OCT4和NANOG相比总细胞系。PAX7也增加CW9019(没有这个标记的表达中检测出HTB82)。相反,KITLG被发现调节在HTB82 holoclones,但没有观察到的差异在CW9019标记(图6)。其他干细胞标记化验(如SOX2和CD133)没有变化(数据没有显示)。
4所示。讨论
虽然癌症干细胞的存在已经证明,越来越多的证据显示它在某些肿瘤明显,RMS的情况下仍然是一个挑战。尤其是在RMS,这个罕见的族群的存在只有被报道为胚胎性横纹肌肉瘤和没有提供证据肺泡亚型,其存在的最积极和prone-to-metastasizing RMS的形式。因此,提出了三种标记的CSC在erm日期:FGFR3, CD133,SOX2(12,13,15]。FGFR3,第一个CSC标记RMS中描述,排除了后续研究[12]。相反,CD133 +细胞已经成功地用于定义一个程序在erm CSC属性。然而,RMS领域的主要缺点是缺乏有用的肺泡亚型CSC标记,已阻碍了演示这个族群的存在在最激进的RMS亚型。因此,使用其他方法,比如holoclones和球的形成,可能是一个有趣的替代研究这个族群的细胞。此外,感应(总细胞系相比)的干细胞标记(特别是OCT4和NANOG)表明holoclones干细胞样细胞的一个浓缩。这一事实增加干细胞标记没有被观察到在后续章节的克隆表明维护机制假定的干细胞克隆的比例。
的能力形成一个特定的细胞群holoclones据报道在一些癌症,包括前列腺癌(22),胰腺(24],乳腺癌[41),非小细胞肺癌(42),和结肠直肠癌43]。细胞形成球体在文化的功能也被广泛报道在癌症,即使对于erm的情况下(12]。两assays-based形成supracellular structures-permit属于干细胞亚群细胞的浓缩,因此构成方法,研究其特性。这里给出的结果首次证明holoclones RMS细胞形式的能力,也证明他们的能力形成球体。值得注意的是,只有一小部分细胞(9 - 16%)能够形成holoclones,只有2.5%至0.5的细胞能够形成球体。这些百分比低支持假说的存在一个特定族群的细胞将符合癌症干细胞理论。有趣的是,paraclones显示非常低的产能增长,,从不殖民地与超过40 - 50细胞形成。这个观察强烈建议减少具备干细胞的细胞包含在这种类型的克隆。然而,之间的差异被发现的百分比supracellular结构。球面形成的低效率相比holoclone形成可能解释的高紧缩neurobasal媒体用于文化领域(44]。holoclone-formation的习惯性的媒体执行分析的细胞可以解释获得的更高的利率,因为细胞倾向于适应更快,更好的在他们习惯性的媒体。此外,从holoclones的独家功能细胞形成新的holoclones也暗示这一部分细胞的自我更新。在这方面,绝对缺乏holoclones文化产生meroclones或paraclones尤为引人关注。因此,只有细胞能够产生三种类型的殖民地是那些包含在holoclones。此外,holoclone分数在文化来源于纯化holoclones丰富。以类似的方式,球体的数量显然是增加在后续章节从第一轮培养领域。
的HH通路已被证明是CSC维护在一些癌症的关键(45- - - - - -50]。结果在此显示明确的激活HH通路的RMS (holoclones和球体)富含干细胞群。因此,主HH下游目标,转录因子GLI1显示,引人注目的感应的mRNA水平holoclones和领域,从而具备干细胞支持主角的途径维护。GLI1众所周知,发挥prooncogenic作用在几个癌症也以它的作用在癌症干细胞维护(45,49]。此外,GLI1能够激活两个转录因子的表达,NANOG(51),SOX2(49),为具备干细胞维护是至关重要的。超出其可能作用在细胞具备干细胞维护,HH信号已被证明是突变或管制在许多癌症中可能支持细胞增殖,肿瘤进展转移和治疗电阻(52]。之间的关系HH信号和RMS是哈恩等人于1996年第一次描述了30.),并进一步在老鼠杂合的特点PTCH1这不仅发展特性与戈林综合征一致,但也有高的发病率erm [32]。一致的激活途径是完善和普遍接受的RMS (53]。最近,Satheesha等人报道受损肿瘤形成HH在erm抑制剂治疗(39]。然而,目前的报告是第一个描述一个可能的药物中的应用HH抑制剂减少PAX7干细胞样细胞的数量/ FOXO1-translocated手臂细胞系,从而表明这些结果可以推断整个手臂表型。基于我们的研究结果有力地表明,一个治疗HH通路抑制不仅作用于细胞增殖,还可以减少细胞产生新的肿瘤的能力(即。局部复发或转移)。参与的HH途径促进细胞侵袭性转移,肿瘤progression-albeit不在RMS-has之前被证明在一些肿瘤(54- - - - - -58]。如果我们考虑到这一事实的主要原因死于sarcoma-as大多数人士的开发和发展转移,一个可能的治疗目标细胞增殖和肿瘤起源能力可以为阻碍癌症恶化是一个有用的工具,从而提高患者的生存。因此,文中提出了强化的应用结果HH在治疗RMS通路抑制剂。
另一方面,一个强大的感应HH配体表达领域显然是体现。在这方面,积累了,异常的证据HH由肿瘤细胞分泌可能刺激基质细胞在肿瘤以旁分泌的方式,包括刺激肿瘤血管生成、细胞外基质改性和分泌VEGF,等(59,60]。我们可以推测,随着领域的增长,细胞位于中部变得孤立,营养不足和/或缺氧可能激活这个之前所知的触发血管生成机制。鉴于holoclones单层生长,他们可能不会遭受这种营养不足,因此可能不激活这一机制。然而,这是纯粹的投机和需要进一步的实验来支持这一假说。
关于结果的可能的临床应用在此,这一事实HH通路药物抑制减少holoclones和球体的形成尤为引人关注。因此,药物的方法(SMO抑制剂Sonidegib和HH利用抗体读出- 5304)显示显著减少球的形成和holoclones。然而,尽管基因的抑制本次事件,DHH和GLI1阻碍holoclones的形成,它只能够减少球体直径(没有观察球数量减少)。这一事实表明,这些刺猬组件可能更重要和特殊的起始holoclones球体。在任何情况下,这些结果支持HH路径作为一个关键的治疗目标对RMS干细胞样细胞。因此,我们的研究结果表明,第一次可能的使用HHligand-specific抑制剂阻止RMS具备干细胞。在这方面,对手的SMO进入在I和II期临床试验,与令人鼓舞的结果HH借肿瘤,特别是在成神经管细胞瘤和基底细胞癌(BCC) [61年,62年]。最近,SMO抑制剂Vismodegib成为第一个HH信号pathway-targeting剂是通过美国食品和药物管理局(FDA)治疗转移性或局部晚期BCC [63年]。考虑到HH通路强烈激活癌症干细胞和通路的抑制明显减少了CSC,我们可以肯定,除了抑制肿瘤生长(这是最常见的标准选择给定的药物)的适用性,使用HH抑制剂可能有助于降低癌症干细胞的数量,至少在RMS。针对这个特别malignant-albeit rare-subpopulation可能有巨大的潜力在预防局部复发和转移,从而提高生存。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
作者要感谢诺尔博士僧侣(美)的礼物的抑制性抗体- 5304和克里斯汀·奥哈拉小姐帮助英语版本的手稿。这项工作是支持由研究所Catala d 'Oncologia (ICO),皇家研究院祝您健康卡洛斯三世(RTICC-RD12/0036/0016和RD12/0036/0027;Fundacio PI11/00740和PI14/00647)答:博世,突出的博士前的VHIR。
补充材料
补充图1。HH配体和差别基因对这些GLI1 clonogenicity和球体形成减少。补充图2。预处理和Sonidegib读出- 5304 clonogenicity和细胞生存能力降低。