致瘤的胚胎干细胞的分化潜力取决于TGFβ家庭信号:教训畸胎癌细胞与视黄酸刺激分化

文摘

发展的一个重大的挑战安全多能干细胞疗法是不完整的体外分化的多能干细胞和剩余的存在启动畸胎瘤发展在受者移植后的未分化细胞。理解不完全分化的机制,视黄段分化的比较研究小鼠胚胎干细胞(ES)和畸胎癌(EC)细胞。目前的研究发现不同的增殖活动,ES之间的分化和肿瘤发生的电位和EC细胞。高表达Nanog和Mvh以及激活素A和BMP4,发现比EC细胞未分化的胚胎干细胞。然而,激活素的表达水平和BMP4大幅增加更多的视黄段期间EC细胞分化。刺激激活素/节点和BMP信号级联和抑制MEK / ERK和PI3K /信号通路导致显著降低Oct4-expressing ES细胞的数量和致瘤性的丧失,类似于视黄acid-stimulated EC细胞。因此,这项研究表明一个差异化策略,调节prodifferentiation ES细胞和抗增殖信号可以有效消除致瘤的细胞可能代表一个有价值的工具,用于安全的干细胞疗法的发展。

1。介绍

多能干细胞的细胞衍生品被认为是有前途的细胞来源再生疗法。多能干细胞的起源可以无限的自我更新和分化成各种类型的体细胞和生殖细胞在体外和体内1- - - - - -9]。然而,完整实现多功能潜力只能当多能干细胞重新与胚泡(6,10- - - - - -13]。相比之下,在体外分化的多能干细胞是异步的,不完整的;因此,剩余未分化细胞移植后可以启动畸胎瘤开发成成年动物的组织接受(14- - - - - -21]。多能干细胞的这一功能的一个主要问题安全多能干细胞治疗的发展。

矛盾的是,多能胚胎干细胞(ES)和胚胎生殖细胞(如)是唯一类型的基因正常和是非细胞后能形成肿瘤移植到成年动物的接受者。相信基因正常的多能干细胞形成良性肿瘤,不包含未分化的细胞,而多能干细胞携带着基因畸变产生恶性肿瘤未分化细胞,类似于自发的畸胎癌肿瘤(22- - - - - -24]。然而,这些相关性被发现只有一些人类ES细胞系与异常分析,而小鼠ES细胞没有表现出很强的相关性的分析或其他基因改造(不含转基因小鼠E-ras过度),增加了致瘤性和恶性肿瘤25- - - - - -27]。同时,老鼠和人类畸胎癌(EC)来自自发肿瘤细胞具有不同遗传疾病确实是能够形成继发性恶性肿瘤后连续移植到受者(28- - - - - -34]。可以认为,癌症的高危起始多能干细胞移植后细胞可以与癌基因和肿瘤抑制基因的突变有关。此外,大量研究表明,长期体外培养的积累会导致遗传畸变和不正常的多能干细胞的基因组表观遗传变化,包括突变致癌基因和肿瘤抑制(27,35- - - - - -40]。这个属性在vitro-maintained细胞的第二个主要问题推迟细胞技术的临床应用基于多能干细胞。

因此,评估风险和收益的细胞再生医学技术,有必要开发一个可靠和可再生的技术平台的评估癌症的概率启动后移植的干细胞衍生品体外培养,并进行了不同的操作。毫无疑问,多能干细胞的使用需要定期监测恶性肿瘤发生学的遗传和表观遗传完整性和测试使用适当的动物模型。

解决剩余的问题未分化细胞在体外分化的多能干细胞,几个策略提出了消除未分化细胞通过基因改造用“自杀”基因表达(41- - - - - -44)和抑制细胞生长的接触(45- - - - - -48激活扩散逮捕和细胞死亡,如癌细胞。然而,另一种有前途的方法旨在纠正失衡的增殖和分化过程提高分化和分化诱导物的不同组合;这种方法可以促进恶性畸胎癌向良性成熟畸胎瘤的变换(30.,49- - - - - -51]。例如,著名的小分子诱导分化all-trans-retinoic酸用于急性早幼粒细胞白血病的临床治疗,因为它加剧未分化的肿瘤细胞的分化49,51]。考虑到大量相似的多能干细胞和EC细胞,造成他们的肿瘤发生的机制的比较分析和致癌潜力可以让我们找到最有效的方法消除残余的未分化细胞。

在目前的研究中,我们进行了一项比较分析动态的体外和体内小鼠ES的分化和EC细胞识别机制的差异正常多能干细胞的分化和肿瘤发生的电位和恶性同行。根据获得的结果,我们试图找出方法来消除残余的未分化细胞,能够启动肿瘤接受者在移植到免疫缺陷小鼠。

2。材料和方法

2.1。细胞系的维护

小鼠ES细胞R1线是由a .请提供伊(西奈山医院,多伦多,加拿大),和鼠标EC F9细胞系从俄罗斯获得细胞培养组(http://www.rccc.cytspb.rssi.ru/)。小鼠ES R1细胞被维护在小鼠胚胎成纤维细胞丝裂霉素C(σ)或支线灭活的feeder-free系统中包含10 ng / ml的白血病抑制因子(σ)。ES R1和EC F9细胞在DMEM培养补充2毫米谷酰胺,1%不重要的氨基酸(HyClone), 0.1毫米β巯基乙醇(σ),15%为胎牛血清(HyClone)或15%击倒血清替代(表达载体)。

2.2。与维甲酸诱导ES和EC细胞分化和暴露于苯丙酸诺龙,BMP4, PD98059和LY294002

ES R1和EC F9细胞的分化与视黄酸(10刺激⁻⁶米,all-trans-retinoic酸、RA、σ)。在实验的开始,未分化的细胞被镀的密度10000细胞/厘米²一夜之间,培养促进坚持中包含1毫米谷酰胺,1%不重要的氨基酸,15%胎牛血清(HyClone)特点。第二天,介质与被替换为血清培养基补充15%击倒血清替代和10⁻⁶M类风湿性关节炎。在实验介质变化进行日常。经过5天的RA刺激,ES R1和EC F9细胞分离使用trypsin-EDTA 0.05%解决方案(HyClone),转移到新的文化盘子或烧瓶1:3的比例和暴露于RA在接下来的5天(RA10)。经过10天的RA曝光,在一个标准的培养基培养细胞不视黄酸3天(RA10 + 3)。

在接下来的一系列的实验来提高ES R1细胞分化,人类苯丙酸诺龙(100 ng / ml,表达载体),人类BMP4 (100 ng / ml,σ),PD98059 (50μ米,σ),LY294002 (25μ患风湿性关节炎的M,σ)加在一起从第五天到第十天。区分ES R1细胞被培养在一个没有RA的介质为3天。

2.3。移植细胞的准备

皮下移植之前,分化ES R1和EC F9细胞分离使用trypsin-EDTA 0.05%解决方案(HyClone)和10⁶移植细胞被集中在50 - 70μl·汉克斯的解决方案(HyClone)。腹腔内移植,5×10⁵细胞在10天的RA刺激被镀到醋酯膜(CA-membrane, 1.2厘米²)和培养8-well Lab-Tek二室滑动系统(Nalge Nunc国际)在标准培养基为3天。

2.4。流仪分析细胞周期分布和Oct4-Expressing细胞

细胞探针进行了分析使用Cytomics FC500流式细胞分析仪(贝克曼库尔特)。细胞悬浊液(10⁶/毫升)准备使用0.05% trypsin-EDTA (HyClone)治疗。分析细胞周期分布,细胞与冷70%乙醇固定。后固定和三重洗PBS包含20个细胞在PBS孵化μ克/毫升propidium碘(表达载体/分子探针)和200年μ克/毫升的核糖核酸酶(Fermentas) 30分钟。染色后,探测器立即进行了分析。分析了直方图采用多周期的杀毒软件(美国凤凰流系统)。

Oct4-expressing的流式细胞术分析细胞,细胞悬浮液(10⁶在PBS /毫升)和3%多聚甲醛固定15分钟,用PBS洗净,和对待0.5% Triton x - 100, 3%的牛血清白蛋白,分数V(σ),兔子anti-Oct4抗体(1:200年,圣克鲁斯生物技术)在PBS 40分钟。洗后,细胞被孵化在PBS溶液含有0.5% Triton x - 100, 3%牛血清白蛋白,二级鸡anti-rabbit抗体共轭alexa - 488(1: 1000年,分子探针)30分钟。消极的控制,细胞治疗与正常兔免疫球蛋白(sc - 3888,圣克鲁斯生物技术),然后用同样的二次抗体上面描述的解决方案。

2.5。检测碱性磷酸酶活性(高山)和免疫染色

ES R1和EC F9细胞在磷酸盐与2%多聚甲醛固定,PBS, pH值7.0,在15分钟。高山孵化后发现活动解决方案包含10毫升0.02 Tris-HCl缓冲区(pH值8.7),1毫克Naphtol-AS-B1-phospate, 5毫克快红染料德克萨斯红(从σ)37°C 1 h。

免疫荧光分析,细胞固定在4%多聚甲醛在PBS洗了1 h和permeabilized Triton x - 100年的0.5%。非特异性的反应是被鸡血清(Gibco /英杰公司)的10%。初级anti-Oct4兔子和山羊anti-Gata4抗体(圣克鲁斯生物技术)使用的稀释1:100。解决方案中的细胞被孵化的主要抗体PBS-Tween 20一夜之间在4°C。二级鸡anti-rabbit和驴抗体抗体共轭与Alexa萤石594和Alexa萤石488(分子探针)稀释1:800年阻止缓冲区和应用于细胞4 h在室温下。DAPI(分子探针)申请15分钟为核染色。这些细胞被安装和莱卡DMRXA2荧光显微镜下检查(徕卡Microsystems GmbH)。消极的控制,主要的抗体都省略了,使用了相同的染色过程。

2.6。RNA分离和定量实时PCR分析(存在)

总rna提取小鼠ESC和ECC样本使用试剂盒®试剂(表达载体)。样本处理涡轮DNase (Ambion /英杰公司)根据制造商的建议。RNA产量和品质进行了分析使用NanoDrop 2000系统(热科学)。互补脱氧核糖核酸合成使用1 - 1.5μ克总RNA, oligo-dT18底漆,Maxima逆转录酶(Fermentas)根据制造商的协议。

相对定量分析基因表达进行了使用应用生物系统公司实时PCR系统7500(生命技术)。探针是准备使用中存在主混合SYBR绿色和火箭被动参考染料(Evrogen、俄罗斯)。以下放大使用协议:变性5分钟在95°C,紧随其后的是40周期在95°C为15秒和60°C 1分钟。所有的实验都是运行在一式三份。目标mrna的表达水平被规范化的看家基因的表达次黄嘌呤鸟嘌呤phosphoribosyltransferase(产生Hprt)。目标基因表达的相对水平比较2计算使用^−∆∆Ct方法(ABI相对量化研究软件,应用生物系统公司)。

特定的引物设计利用基因库和整体数据的注释使用信标的目标基因序列设计8.0软件(美国国务院总理Biosoft)和引物3。预期产品的引物序列和大小代表在网上表S1(补充信息https://doi.org/10.1155/2017/7284872)。基因表达数据受到使用R v.3.2.3统计分析软件(http://www.r-project.org)。获得基因表达数据的平均值从三个独立的实验被用于统计分析使用单向方差分析,后跟一个图基的事后测试。

2.7。畸胎瘤和畸胎癌试验

畸胎瘤和畸胎癌的研究发展,10-12-week-old裸体免疫缺陷小鼠(ν/ν)来自动物育种Facility-Branch“Pushchino Shemyakin Ovchinnikov有机化学研究所、俄罗斯科学院(从查尔斯河实验室获得股票行Inc .威尔明顿MA)作为接受者。裸小鼠在无菌条件下保存。动物保持和伦理委员会批准的所有实验都是发育生物学研究所的,俄罗斯科学院和执行按照俄罗斯联邦立法(的俄罗斯联邦卫生部和社会发展数字708 n, 8月28日,2010)根据《欧洲人权公约》(European Convention保护脊椎动物用于实验和其他科学目的。皮下、腹腔内细胞移植程序之前,动物麻醉100毫克/公斤的腹腔内注射氯胺酮(MEZ、俄罗斯)和10毫克/公斤甲苯噻嗪(Rometar Spofa,捷克共和国)。在皮下移植实验中,区分ES R1和EC F9细胞(0.5 1×10⁶细胞每只老鼠)注入颈部的皮肤下的裸小鼠使用1毫升注射器27 g针头(正)。在腹腔内细胞移植,中线切口是在皮肤和体壁进入腹腔。细胞在CA-membrane被转移到腹腔使用镊子。

最后的实验(6-30周后移植),动物们牺牲了颈椎错位或注入静脉注射致命剂量的巴比妥酸盐。所有老鼠尸体解剖进行。发达畸胎瘤和畸胎癌被孤立和10%多聚甲醛固定(σ),根据标准方法脱水,嵌入在石蜡切片。组织准备与苏木精和伊红染色和DM RXA2徕卡显微镜下检查。

3所示。结果

3.1。动态RA-Induced ES和EC细胞的分化

澄清的机制调节增殖和分化的平衡过程在正常多能和恶性畸胎瘤细胞,在体外的增殖活性和动态分析了ES R1和EC F9细胞的分化后RA刺激(图1(一))。在10天的RA-induced分化,细胞的数量逐渐减少s阶段的细胞周期(从60%到10 - 30%)和增加细胞的数量在G1 / G0-phase(从10 - 20% 45 - 60%)在ES R1和EC F9细胞群(数字1 (b)和1 (d))。然而,细胞周期的细胞s阶段显著降低人群的区分ES R1细胞比EC F9细胞数量在5天(分别为30.7%和44.6%,分别地。)和第十天(分别为10.8%和32.8%,分别地。)RA曝光(图1 (b)和1 (d))。RA撤军后第三天(RA10 + 3),细胞的数量在s阶段的细胞周期是相似的在这两个细胞系,细胞的数量在G1 / G0-phase更高的细胞区分ES R1(数字1 (b)和1 (d))。同样,检测到原癌基因的表达水平较低比EC ES细胞R1 F9细胞RA-induced分化(图5和10天2)。

微分动力学分析确定的数量逐渐减少Oct4——ALP-expressing ES细胞R1和EC F9细胞群(数字1 (c)和1 (e),图3)。然而,Oct4-expressing细胞的数量在不同ES R1和EC F9 RA-induced分化的细胞群在5天(分别为52%和78.8%,分别地。)和RA撤军后第三天(45.2%和2.7%,分别地)。没有检测到显著差异在10天(数字1 (c)和1 (e))。这些动力学证实了存在Oct4表达式的分析区分ES R1和EC F9数量(图2)。因此,在早期RA刺激,增殖和分化ES R1和EC F9细胞动力学相似,但是从第五到第十天的实验中,研究细胞特征有显著差异,而成为最为明显RA撤军后3天。

3.2。胚胎基因表达分析家族承诺在RA-Induced ES和EC细胞的分化

探讨早期胚胎期间血统RA-induced ES R1和EC F9细胞分化,基因表达的多能性(Oct4和Nanog)和谱系标记(Mvh, Gata4, Pax6,法新社,Bry)研究(数据2和3)。此外,内生TGF的表情β家庭因素(TGFβ1、苯丙酸诺龙、节点和BMP4),早期谱系分化中发挥关键作用,也是检查(图2)。有更高的Nanog表达式和Mvh(生殖细胞系标记)ES R1比EC细胞群F9细胞在RA-induced分化的所有阶段。高表达Oct4欧共体F9细胞中检测到5天的RA刺激和ES细胞R1 RA撤军(图后3天2)。大多数体细胞谱系标记的表达显著增加,分化中ES R1和EC F9细胞(图2)。最强劲的增长表达式是观察胚胎外的内胚层的标志(Gata4)和neuroectoderm (Pax6)区分ES R1和EC F9细胞。Gata4表达显著不同ES R1和EC F9细胞5天的RA刺激和RA撤军后3天,而Pax6表达不同ES R1和EC F9细胞在分化晚期(RA10和RA10 + 3)。但是,没有显著差异表达的内胚层、中胚层标记(法新社和Bry resp)被发现之间的区分ES R1和EC F9数量(图2)。

在未分化和分化ES R1和EC F9细胞内源性TGF的表情β家庭因素,启动相应的信号通路也显著不同。最重要的内源性表达模式的差异显示激活素A和节点。在区分ES R1和EC F9细胞群,激活素A的表达调节,而节点的表达下调。苯丙酸诺龙高水平的表达差异的ES细胞R1,但是这个因素急剧增加,成为更高的表达在EC细胞F9 RA-induced分化的各个阶段(图2)。相比之下,节点表示在相似的水平在未分化的ES R1和EC F9细胞但减少更强烈在ES R1的分化细胞(图2)。内源性表达TGFβ1逐渐增加在两个细胞系分化但ES R1和EC F9细胞之间有极大的差别只在最后阶段(RA10 + 3)。

相比之下,BMP4的表达模式不同于激活素A和节点模式在ES R1和EC F9细胞的分化。内源性表达BMP4的调节在天3和5,表达下调的分化晚期两个细胞系(图进行了研究2)。这些数据表明,苯丙酸诺龙的内源性表达的差异,节点,BMP,激活相应的信号通路可以促进动力学的差异RA-induced ES R1和EC F9细胞谱系分化。

3.3。致瘤的潜在RA-Simulated ES和EC细胞移植后成裸体小鼠

评估肿瘤发生的潜力,区分ES R1和EC F9细胞移植皮下注射或腹腔内裸体小鼠。根据我们之前的数据在肿瘤发展的动力21),形成畸胎瘤和畸胎癌在两个组织移植网站监控6-30周(表1)。5 - 6周内,畸胎瘤和畸胎癌发展裸体小鼠(100%)ES R1和EC F9细胞移植后5天的RA刺激体外(图4、表1)。只有畸胎瘤发展所有移植后小鼠ES细胞R1 RA撤军后第三天(RA10 + 3),和没有畸胎癌形成在30周后EC F9细胞的移植在同一阶段的体外分化(图4、表1)。肿瘤的形成在移植网站不是观察移植后的细胞进行了研究。畸胎瘤开发区分ES R1移植后的细胞包含三个胚芽层(图的不同细胞衍生品4 (c))。相比之下,畸胎癌由欧共体F9细胞体外RA的第五天刺激(RA5)完全由未分化的畸胎癌细胞(图4 (c))。这些实验证明不同肿瘤发生的分化潜力的ES R1和EC F9 RA体外刺激后细胞群。

3.4。效果的刺激激活素A /节点和BMP信号通路和抑制MEK / ERK和PI3K /信号通路在RA-Induced ES R1细胞的分化

基于我们的研究涉及的差异在体外和体内ES R1和EC F9细胞的分化,我们假设ES R1和EC F9细胞的致瘤潜能RA刺激后第十天可以与不同的TGF活动水平β家庭的信号通路,以及MEK / ERK和PI3K /行动平衡TGF信号级联β家庭的信号通路。调制的影响这些信号通路的分化和肿瘤可能通过增强激活素A和BMP4信号通路的活性和抑制MEK / ERK和PI3K / RA-stimulated ES R1细胞信号通路在接下来的一系列的实验进行了研究。ES R1细胞暴露在因素(苯丙酸诺龙和BMP)和抑制剂(PD98059和LY294002)从第五天到第十天的RA刺激细胞,因为最重要的差异区分ES R1和ECF9细胞检测到在这些阶段。实验显示在图的设计5(一个)。

在所有实验变异,少量Oct4——和ALP-positive细胞识别实验的最后阶段。数字是类似于观察10天RA刺激(图3和图5 (b))。此外,Oct4的表达水平,Nanog, Mvh显著降低区分ES细胞R1人群暴露于RA和添加剂比控制(ES R1 RA10 + 3),并且与表达水平差异化EC F9细胞(EC F9 RA10 + 3)(图5 (c))。分析ES R1细胞的致瘤潜能分化与RA和添加剂表明没有肿瘤发展组织的裸小鼠移植后30周的区分ES细胞数量(表2和图6)。

4所示。讨论

我们研究的分化正常的多能干细胞和恶性畸胎瘤细胞动力学进行了回答下列问题:(i)为什么剩余未分化细胞体外诱导分化后仍ES和EC细胞?(2)剩余未分化细胞致瘤的和致癌吗?(3)可能的机制造成不完整的ES和EC细胞分化?及(iv)我们如何减少剩余未分化细胞区分ES细胞群后能够形成肿瘤移植到收件人?

目前研究显示增殖活动的显著差异和分化之间的动力学ES R1和EC F9细胞从第五天到第十天RA-induced分化。然而,尽管类似数量的剩余Oct4-expressing在ES细胞和EC细胞数量10天,这些细胞的致瘤潜能是截然不同的。出乎意料,区分ES R1细胞群保留形成肿瘤的能力(畸胎瘤),而EC F9细胞群失去致瘤性,先前报道(30.]。这些发现表明不同状态的残余Oct4-expressing区分ES细胞和EC细胞群。

多能的基因表达分析和谱系标记揭示的表达水平明显高于Nanog和Mvh ES R1细胞比EC F9细胞在分化的所有阶段表示一个可能的角色维护这些基因的分化和肿瘤发生的潜力。以前,我们建议Mvh,胚胎和成年生殖细胞发展的监管机构,可能发挥作用在维护天真的多能性状态的老鼠和人类胚胎干细胞(52- - - - - -56]。在这种背景下,剩余未分化的胚胎干细胞具有高表达Oct4、Nanog,和Mvh可以被认为是最早的生殖细胞前体,类似于原始生殖细胞在殖民的性腺的山脊。支持这一假设的数据证明体外原始生殖细胞转化为简单的如细胞,这非常类似于胚胎干细胞(55,57- - - - - -60]。因此,更高表达Mvh可能表明一个更强的能力10天RA-stimulated ES R1细胞分化成原始生殖细胞,也很容易移植到裸鼠后形成畸胎瘤。因此,我们建议的能力多能干细胞分化成原始生殖细胞与能力开发畸胎瘤包含所有类型的胚胎细胞衍生品。剩余未分化的胚胎干细胞不能被认为是癌症,因为与EC细胞,这些细胞能够分化成三个胚芽层的前身畸胎瘤甚至在二级畸胎瘤recloning和二次移植后(21]。据推测,剩余未分化的胚胎干细胞代表一个中间多能和原始生殖细胞之间的细胞类型都能形成畸胎瘤。相比之下,EC F9细胞表达低水平的Mvh RA-stimulation只后就可以区分体细胞nontumorigenic衍生品(图7)。

RA-induced分化的机制EC和胚胎干细胞已经被广泛的研究30.,49,61年- - - - - -67年]。调查各种肿瘤的潜在可能的机制和ES R1和EC F9细胞分化潜能,我们专注于TGFβ家庭因素中发挥关键作用的规定血统的命运在开发的早期和多能干细胞分化的早期阶段68年- - - - - -70年]。激活素的表达水平的观察,节点,在欧共体F9细胞和BMP4高于ES R1的细胞,尤其是RA-stimulation第五和第十天之间,让我们建议额外刺激这些信号通路可能提高ES R1cells的分化。的确,调制的苯丙酸诺龙/节点和BMP信号级联通过接触外源苯丙酸诺龙和BMP4因素或通过抑制MEK / ERK和PI3K /平衡规范TGF Act-signaling通路β家庭因子信号通路导致减少各实验细胞群表达Mvh,移植到裸鼠后致瘤性的丧失。因此,这些数据显示,调制prodifferentiation的差异化战略和抗增殖信号通过刺激激活素A /节点或BMP信号通路抑制MEK / ERK和PI3K /行动信号通路在5到10天的时间窗口ES细胞分化可能有效的细胞的数量明显减少启动畸胎瘤(图发展7)。有趣的是,这种策略也是有效的EC F9细胞,表达内源性水平较高的激活素A和BMP4 RA刺激的反应。

大部分的开发协议的多能干细胞体外分化是基于知识的承诺和分化的分子机制,规范在开发过程中早期胚胎,胚胎外的细胞。MEK / ERK的调制,PI3K /行动,Wnt和TGFβ家庭使用各种鸡尾酒的生长因子和信号通路抑制剂,以及小分子诱导物,不同的曝光时间是一种有效的方法来推导分化所需的细胞类型(68年- - - - - -77年]。在大多数情况下,体外分化细胞群是异构的,需要细胞排序。然而,剩余未分化的细胞是一个小族群;因此,为了消除这些细胞,消极的选择方法涉及使用激活细胞死亡在靶细胞通过一个“自杀”基因的方法和化学诱导物(41- - - - - -48,78年]。然而,这些技术的应用可能负面影响所需的分化细胞的生存能力,可能导致无法控制的基因重组由于插入突变(43- - - - - -45,79年]。因此,调制信号通路来增强差异化战略可能更安全、更有效。我们的研究证明了这种策略的有效性为抑制残余的致瘤性未分化的胚胎干细胞。然而,这种策略需要添加剂努力创造最有效的协议增加定向分化的效率和减少残余的未分化细胞。

5。结论

RA-induced分化的礼物比较研究ES R1和EC F9细胞旨在澄清不完整的体外分化的可能机制这些细胞并确定新的方法消除残余未分化的胚胎干细胞,移植到受者后可以形成肿瘤。在10天的RA-induced分化,ES R1和EC F9细胞被发现展览体外增殖活性和微分动力学的差异,以及不同移植到裸鼠后致瘤的可能。重要的是,区分ES R1细胞群形成畸胎瘤、保留能力而EC F9细胞群失去致瘤性。基因表达分析显示高表达Nanog Mvh,以及激活素A和BMP4,未分化的胚胎R1细胞相比,EC F9细胞。然而,激活素的表达水平和BMP4 RA后大幅增加更多EC F9细胞刺激。此外,刺激激活素/节点和BMP信号级联后接触外源性因素激活素A和BMP4和MEK / ERK抑制剂和PI3K /行动信号通路导致减少的数量剩余Oct4-expressing ES R1细胞和致瘤性的丧失。因此,我们的研究表明,一个差异化策略,提高苯丙酸诺龙/节点和BMP信号通路或抑制MEK / ERK和PI3K /行动信号通路在胚胎干细胞可能是有效的减少致瘤的细胞的数量。这种方法可以促进进步安全的干细胞疗法的发展。

的利益冲突

作者声明没有财务利益冲突。

确认

作者感谢t . m . Nikonova提供帮助在组织切片制备和m . Gorobets照顾实验动物。这项工作是支持的俄罗斯基础研究基金会拨款11-04-00379。

补充材料

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