文摘
人类多能干细胞(hPSCs)有能力分化成体内所有细胞类型。这样可以定向到特定的细胞类型分化适当的细胞培养条件或overexpressing lineage-defining转录因子(TFs)。尤其是活化的肌原性的计划,早期研究显示执行的有效性TFs的表达与肌原性的分化有关,如PAX7和MYOD1。然而,直接分化的效率很低,很可能由于染色质hPSCs独有的特性,它阻碍TFs的访问在肌肉分化相关基因。事实上,最近的研究表明,异位表达epigenetic-modifying因素,如组蛋白demethylase和ATP-dependent重构因子显著增强从hPSCs肌原性的分化。在本文中,我们审查的最新进展体外生成的骨骼肌hPSCs通过迫使表观遗传和转录操纵。
1。介绍
细胞的特点主要是由基因表达的模式。在发展的过程中,生成各种我们的身体是由细胞组成的动态改变基因表达模式。人类多能干细胞(hPSCs),如胚胎干细胞(ESCs) [1)和诱导多能干细胞(万能)2,3表达一组特定的基因(“多能性基因”)为多能性[生成基因调控网络4,5]。分化hPSCs涉及这些多能性基因的抑制,如POU5F1 SOX2, NANOG, hPSCs保持未分化状态,和早期发育基因的激活,然后组织基因的激活(6- - - - - -8]。相反,可想而知,强行改变基因表达模式的多能细胞类型特异的状态将导致状态hPSCs到所需的细胞类型分化的体外。
肌原性的分化过程中基因表达模式的变化已经被研究的很透彻了。几个肌原性的转录因子(TFs)被确定为特定阶段分化标记(9,10]。双框转录factors-Pax3 Pax7-are特别表现在肌原性的祖细胞,如卫星细胞,成肌细胞和分化表达下调。基本helix-loop-helix TFs-MyoD和Myf5-are激活骨骼肌卫星细胞和调节规范和分化。使用这些标记作为指导,在体外分化协议开发:与其他类型的细胞和培养hPSCs媒体补充合适的生长因子(11,12]。然而,在大多数情况下,协议需要长期、复杂的步骤,但分化的效率很低。为了克服这些限制,被迫异位表达肌原性的TFs hPSCs已有效地应用(13- - - - - -16]。此外,最近的研究显示,异位表达的表观遗传修饰组蛋白demethylase和ATP-dependent装修等因素因子显著增强TF-mediated从hPSCs肌原性的分化17,18]。
在本文,我们将讨论当前的方法区分骨骼肌细胞通过执行从hPSCs表观遗传和转录操纵,可以直接激活肌原性的基因表达程序。
2。TFs的强制表达导致hPSCs的直接肌原性的分化
第一个试图直接与强迫肌原性的分化表达TFs一直使用鼠标的ESCs执行(制)。Darabi等人证明overexpressing Pax3或Pax7胚状体的身体(EB)制的形成产生高效的肌原性的分化(19- - - - - -21]。当mESC-derived肌原性的祖细胞移植在瘠薄老鼠,这些细胞在肌肉和肌肉功能恢复的道。使用相同的方法,作者随后表明hESC——hiPSC-derived中胚层细胞后PAX7超表达能增加肌原性的祖细胞移植能力高的cardiotoxin-injured老鼠肌肉(14]。此外,其他研究的报道,迫使表达肌原性的regulator-MYOD1-also驱动器为肌原性的分化和hiPSCs。Goudenege等人已经证明MYOD1转换间充质细胞的异位表达来源于为和hiPSCs (MB1-hPSCs) engraftable myoblast-like细胞(15]。达利等人也有效的肌原性的转换hiPSC-derived mesoangioblast-like祖细胞(HIDEM) MYOD1超表达的16]。
在这些实验中,引入TFs进行慢病毒或运载体,和超表达并未直接进行为其或hiPSCs而是来源于中胚层和mesenchymal-like细胞为/ hiPSCs。的确,肌原性的分化的效率低时腺病毒编码MYOD1直接传导为(15]。Albini等人也表明lentivirus-mediated MYOD1过度未能为其诱导肌原性的转换,而类似的MYOD1表达水平有效地诱导肌原性的从人类成纤维细胞分化18]。然而,当一个piggyBac向量系统是用来表达MYOD1, hiPSCs可以成功实现的直接肌原性的转换(13),这表明大量MYOD1 hPSCs蛋白质需要激活骨胳肌细胞生成。这些发现表明hPSCs有相当大的阻力MYOD1-mediated肌原性的转换。
3所示。表观遗传障碍hPSCs对分化
TFs的功能活动需要对基因组的物理访问,这是严格封闭的染色质结构组成的DNA和组蛋白复合物。尤其是TF-binding站点周围的染色质结构扮演着关键的角色在基因表达的调控22- - - - - -25]。组蛋白蛋白质的氨基端尾巴受到各种转译后的修改,包括乙酰化、甲基化、磷酸化,ubiquitylation导致染色质结构的变化(26- - - - - -28]。
多能的ESCs /万能拥有独特的染色质签名为分化做好准备。ESCs /万能,lineage-affiliated基因转录将由“二价”组蛋白修饰,组成的H3 Lys-4 trimethylation (H3K4me3)和H3 Lys-27 trimethylation (H3K27me3) [29日- - - - - -32]。H3K4me3通常是局部的如启动子和基因调控区域与转录激活有关,而H3K27me3通常与不活跃的基因启动子(22]。然而,在ESCs /万能,H3K4me3和H3K27me3都浓缩在与谱系分化相关的基因的启动子区域(图1)。刺激分化时,ESCs /启动的细胞则发育程序通过消除专制H3K27me3标志着从lineage-affiliated基因启动子。快速基因表达可能发生,因为活跃H3K4me3马克仍然在那些推动者。损失的H3K27me3负责组蛋白酶导致脱抑制发育调控基因的公司和为其33,34]。重要的是,H3K27me3压制基因表达的阻碍TFs的绑定和/或功能和/或RNA聚合酶(35,36]。这些结果表明,H3K27me3函数作为一个“表观遗传障碍”ESC / iPSC分化。
在为,超过1500个基因分为二价“H3K4 / K27me3-modified基因”(30.,31日,37),包括肌原性的调控基因,如PAX3 PAX7, MYOD1。染色质免疫沉淀反应分析表明H3K4me3和H3K27me3都浓缩在为其的推动者,而只有H3K4me3富含人类肌母细胞(图2)。这些表观遗传状态对应的基因的表达状态:他们是压抑在成肌细胞为并激活。这些结果表明,除去H3K27me3至关重要的基因表达模式切换的ESCs的肌肉细胞和直接肌原性的ESCs /万能干细胞的分化。
4所示。特定酶去除H3K27me3在分化
组蛋白甲基化是动态受两种酶,组蛋白甲基转移酶和demethylases,添加和删除组蛋白赖氨酸甲基化,分别。添加H3K27me3 Polycomb专制介导的复杂含有组蛋白methyltransferase-EZH2-as酶亚基(38- - - - - -40]。另一方面,移除H3K27me3 Jumonji介导的C (JmjC)域包含demethylases-UTX和JMJD3 [41- - - - - -43]。击倒和基因敲除实验表明,属下和JMJD3所需mPSCs和hPSCs内胚层分化,外胚层和中胚层血统(44- - - - - -51]。有趣的是,尽管属下和JMJD3具体demethylases H3K27me3,其表达水平和模式在为其分化的是完全不同的。例如,在为其属下很高的表达,而表达的JMJD3在这些细胞很低。此外,比较转录组分析未分化和差异化之间的ESCs透露JMJD3显著调节hESC分化成三个胚芽层,而所表达下调(17]。这些发现表明,JMJD3 upregulation是重要的诱导H3K27me3脱甲基作用期间为其的分化。
5。脱甲基的H3K27me3促进MYOD1-Mediated肌原性的分化
操纵JMJD3表达式有潜力改变hPSCs向分化的表观遗传状态。的确,秋山等人表明,强制JMJD3导致全基因组的表达脱甲基的H3K27me3为(17]。此外,过度的c端区域包含催化JmjC域(名为“JMJD3c”)会导致更多的显著减少H3K27me3 JMJD3的全部长度(图3)。当属下,另一个H3K27 demethylase,过表达而不是JMJD3,脱甲基H3K27me3并不发生。这些结果表明,JMJD3来说是一个特殊的表观遗传修饰符产生分化细胞的染色质特征。
(一)
(b)
被迫表达JMJD3c允许为其移植发展基因伴随着H3K27me3脱甲基作用[17]。在这种情况下,与内消旋/内胚层分化相关的基因强烈激活相比neuroectodermal基因。除了内消旋/内胚层的TFs如Brachyury (T)和SOX17, BMP和Wnt-signaling-related基因也由JMJD3c激活超表达。BMP和Wnt /β连环蛋白信号负责内消旋/内胚层分化[52,53),外胚层分化可能会抑制JMJD3c通过mesoendoderm基因超表达网络。
JMJD3c过度激活PAX3和PAX7基因,但不是MYF5或MYOD1 (17),这表明H3K27me3-deficient ES细胞分化成肌原性的祖细胞倾向。生成的染色质状态JMJD3c过度可能类似于间充质细胞或如MB1-hPSCs或HIDEMs mesoangioblast-like细胞。尽管MB1-hPSCs和HIDEMs生成通过信号转导在文化条件变化而分化,H3K27me3-deficient ES细胞直接改变他们的基因表达模式,导致退出从多能状态和移植发育基因,即使文化条件hPSCs并不改变。事实上,PAX3和PAX7基因的激活发生在几天甚至在一个媒介,促进维护一个未分化状态。
染色质结构建立H3K27me3-deficient胚胎干细胞提供了一个合适的状态MYOD1-mediated肌原性的分化。秋山等人表明,其次是MYOD1 JMJD3c超超表达显著上调骨骼肌differentiation-MYOG标记,MEF2C, CKM, SIX1 [17]。肌原性的基因表达程序通过表观遗传变化迅速激活。JMJD3c 4天后和MYOD1超表达,为其显示表达模式类似于骨胳肌管。JMJD3c合作与MYOD1激活肌原性的基因通过改变染色质结构推动者。为JMJD3后MYOD1过度,MYOG和MEF2C推动者丰富活跃的表观遗传marks-H3K4me3和H3K27乙酰化作用。
6。合成mRNA-Based hPSCs肌原性的分化
在先前的研究中,TFs的过度表达是由病毒或转座子向量如慢病毒,腺病毒,piggyBac转座子。这些向量可以有效地诱导hPSCs外源基因的表达,但他们有相当大的治疗应用方面的限制:例如,可能插入突变可能发生由于向量随机整合到宿主基因组。
合成mrna (synRNAs)编码发育调节基因是最有前途的方法之一,导演hPSCs的分化。这种方法消除了基因组DNA整合和插入突变的风险,因此,被认为是适合治疗应用。它已经表明,synRNAs编码重组TFs的转染成纤维细胞可以有效地生成hiPSCs [54]。此外,synRNAs编码lineage-defining TFs如Myod1, Hnf4a, Ascl1可以区分制到骨骼肌,肝细胞,分别和神经元55]。然而,hPSCs synRNA-mediated分化的效率很低。的确,转染synRNA-encoding MYOD1 myocyte-like hPSCs只能生成~ 10%的细胞。当hiPSCs培养的成纤维细胞中4周然后转染synRNA-encoding MYOD1, ~ 40%的细胞成为肌原性的细胞54]。
秋山等人表明转染前JMJD3c-synRNAs MYOD1-synRNAs显著增加肌原性的分化的效率hPSCs [17]。大多数(> 60%)为其可以分化成肌球蛋白重链(MHC)阳性细胞,在几天myotube-like形态(图4)。通过转染4天后,一些分化细胞的表达一个成熟的肌原性的标志,肌酸kinase-M和拥有的能力融合鼠标C2C12成肌细胞的细胞。这些结果表明,myotube-like细胞诱导JMJD3c和MYOD1 synRNAs有潜力成为体外成熟的骨骼肌。
7所示。瑞士/ SWF染色质重塑因子增强MYOD1-Mediated肌原性的分化
最近的一项研究表明,瑞士/ SNF染色质重塑组件BAF60C也促进MYOD-mediated肌原性的转换为(18]。有三种不同的BAF60蛋白质,由不同的基因编码:BAF60A (SMARCD1) BAF60B (SMARCD2)和BAF60C (SMARCD3)。BAF60C骨骼肌细胞中表达但在为其压抑。的表达水平的一个BAF60C亚型,BAF60C2,大幅增加在胚状体的身体(EB)为其的形成。Albini等人报道,顺序BAF60C2和MYOD1慢病毒感染在为提高激活肌原性的项目。BAF60C2和MYOD1-overexpressing为细胞可转化为MHC-positive效率高(~ 60%)通过改变细胞培养条件:漂浮聚集,紧随其后的是分离成单个细胞,随后在标准肌原性的分化培养基培养(18]。感染BAF60C2慢病毒无法在缺乏MYOD1激活肌原性的项目。BAF60C2促进MYOD1和聚合酶II的招聘目标发起人通过加强染色质可访问性。有趣的是,中胚层的基因如Brachyury (T) MESOGENIN,和MESP1不是调节BAF60C2 / MYOD1超表达,表明BAF60C2 / MYOD1可以直接为其转化为骨肌原性的细胞没有通过中胚层的过渡阶段。当BAF60C2 / MYOD1-overexpressing为其作为浮动的集群,不断培养他们成为收缩三维myospheres骨胳肌小管组成。
8。结论
在本文中,我们概述了当前状态的骨骼肌代hPSCs使用表观遗传和转录操纵(表1)。直接分化hPSCs几乎发生的异位表达TFs孤单。被迫介绍hPSCs epigenetic-modifying因素可以促进TF-mediated肌原性的绕过或快速推进中胚层分化阶段。使用染色质结合的方法修改因素和TFs将提高的效率和鲁棒性RNA-based分化系统:一个理想的方法生成footprint-free分化细胞。此外,表观遗传变化被认为是显著变化的主要原因的分化能力不同hiPSC线(56- - - - - -58]。操纵表观遗传状态通过chromatin-modifying因素将允许变更的表观遗传模式甚至低电位hiPSC线条和改善他们的分化能力。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项工作是支持的庆应义塾大学医学科学基金——Mitsunada坂口实验室,嵴计划从日本科学技术振兴机构(JST)和再生医学的研究中心网络实现,日本医学研究和开发署(艾湄湾)。