文摘

间充质基质细胞(msc)为退化性疾病的治疗提供有价值的期望。他们可以发现在许多组织包括羊膜。从羊膜msc (AM-MSCs)可以分化成成骨细胞类似于骨骨髓来源msc (BM-MSCs)。然而,BM-MSCs相比并没有太大的高效的能力。本研究旨在考察BMP-2和microrna在成骨分化的影响AM-MSCs BM-MSCs相比。microrna的治疗后的成骨分化能力评估是由高山表达式,高山活动和成骨的标志基因的表达。结果表明,成骨分化能力增加AM-MSCs和BM-MSCs BMP-2后治疗。MiR-31, mir - 106 a和mir - 148——在成骨分化中表达下调。与anti-miRNAs转染后,高山活动和成骨的基因分化的时间增加。数据导致潜在的使用AM-MSCs骨再生的替代来源。 Moreover, the information of miRNA expression and function during osteogenic differentiation may be useful for the development of new therapeutics or enhanced an在体外文化技术所需的干细胞疗法在骨再生。

1。介绍

间充质基质细胞(msc)增加了再生医学的重要潜在由于multipotential分化(1]。如今,msc可以从许多孤立的组织包括骨髓、羊膜、胎盘和脐带1- - - - - -3]。一项研究报道了分化潜力的变化,特别是msc的成骨分化,都来自不同的组织4]。初步研究表明,msc源自羊膜(AM-MSCs)可以分化成成骨细胞;然而,分化能力不稳定。

骨形成蛋白(bmp),一个强大的形态因子,可以确定一个谱系分化通过激活特定转录途径(5]。具体来说,BMP-2被描述作为骨再生的成形素(6,7]。的好处BMP-2骨组织再生一直得到广泛的研究,主要是在骨骨髓来源msc (BM-MSCs) [8- - - - - -11]。然而,BMP-2增强成骨分化能力的影响AM-MSCs并非完全的研究。

此外,小分子核糖核酸(microrna)已报告的主要监管机构几乎在每一个细胞的过程包括干细胞的分化12,13]。这些小的非编码rna调节基因的表达主要通过抑制特定转录因子的表达通过绑定目标mrna(3′端非翻译区14]。在过去的几年里,有越来越多的研究解决的参与microrna在成骨分化和骨骼发育。各种microrna的命运已报告影响骨分化包括miR-31, mir - 106 a, mir - 148 a (15]。这些监管microrna的表达RUNX-2这被认为是第一个主人转录因子负责收购osteochondroblastic特征(16]。然而,microrna的表达之间的关系和成骨分化潜能的AM-MSCs仍然遥遥无期。因此,本研究旨在研究BMP-2的影响和microrna在成骨分化的影响AM-MSCs BM-MSCs相比。获得的数据提供新的见解的影响BMP-2和microrna在成骨分化AM-MSCs BM-MSCs导致使用microrna的可行性作为骨再生的调制器。

2。材料和方法

2.1。细胞隔离和文化

这个协议是人类伦理委员会批准的法政大学1号(医学院)。所有的志愿者( )< 60岁,没有传染性疾病的历史。一个5 - 10毫升的骨髓是收获,单核细胞分离使用Ficoll-Hypaque解决方案(美国Sigma-Aldrich)。细胞被培养在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;美国GibcoBRL)补充10%胎牛血清(的边后卫;英杰公司、美国),2毫米谷酰胺(美国GibcoBRL), 100 U /毫升青霉素,100μg / ml链霉素(美国GibcoBRL)。不依从细胞被移除,新的媒介在第四天了。随后,每3天中被改变。达到80%的纤维母细胞扩大融合trypsin-EDTA亚文化使用0.25%(美国GibcoBRL)和山肩1×10的密度4细胞/厘米2。

羊膜组织从4捐助者被切成小块,与1.6毫克/毫升胶原酶消化XI(美国Sigma-Aldrich)和200毫克/毫升脱氧核糖核酸酶(美国Sigma-Aldrich) 37°C 4 h。洗后,细胞培养中类似于BM-MSCs完成。这些细胞被裁判每3天直到纤维母细胞的殖民地。在单层细胞扩大并使用0.25% trypsin-EDTA亚文化。

2.2。流仪分析培养的msc

Immunophenotype培养的msc在通道3 - 5使用流式细胞仪检查。简单地说,5×105msc是收获和resuspended 50μl(磷酸缓冲盐(PBS)。与5细胞随后被孵化μl抗体包括PE-CD34抗体(美国BioLegend) FITC-CD45抗体(美国BioLegend) PE-CD73抗体(美国BioLegend) FITC-CD90抗体(美国BioLegend)和PE-CD105抗体(美国BD生物科学),在4°C 30分钟。与PBS洗涤后,细胞与1%多聚甲醛固定15分钟。至少有10000标记细胞获得和分析使用流式细胞仪(FACScalibur™,正欲,美国)和CellQuest®软件(美国,正欲)。

2.3。分化分析

msc骨髓和羊膜受到脂肪形成的成骨分化,通过3 - 5。脂肪形成的差异化,7.5×104msc被播种在35毫米2菜含脂肪形成的分化培养基(DMEM补充10%的边后卫,100 U /毫升青霉素,100μg / ml链霉素,0.5毫米isobutyl-methylxanthine(美国Sigma-Aldrich), 1μ10 M地塞米松,μM胰岛素(美国Sigma-Aldrich), 25毫米葡萄糖,和100年μ吲哚美辛(美国Sigma-Aldrich))。中每4天了。21天之后,这些细胞被固定在10%的缓冲福尔马林30分钟在室温下,用PBS洗净、孵化与2%油红O(美国Sigma-Aldrich) 1 h。这些细胞被洗用蒸馏H2O和在倒置显微镜下观察(尼康TS100、日本)。

成骨分化,4.5×104msc被播种在35毫米2菜含成骨分化培养基(DMEM补充10%的边后卫,100 U /毫升青霉素,100μg / ml链霉素、100 nM地塞米松和50μg / ml抗坏血酸(美国Sigma-Aldrich))。在7天的感应,10毫米β甘油磷酸酯(美国Sigma-Aldrich)补充道。检测矿化基质,细胞受到茜素红染色(美国Sigma-Aldrich)。去除介质后,与PBS和4%多聚甲醛固定细胞冲洗10分钟在4°C。这些细胞被洗两次蒸馏水和沾40毫米茜素红(pH值4.2)在室温下30分钟。控制文化没有分化的刺激进行平行实验和彩色以同样的方式。

2.4。msc的BMP-2对成骨分化的影响

检查msc的BMP-2对成骨分化的影响,9.5×103msc在通道4在24-well培养板(美国康宁公司)与成骨分化培养基补充100 ng / ml的BMP-2(研发系统、美国)3、7、14、21、28天。成骨分化是衡量碱性磷酸酶染色使用5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate /硝基蓝四唑(BCIP /电视台;美国Sigma-Aldrich)。简单,培养细胞与PBS和4%多聚甲醛固定洗5分钟在4°C。然后,BCIP®/电视台®液体衬底(美国Sigma-Aldrich)添加和孵化在室温为30分钟。细胞用蒸馏水清洗两次,倒置显微镜下观察(尼康TS100、日本)。完全培养基和成骨分化培养基培养msc被用作控制。

2.5。碱性磷酸酶活性的测定

高山活动决心使用SensoLyte®pNPP碱性磷酸酶测定工具包(Anaspec, Inc .)、美国)根据制造商的指示。短暂,msc与成骨分化培养中有或没有BMP-2 3、7、14、21、28天。之后,这些细胞被洗两次,permeabilized使用Triton x - 100年的0.2%。细胞与底物溶液,随后被孵化p-nitrophenylphosphate (pNPP),在室温下了45分钟。后停止反应,吸光度测量在405海里。总蛋白浓度(毫克/毫升)确定使用bicinchoninic酸(BCA)分析工具包(美国Sigma-Aldrich)。高山总蛋白质含量水平正常化,和高山活动表示为ng /毫克的蛋白质。msc与完全培养基培养是用作控制。

2.6。实时定量PCR(存在)成骨的基因表达

检查成骨基因表达,msc与成骨分化培养基培养有或没有BMP-2 3、7、14、21、28天trypsin-EDTA收获使用0.25%。总RNA提取每个示例使用试剂盒®(美国表达载体)的解决方案。的第一链互补DNA合成使用上标®三世逆转录酶(美国表达载体)。执行中存在使用SYBR®绿色PCR反应混合液(美国表达载体)和ABI 7500实时PCR系统(美国应用生物系统公司)。相对mRNA水平表示为褶皱变化相对于未经处理的控制规范化后的表达glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)。引物中指定的表1。

表1
引物和产品尺寸。
2.7。测定小分子核糖核酸参与成骨分化的表达水平

小分子核糖核酸的表达水平参与成骨分化,miR-31, mir - 106 a,和mir - 148 a,检查使用中存在。短暂,msc在成骨分化培养中有或没有100 ng / ml BMP-2 3、7、14、21、28天。然后,从培养的msc使用试剂盒提取的总RNA试剂(美国表达载体)。小分子核糖核酸反向转录成cDNA使用TaqMan®微rna逆转录工具包(美国应用生物系统公司)。反转录是在MyCycler热循环(美国Bio-Rad)。反应混合物在16°C孵化为30分钟,然后在42°C为30分钟,然后灭活在85°C 5分钟。然后存在样本准备使用TaqMan普遍PCR大师混合二(2 x)(美国应用生物系统公司)。miRNA-specific引物(表2)包含在TaqMan microRNA清点化验(美国应用生物系统公司)。研究中使用的分析包括miR-31-5p, mir - 106 - 5 - p和mir - 148 - 5 - p。定量校正和标准化的表达U6作为内生控制。

表2
成熟的microrna的序列。
2.8。瞬时转染microrna的抑制剂

探索microrna的影响(miR-31, mir - 106 a和mir - 148 - a)在成骨分化潜力的msc、microrna的抑制剂瞬时转染到msc使用Lipofectamine 3000转染试剂(美国表达载体)。短暂,10 nM的每个microrna的抑制剂在成骨分化培养基稀释混合Lipofectamine 3000转染试剂在室温下培养10分钟。然后,转染复合物添加到细胞培养。msc转染10 nM FAM-labeled microrna - # 1是用作控制-控制。后3、7、14和21天的孵化,总RNA提取和使用中存在microrna的表达水平确定。碱性磷酸酶活性测定进行了确定成骨分化潜能。此外,在成骨分化相关基因的表达也进行了研究。

2.9。统计分析

在这项研究中展示的实验统计数据表示为均值的平均值±标准误差(SEM)。所有实验进行了至少3次。使用未配对的数据进行了分析t以及比较两组的方法。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。骨髓的特点和羊膜Tissue-Derived间充质基质细胞

文化3天后,骨髓和羊膜tissue-derived表面并显示纤维母细胞附着在文化形态(图1(一))。这些纤维母细胞迅速扩散,他们的密度达到80%融合在头两周内(图1(一))。没有明显区别的形态学骨髓和羊膜tissue-derived msc(图1(一))。值得注意的是,虽然骨骨髓来源msc (BM-MSCs)可以扩大只有8 - 10通道,羊膜tissue-derived msc (AM-MSCs)可以扩大至少20段落之前他们达到复制衰老。

(一)
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图1
来自羊膜间充质基质细胞的特点(AM-MSCs)和骨髓(BM-MSCs)。(一)贴壁细胞表现出纺锤状形态和在第14天达到80%融合。(b) Immunophenotype AM-MSCs和BM-MSCs通道3。(c)的脂肪形成的和成骨分化潜能AM-MSCs BM-MSCs。脂滴的形成中观察到的细胞质AM-MSCs和BM-MSCs脂肪形成的感应35和21天后,分别。茜素红S积极观察AM-MSCs在成骨分化培养基培养BM-MSCs 21和14天。微米酒吧= 100μm。

BM-MSCs和AM-MSCs表现出典型的MSC表面标记,积极为CD73 CD90、CD105和消极造血标记、CD34、CD45。之间没有显著差异的水平MSC AM-MSCs和BM-MSCs(图的表面标记表达式1 (b))。

AM-MSCs和BM-MSCs可以分化为脂肪细胞,成骨细胞培养后脂肪形成的和成骨分化媒体,分别。经过3周的脂肪形成的感应,BM-MSCs AM-MSCs成为大细胞的脂质滴油红O染色阳性(图1 (c))。此外,BM-MSCs和AM-MSCs也可以分化成成骨细胞成骨分化培养基中培养后证明了茜素红S染色(图1 (c))。尽管AM-MSCs有成骨分化潜能,其向成骨细胞分化潜力较小的程度上,把更长一段时间相比,BM-MSCs(21天或14天)。

3.2。BMP-2在碱性磷酸酶的表达的影响(高山)在msc

研究BMP-2对msc的成骨分化的影响,在成骨分化培养基培养BM-MSCs和AM-MSCs都有或没有BMP-2补充了28天前他们的高山表达式是由细胞化学的染色。结果表明,BMP-2高山表达增加培养BM-MSCs相比控制(在成骨分化培养基培养BM-MSCs没有BMP-2补充)(图在整个文化时期2(一个))。的高山表达BM-MSCs对待BMP-2稳步增加,最后达到最高水平的文化(文化28天)(图2(一个))。类似于BM-MSCs, BMP-2高山表达增加培养AM-MSCs相比控制(在成骨分化培养基培养AM-MSCs没有BMP-2补充)在整个文化时期。然而,高山AM-MSCs BMP-2对待的表达水平远远低于BM-MSCs培养在同等条件下(图2(一个))。虽然高山BMP-2-untreated组表达水平也稳步上升的末尾文化水平远低于那些BMP-2-treated组(图2(一个))。

(一)
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(b)
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图2
(a)碱性磷酸酶的表达在成骨分化培养基培养AM-MSCs和BM-MSCs补充BMP-2 3、7、14、21、28天。(b)碱性磷酸酶的活性BMP-2诱导成骨分化AM-MSCs BM-MSCs。数据表示为±SEM。 显著差异在成骨分化培养基培养相比,msc。

与定性协议细胞化学的碱性磷酸酶染色,定量高山活动试验证实BMP-2显著调节高山活动BM-MSCs和AM-MSCs在整个文化时期(图2 (b))。的高山活动BM-MSCs和AM-MSCs对待BMP-2稳步上升的末尾文化(文化28天)。然而,AM-MSCs BMP-2对待的高山活动远远低于BM-MSCs培养在同等条件下(图2 (b))。

3.3。的影响BMP-2成骨的基因的表达水平

学习的效果BMP-2成骨的基因的表达水平,成骨的几个基因的表达水平包括runt-related转录因子2 (RUNX-2),osterix (OST)和骨钙素(OCNBM-MSCs和AM-MSCs对待BMP-2测定并与控制(BMP-2-untreated组)。结果表明,BMP-2显著调节的表达水平RUNX-2,OST,OCN在文化BM-MSCs天7、14、21、28成骨诱导后的数字3(一),3(b)3(c))。的表达水平RUNX-2稳步增加,达到最高水平文化第14天之前逐渐下降的末尾文化(图3(a))。不同于RUNX-2的表达水平OST和OCN逐渐增加在整个文化时期,达到了最高点的文化(文化28天)(数据3(b)和3(c))。类似于BM-MSCs, BMP-2显著调节的表达水平RUNX-2,OST,OCN在AM-MSCs文化14天、21、28成骨诱导后的数字3(d),3(e)3(f))。的表达水平RUNX-2,OST,OCNAM-MSCs稳步提高在整个文化时期,达到了最高点的文化(文化28天)。然而,成骨基因的表达水平在AM-MSCs对待BMP-2远低于BM-MSCs在相同条件下培养。尽管BMP-2-untreated组成骨的基因的表达水平也增加了文化的末尾,BMP-2-treated群体的水平要低得多(图3)。


图3
相对BMP-2诱导成骨分化成骨基因表达的AM-MSCs BM-MSCs相比。数据意味着±SEM。 显著性差异而msc在成骨分化培养基培养。
3.4。miR-31的表情,mir - 106 a, mir - 148 a在成骨分化

探索microRNA的表达的改变在msc成骨分化过程中,miR-31的表情,mir - 106 a,和mir - 148量化在天3、7、14、21、28使用TaqMan microRNA化验和存在。结果表明,miR-31的表达时间的方式降低成骨分化过程中BM-MSCs(图4(a))。此外,miR-31的表达BM-MSCs BMP-2治疗后明显降低(图4(一), )。类似于BM-MSCs, miR-31的表达过程中成骨分化AM-MSCs也减少时间的方式(图4(d))。有趣的是,没有显著变化的表达在AM-MSCs miR-31成骨诱导后的第一周相比BM-MSCs。然而,在AM-MSCs miR-31强烈的表达下降后14天的成骨诱导尤其是BMP-2-treated msc(图4(d))。虽然在AM-MSCs miR-31表达下调在成骨分化BMP-2的存在与否,表达水平仍高于BM-MSCs在每一个时间点。此外,mir - 106 a的表达式和mir - 148 a是强劲下调在成骨分化BM-MSCs BMP-2(人物的存在与否4(b)和4(c))。mir - 106 a的表达式和mir - 148 a在成骨分化AM-MSCs也明显减少了时间依赖的方式类似于BM-MSCs(数字4(e)和4(f))。然而,AM-MSCs显示更少的减少mir - 106 a和mir - 148 a表情BM-MSCs相比。重要的是要注意,AM-MSCs显示至少减少mir - 106 a和mir - 148 a表达式。这些数据表明miR-31, mir - 106 a, mir - 148 -一个表达下调过程中成骨分化BM-MSCs和AM-MSCs。迷人地,这些microrna的表达下调水平是在良好的协议与这些msc的成骨分化潜能。


图4
相对微rna表达BM-MSCs (a - c)相比,在AM-MSCs (d-f)。数据意味着±SEM。 显著性差异而msc在完全培养基培养。# 显著性差异而msc在成骨分化培养基培养。
3.5。瞬时转染后的小分子核糖核酸的表达水平与microrna的抑制剂

确定microrna的成骨分化能力的影响的msc、BM-MSCs和AM-MSCs转染anti-miR-31,反- mir - 106 a,反- mir - 148 a。miR-31诱导分化后表达水平,mir - 106 a,和mir - 148被存在量化培养3天,7、14、21。结果表明,与anti-miR-31转染后,miR-31的表达时间的方式降低成骨分化过程中BM-MSCs相比,转染- microrna。类似于BM-MSCs, miR-31的表达过程中成骨分化AM-MSCs也减少时间的方式(图5(一个))。miR-31在这些msc是强烈的表达下降后14天的成骨诱导尤其是AM-MSCs。虽然在AM-MSCs miR-31表达下调在成骨分化anti-miR-31的存在,表达水平仍高于BM-MSCs在每一个时间点。此外,mir - 106 a的表达式和mir - 148 a是强劲下调在BM-MSCs成骨分化的反- mir - 106 a和抗- mir - 148 a(数字5 (b)和5 (c))。mir - 106 a的表达式和mir - 148 a在成骨分化AM-MSCs也明显减少了时间依赖的方式类似于BM-MSCs。此外,有一个剧烈的变化表达式AM-MSCs mir - 106 a和mir - 148 a在BM-MSCs成骨诱导过程相比,消极的控制( )。然而,AM-MSCs显示更少的减少mir - 106 a和mir - 148 a表情BM-MSCs相比。虽然随着时间的推移microrna的表达水平下降3 anti-miRNAs转染组,AM-MSCs microrna的表达水平显著高于BM-MSCs在每一个时间点检查(图5)。

(一)
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(b)
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图5
平均值的相对表达miR-31 (a), mir - 106 a (b),和mir - 148 (c)在成骨分化的AM-MSCs和BM-MSCs anti-miR-31瞬时转染后,反- mir - 106 a,分别和反- mir - 148 a。数据意味着±SEM。 在成骨分化培养基培养显著差异而msc + 10 nM - anti-miR。
3.6。碱性磷酸酶的表达在msc治疗microrna的抑制剂

调查miR-31的角色,mir - 106 a,和mir - 148 a的成骨分化AM-MSCs BM-MSCs的相比,miR-31的抑制剂,mir - 106 a,和mir - 148 a是用来改变miR-31的表情,mir - 106 a, mir - 148 a。高山的表达式检查在msc转染后3、7、14、21天。结果显示,每个microrna的禁忌,miR-31, mir - 106 a, mir - 148 a,抑制使用的组合3 anti-miRNAs增强表达的高山BM-MSCs和AM-MSCs相比在成骨分化培养基培养msc在成骨分化培养基培养没有microrna的抑制剂和msc与消极控制microrna的(图6(一))。然而,结合3 anti-miRNAs没有透露高山的剧烈的变化表达BM-MSCs和AM-MSCs(图6(一))。此外,高山表达AM-MSCs microrna的抑制剂处理后低于BM-MSCs在每一个时间点。

(一)
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图6
(a)高山染色AM-MSCs和BM-MSCs anti-miR-31处理后,反- mir - 106 a,和反- mir - 148 - 3、7、14、21天。(b)碱性磷酸酶的活性AM-MSCs和瞬时转染后BM-MSCs microrna的抑制剂。数据意味着±SEM。 在成骨分化培养基培养显著差异而msc +负控制。#, 美元 相比显著差异在成骨分化培养基培养BM-MSCs + anti-miR-31或反- mir - 106 a或在成骨分化培养基培养AM-MSCs + anti-miR-31或反- mir - 148 a。

细胞内的活动在BM-MSCs高山,AM-MSCs转染anti-miR31,反- mir - 106 a,反- mir - 148 a,和这些anti-miRNAs的组合也使用比色定量评估酶化验在3天,7、14、21。结果表明,在成骨分化培养基培养BM-MSCs 10 nM反- mir - 148 a显示一个明确的优势比别人(图6 (b))。早在7天内与anti-miR-31转染后,反- mir - 106 a,和反- mir - 148 a,或组合3 anti-miRNAs BM-MSCs有高山褶皱增加活动。有趣的是,高山的活动随着时间的推移anti-miRNA-treated组显著增加。在14天、21天,高山活动anti-miRNA-transfected组显著增加2倍,相比之下,msc在成骨分化培养基培养没有anti-miRNA和成骨分化培养基添加anti-miRNA与消极的控制( )。值得注意的是,anti-miR-31转染,反- mir - 106 a,和反- mir - 148 a,或3 anti-miRNAs的结合,感应不到AM-MSCs高山褶皱增加活动与未经处理的成骨分化文化( )。类似于高山染色,尽管高山活动anti-miRNA-transfected群体随着时间的增加,高山活动在BM-MSCs AM-MSCs明显小于在每一个时间点检查(图6 (b))。

3.7。成骨的家族基因的表达在msc瞬时转染后microrna的抑制剂

的microrna的抑制剂对成骨分化的影响潜力BM-MSCs和AM-MSCs通过基因表达分析包括进一步调查RUNX-2,OST,OCN后3、7、14和21天的文化。结果表明,与anti-miR-31转染后,表情的RUNX-2,OST,OCN时间依赖的方式增加成骨分化过程中BM-MSCs相比,那些与负面anti-miRNA转染(数据吗7(一),7(b)7(c))。的表达RUNX-2在BM-MSCs增加随着时间的推移,从第三天到第14天。的顶峰RUNX-2表达式被发现在第14天在成骨分化培养基培养BM-MSCs加上反- mir - 148 a(图7(a))。然而,与这些anti-miRNAs在成骨分化培养基培养BM-MSCs显示更高RUNX-2表达比培养成骨分化加上负控制anti-miRNA(图7(a))。类似于BM-MSCs,RUNX-2表达增加随着时间从每天3 - 21在成骨分化培养基培养AM-MSCs anti-miR-31补充说,反- mir - 106 a,反- mir - 148 a, 3 anti-miRNAs的结合。有趣的是,AM-MSCs对待这些anti-miRNAs表明更高的表达RUNX-2比未经处理的组织(图7(d))。microrna的抑制剂的影响其他成骨的家族基因的表达水平在AM-MSCs BM-MSCs也不同。的表达OST增加随着时间从每天3 - 21在成骨分化培养基培养BM-MSCs和AM-MSCs anti-miR-31补充说,反- mir - 106 a,反- mir - 148 a, 3 anti-miRNAs(的组合数据吗7(b)和7(e))。anti-miR-31转染,反- mir - 106 a,反- mir - 148 a, 3的组合anti-miRNAs显著调节的表达OSTAM-MSCs在天3、7、14、21文化(图7类似于BM-MSCs (e))。然而,BM-MSCs microrna的抑制剂处理有显著提高OST表达比AM-MSCs特别是在21天。类似于OST、最小OCN表达式中检测出BM-MSCs在第三天。的OCN表达水平明显增加BM-MSCs转染anti-miR-31,反- mir - 106 a, anti-miR148a,和3 anti-miRNAs天3、7、14和21,相比之下的消极控制anti-miRNA(图7(c))。的表达式OCN增加相同的程度随着时间的推移在anti-miR-31 AM-MSCs,反- mir - 106 a,反- mir - 148 a, 3 anti-miRNAs的结合治疗组(图7(f))。然而,upregulationsOCN在AM-MSCs anti-miR-31显著观察到,反- mir - 106 a,反- mir - 148 a, 3的组合anti-miRNAs转染组在14和21天(图7(f))。


图7
相对成骨的基因表达在BM-MSCs (a - c)和AM-MSCs (d-f),与anti-miR-31瞬时转染后,反- mir - 106 a,反- mir - 148 - a和3 anti-miRNAs的结合。数据意味着±SEM。 相比明显不同msc在成骨分化培养基培养+ - anti-miR。

4所示。讨论

人类msc多功能细胞在骨髓,脂肪组织和产后组织包括羊膜(17- - - - - -19]。msc一直被视为一个潜在来源细胞疗法由于其产权,促进组织修复(20.,21]。提高成骨分化的方法是最重要的问题之一在骨组织再生20.,22]。骨形成蛋白2 (BMP-2)可能是最重要的生长因子在骨形成在体外和在活的有机体内(4,23,24]。一项研究报道,BMP-2能刺激成骨分化的msc (5,25]。目前,大多数的msc BM-MSCs用于临床和临床前研究领域。尽管如此,骨髓愿望是一种侵入性手术。最重要的,BM-MSCs在骨髓(数量有限26,27]。最近的研究报道,msc可以隔绝羊膜组织没有伤害一个母亲和一个婴儿2,3]。BM-MSCs AM-MSCs显示类似的特征;然而,包括成骨分化潜能的差异也报道(4,28]。AM-MSCs使用更长一段时间比BM-MSCs分化成成骨细胞(3]。因此,AM-MSCs的策略提高成骨分化能力是必要的。这项研究显示,msc从羊膜分离msc的特点根据国际社会的标准细胞治疗(1]。plastic-adherent细胞从羊膜呈形态类似BM-MSCs展出。他们积极为典型的MSC标记包括CD73 CD90、CD105造血标记包括CD34、CD45和消极。这些证据是在和谐与先前的研究1,29日,30.]。此外,AM-MSCs可以分化成脂肪形成的和成骨的血统BM-MSCs相似。然而,AM-MSCs更长一段时间比BM-MSCs分化成脂肪形成的和成骨的血统。

本研究调查AM-MSCs BMP-2的成骨分化的影响比BM-MSCs使用高山染色和高山活动分析。结果表明,BM-MSCs和AM-MSCs有更高程度的高山BMP-2治疗后表达。和谐,成骨的基因的表达也增加BM-MSCs和AM-MSCs BMP-2治疗后。这些证据是与先前的研究表明,相干BMP-2增加了高山和成骨的基因的表达在msc源自脐带(4]。然而,BMP-2-mediated成骨的机制还没有完全隐式。一些研究表明,BMP-2成骨分化的重要生长因子(5,20.,24]。BMP-2调节靶基因的表达,参与成骨细胞分化[31日]。在这项研究中,成骨的基因,包括RUNX-2, OST,OCN是调节在BM-MSCs BMP-2治疗。有趣的是,最高水平的RUNX-2表达在BM-MSCs观察14天。相比之下,最高的表达RUNX-2在观察AM-MSCs 28天。RUNX-2是最早的主人转录因子直接msc分化成成骨细胞(8]。之前研究表明RUNX-2扮演着一个重要的角色在成骨分化的承诺步骤(32]。尽管BMP-2可能增加AM-MSCs的成骨分化潜力,结果BM-MSCs相比不太明显。这可能是由于内源性BM-MSCs和AM-MSCs之间的区别。

几项研究已经表明,microrna与干细胞自我更新和分化有关。他们扮演着重要角色在控制干细胞活动(15,33]。确定microrna的msc的成骨分化的作用,microrna的表达在成骨分化AM-MSCs和BM-MSCs量化使用中存在。结果表明,miR-31的表情,mir - 106 a, mir - 148 a是在成骨分化BM-MSCs和AM-MSCs表达下调。此外,这些microrna的表达也在BM-MSCs和AM-MSCs BMP-2治疗后下降。与anti-miRNAs转染后,高山活动和成骨的标记的表达增加在BM-MSCs AM-MSCs相似。这些差别虽然对这些AM-MSCs microrna能提高成骨分化能力,比BM-MSCs效果不明显。这可能是由于内生的成骨分化能力差异BM-MSCs和AM-MSCs之间。然而,这项研究表明转染anti-miRNAs能提高成骨分化能力BM-MSCs和AM-MSCs就是明证增加高山表达和成骨的基因表达。最近的研究显示,miR-31 mir - 106 a, mir - 148 a时underexpressed人类BM-MSCs的成骨分化。这些microrna的假定的目标,预测的生物信息学分析,包括RUNX-2,CBFB,和我国参与骨形成15]。一项研究报道,miR-31是负的成骨分化的监管机构。MiR-31压抑骨人msc的表达水平降低RUNX-2,OCN,OST(34]。按照这项研究中,anti-miR-31-modified脂肪tissue-derived干细胞通过慢病毒载体用于修复批评-大小的缺点(csd)老鼠结合β磷酸三钙(βtcp)支架。微ct显示miR-31淘汰赛能提高成骨在活的有机体内(35]。此外,抑制了BMP-2 mir - 106 a可抑制骨通过BMP /RUNX-2通路(36]。

总之,这项研究报告的影响BMP-2和成骨分化AM-MSCs和BM-MSCs microrna。结果表明,AM-MSCs很容易被孤立和扩大在文化。BMP-2增强成骨分化AM-MSCs类似于移植BM-MSCs成骨基因的表达等RUNX-2,OST,OCN。高山活动以及成骨的成骨分化过程中基因表达增加BM-MSCs AM-MSCs。与成骨的基因的表达,miR-31的表情,mir - 106 a, mir - 148 a是在成骨分化有所下降。anti-miR-31瞬时转染,反- mir - 106 a,反- mir - 148 a可以增加高山活动和BM-MSCs和AM-MSCs成骨的基因的表达。从这项研究中获得的知识会增加理解机制BMP-2的影响和microrna AM-MSCs和BM-MSCs成骨分化。此外,本研究进一步揭示microrna和BMP-2协同结合的可能性在体外成骨诱导这可能导致骨再生利用msc的进步。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢员工的产房,法政大学医院,为促进标本收集和所有的志愿者请捐赠的组织研究。这项研究是由泰国研究基金的赠款支持(RSA5980042)和干细胞研究的卓越中心,法政大学。