成功的低成本Scaffold-Free软骨组织工程用人类软骨祖细胞形成的球状体Micromolded Nonadhesive水凝胶

文摘

使用球状体scaffold-free组织工程是指出作为优化的方法软骨构建的交付系统。在这项研究中,我们旨在评估micromolded nonadhesive水凝胶(MicroTissues®)为球体压实(为期两天的文化)和自发的软骨形成(21天文化)使用人类鼻中隔软骨细胞祖细胞(年度"特别关注国")从没有chondrogenic刺激。中国共产党球状体显示直径稳定(486μm±65),高百分比的可行的细胞(88.1±2.1),和低凋亡细胞的比例(2.3%)。球体压实后,合成TGF -β1、TGF -β2,TGF -β3相比明显高于单层( )。生物力学测定显示,最大力量应用于球状体软骨形成后的2.6倍培养2天。自发的软骨形成后,中共N-cadherin球状体完全是积极的,胶原蛋白II型和VI型,aggrecan和硫酸软骨素。对比单层,SOX5和SOX6基因的表达分析qPCR显著调节( )。最后,我们观察到中共球状体的能力开始融合。我们所知,这是第一次在科学文献中,人类的共产党是由球状体micromolded nonadhesive水凝胶,实现一个成功的scaffold-free软骨工程没有chondrogenic刺激(低成本)。

1。介绍

古典组织工程依赖scaffold-based方法的脚手架作为细胞外基质的替代品。尽管合理成功达成的古典组织工程在过去几十年(1),一些显著的问题仍然没有解决,特别是相关的最优输送系统更好的保留和与周围组织的集成。作为一种替代方法,三维组织结构可以产生没有支架(2]。这种策略命名scaffold-free组织工程,指出具有优越的结果因为细胞是负责他们自己的细胞外基质合成优化cell-matrix,和交互,重建本国组织微环境和概括组织形态发生的3]。此外,scaffold-free 3 d结构显示长期保留在植入网站(4]。

颗粒文化、悬滴,和96孔板尤其是用于3 d scaffold-free组织工程软骨结构(5]。在小球文化中,细胞自我组织负责细胞聚集形成运用外部力量。聚集的主要限制与控制和非齐次形状(6]。另一方面,这些球状体形态不同于聚合特别是由于他们不同的维度和总表象与大小有关,厚度,形状。与聚合形成的外部力量,是由使用不依从水凝胶自组装过程形成的球状体模具或平台如悬滴,96孔板,最近micromolded nonadhesive水凝胶(7,8]。最近平台的主要优势micromolded nonadhesive水凝胶是播种与单移液细胞悬液,大幅减少技术错误,并允许自动化(3]。

软骨的第一步发展在发展中胚间充质细胞凝结(9]。的地貌成因的蛋白质转化生长因子(及)总科开始凝结阶段通过增加N-cadherins的表情。事实上,这一阶段是模仿cell-driven球体形成(自组装过程),由于信息交互是由N-cadherins导致球体压实(10]。另一方面,水凝胶,常用在scaffold-based软骨组织工程,负责损害信息交互(11]。也在凝聚阶段,SOX5 SOX6与SOX9蛋白形成一个复杂的密切合作,积极规范col2a1(胶原蛋白类型2 a1)基因表达(12]。因此,细胞外matrix-specific蛋白质如胶原蛋白II型以及aggrecan出现随冷凝(13]。

几项研究已经出版使用scaffold-free软骨组织工程的方法(10,14),其中大部分是使用细胞聚集而不是球状体(15]。除了问题的控制和非齐次形状如前所述,三维细胞培养技术普遍应用聚合形成易受外部力量,危及缩合阶段(2]。在人类对干细胞/祖细胞来源,尽管间充质干细胞/基质细胞显示chondrogenic能力,他们通常进展肥厚性软骨细胞表型(16]。人口的祖细胞停留在关节软骨的表面已经被几个研究小组。这个来源的细胞与间充质干细胞/基质细胞主要相关股票相似之处表面标记表达式和multipotentiality (17]。除了关节软骨,还可以隔离祖细胞从人类鼻中隔软骨(18]。

在这项研究中,我们旨在评估micromolded nonadhesive细胞球体形成水凝胶和压实均匀的尺寸和形状和随后的自发使用软骨软骨形成祖细胞(年度"特别关注国")从人类鼻中隔,首先描述了我们的研究小组(19]。年度"特别关注国"的自发chondrogenic能力已经证明在三维培养系统19,20.]。我们的分析点指球体压实(为期两天的文化)和自发的软骨形成(21天的文化)。从我们所知,这是第一次在科学文献micromolded nonadhesive水凝胶是软骨组织工程测试。此外,我们的年度"特别关注国"有利,因为chondrogenic诱导的细胞培养基是完全免费的诱导因素,如TGF -β1或TGF -β3 (20.)大幅降低的成本优化输送系统使用球状体。

2。材料和方法

2.1。人类软骨抽样

鼻中隔软骨碎片是来自健康的捐赠者( ,年龄从18岁到40岁)接受整形手术。本研究的研究伦理委员会批准Clementino弗拉加球场大学医院,里约热内卢联邦大学,巴西(协议145 - 09年)和知情同意并获得所有捐助者包括在研究。样本储存在4°C在手术后,执行和软骨祖细胞隔离在18小时。

2.2。隔离和在体外扩大软骨祖细胞(年度"特别关注国")

确定特别关注国是孤立如前所述19]。简而言之,鼻中隔软骨碎片与胶原酶IA孵化1毫克/毫升1小时。细胞被离心收获和镀在培养瓶。培养瓶被维持在37°C潮湿大气中5%的二氧化碳与低糖杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;Sigma-Aldrich)补充10%胎牛血清(的边后卫;GIBCO), 100 U /毫升青霉素和100年μg / ml链霉素(Sigma-Aldrich)。媒介是改变每3到5天,直到细胞单层达到融合。在融合,细胞收获0.125%胰蛋白酶(GIBCO)和0.78毫米的乙二胺四乙酸(GIBCO)。

2.3。软骨祖细胞球体文化

球体文化,使用硅胶模具以生产micromolded nonadhesive琼脂糖凝胶(琼脂糖2%超纯琼脂糖,表达载体,卡尔斯巴德,CA,美国在0.9%氯化钠溶液)与300年μ或800μ米直径在每个圆凹(MicroTissues 3 d培养皿,σ)根据制造商的协议(图1)。细胞播种,暂停2×10⁶细胞制备与50 190 ul的DMEM补充μg / ml抗坏血酸(σ),1.25μg / ml白蛋白(FarmaBiagini SPA), 6.25μg / ml胰岛素(诺和诺德公司),100 U /毫升青霉素,100μg / ml链霉素(σ)和Insulin-Transferrin-Selenium,其1 x (Lonza)。细胞密度选择根据硅胶模具制造商的建议(MicroTissues 3 d培养皿,σ)。细胞悬液是小心地播种hydrogel-cell播种室。的micromolded nonadhesive琼脂糖凝胶保持了至少一个小时37°C细胞沉积在潮湿大气中5%的二氧化碳循环深处。之后,2.5毫升的介质被添加到细胞外的播种。18小时后形成球状体和球体文化是维持在37°C潮湿大气中5%的二氧化碳到21天。媒介改变了两次一个星期。所有的分析点指球体压实(为期两天的文化)和自发的软骨形成(21天的文化)。

2.4。球体直径的测量

与300年的球状体培养micromolded nonadhesive琼脂糖凝胶μ或800μ米直径在每个圆凹后进行为期两天的文化和21天文化在光学显微镜下观察(徕卡DMI 6000 B)配备徕卡DF 500数码相机。球状体的直径决定使用AxioVision软件(AxioVs40 V4.8.2.0)与酒吧的每个图像作为参考尺寸测量,用微米表示。结果表示为平均值±标准错误。总共45球状体2或3 micromolded nonadhesive随机测量水凝胶。化验都执行从三个不同的细胞样本(一式三份 )。

2.5。细胞生存和凋亡分析

细胞生存能力分析,在micromolded培养球状体nonadhesive琼脂糖凝胶与800年μ米直径在每个循环深处收集球体压实后(为期两天的文化)和自发的软骨形成(21天文化)和孵化1毫克/毫升胶原酶I型(σ化学),0.125%胰蛋白酶(Gibco), 0.78毫米的乙二胺四乙酸(Gibco)摇晃在37°C水浴40分钟混合通过移液上下每2 - 3分钟(21]。离心后,产生的细胞悬液洗磷酸盐和球状体孵化30分钟在4°C CD44-phycoerythrin (BD生物科学)。随后,细胞被洗了磷酸盐和孵化7-actinomycin D(7操弄,BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)10分钟。细胞凋亡细胞被染色评估与膜联蛋白V和π(碘化propidium)根据制造商的建议(BD生物科学)。对于每一个管,20000事件的两个样本在FACSAria III (BD生物科学)。使用软件的流式细胞术分析流式细胞仪天后8.0 (BD生物科学)。可行的细胞被7 aad排斥被表示为一个百分比的总细胞。从三个不同的细胞样本进行化验( )。

2.6。多路复用分析分泌的产品

球体压实后的培养基被改变(为期两天的文化)和自发的软骨形成(21天文化)micromolded nonadhesive琼脂糖凝胶与800年μ在每个循环深处米直径。单层,培养基是改变了细胞培养2天后。24小时后的培养基的改变,所有样本收集的上清液和冻结在−80°C。上层清液中蛋白质的测定进行了使用LuminexxMAP技术基于磁珠面板识别人类的TGF -β1、TGF -β2,TGF -β3所示。的Bio-Plex Magpix装置(Biorad实验室Inc .)、大力神、钙、美国)校准和验证,试剂重组,准备和标准曲线。实验程序之前清洗步骤与自动Bio-Plex Pro洗车站(Biorad实验室Inc .)、大力神、钙、美国)。每个分泌产物的浓度由xPONENT量化软件4.2版本(Biorad实验室Inc .)、大力神、钙、美国)。结果表示为皮克每毫升(ρg / ml)。的试验进行了三种不同的细胞样本( 从每个样本)使用三个复制。

2.7。生物力学分析

球体抵抗压缩是评估使用Microsquisher (CellScale)设备。球状体培养为球体压实(为期两天的文化)和自发的软骨形成(21天文化)micromolded nonadhesive琼脂糖凝胶与800年μ米直径在每个循环深处收集和处理在一个平台在PBS浴37°C。压缩的平行板施加周期由垂直力的振幅从球体直径的25%。每个周期由负载阶段(20岁)紧随其后的是一个复苏(10)。需要达到25%的最大力量压缩测定球状体。五个周期从三个不同的细胞样本进行了一式三份( )。

2.8。RNA隔离和量化

经过21天的细胞培养、单层和球状体(自发的软骨形成)培养micromolded nonadhesive琼脂糖凝胶与800年μ米直径在每个循环深处是孵化RLT缓冲区(试剂盒,瑞典)。进行RNA提取RNeasy迷你设备根据制造商的指示(试剂盒,瑞典)。协议建立了从动物组织总RNA的净化是用来隔离球状体的材料。单层,RNA提取从1×10⁶建立了动物细胞细胞使用协议。RNA完整性评估了1.5%变性琼脂糖凝胶电泳。分光光度法测定RNA纯度和产量(Nanodrop 2000 c,热科学)在260 nm和280 nm。样品展示A260 / A280 ~ 2.0的比率被认为是基因表达分析。RNA进行隔离从三个不同的细胞样本( )。

2.9。实时定量PCR (qPCR)

的表达水平SOX5、SOX6 SOX9基因,参与软骨形成的规定,进行评估在单层细胞培养和球状体的定量聚合酶链反应(qPCR)。所有试剂都是购自应用生物系统公司,美国。执行qPCR使用AgPath-ID™一步法rt - pcr设备。简单地说,1μRNA (50 ng / l的纯化μl)反向转录和放大10μ包含5 l反应混合物μl 2 x的rt - pcr缓冲,0.4μl 25 x rt - pcr酶混合,和1.25μl酵母RNA 5毫克/毫升(Ambion)。特定的引物和TaqMan®为每个基因探针集从Assay-on-Demand获得基因表达产品(应用生物系统公司)。每个基因的RNA样本运行在一式三份。CASC3(癌症易感性候选基因3)作为参考基因规范化目标基因的表达在单层和球状体样品。热循环条件下由10分钟RT一步45°C, 10分钟的初始PCR激活步骤在95°C (AmpliTaq黄金激活)其次是40周期为15秒95°C,和60°C 45 s (ABI 7500,应用生物系统公司)。SOX基因的相对表达水平计算每个样本归一化后的的几何平均值CASC3基因(内部控制)使用ΔΔCt方法比较相对折叠表达差异细胞培养的单层和细胞培养的球状体。

2.10。组织学和免疫组织化学

组织准备工作,在nonadhesive培养球状体琼脂糖凝胶与800年μ米直径在每个循环深处21天(自发的软骨形成)收集并固定在4%多聚甲醛在磷酸缓冲盐(PBS),在室温下pH值7.4,1 h。组织固定后,在分级乙醇脱水,二甲苯清除,嵌入在石蜡60°C。部分5μm是准备使用呼吸医学切片机(切5062)。部分被收集到0.01% poly-L-lysine-coated幻灯片(σChemica)和苏木精和伊红染色(H / E)。

免疫组织化学分析,石蜡部分收集到silano-treated幻灯片(Starfrost®)。脱蜡后,部分被水化和孵化蛋白阻塞15分钟的解决方案。抗原暴露了只对胶原蛋白II型使用酶chondroitinase ABC(σ化学)37°C为30分钟。使用过氧化物酶阻断内源性过氧化物酶被解15分钟PBS-Tween洗紧随其后。以下主要抗体(Abcam,剑桥,英国)在室温下培养1 h:胶原蛋白II型(1:50),胶原蛋白类型VI (1: 100), aggrecan(1: 100),硫酸软骨素(1:300),和N-cadherin (1: 800)。所有的反应都在同一时刻完成。在PBS-Tween洗涤后,二次抗体染色进行使用Reveal-Polyvalent合装备(代码SPB 125,春天)。过氧化物酶与diaminobenzidine透露(涂液+ substrate-chromogen系统DAB - 125, Spring®)。部分被苏木精复染色,脱水,安装在Entellan®(默克公司),和徕卡dm - 2500光学显微镜下检查。非特异性结合的二次抗体的免疫反应被执行监控缺乏主要的抗体。

2.11。融合分析

球状体培养为球体压实(为期两天的文化)和自发的软骨形成(21天文化)micromolded nonadhesive琼脂糖凝胶与800年μ米直径在每个循环深处收集和转移到96 -平底盘子之前涂以琼脂糖(-ultrapureagarose琼脂糖2%,表达载体,卡尔斯巴德,CA,美国在0.9%氯化钠溶液)为了避免粘附在球状体的表面。四个球状体被播种在每口井的密切联系和维护文化直到7天。每个好蔡司37081相衬显微镜下检查1小时后,1和7天。

2.12。统计分析

非参数和未配对的学生t以及(Mann-Whitney测试)进行比较的数据有关的球状体培养细胞生存能力和机械测试与培养2天21天。单向方差分析测试是用于单层之间的比较,培养2天,球状体和培养21天TGF -球状体β分泌物化验。结果在图表示为平均值±标准偏差,和值小于0.05被认为是具有统计学意义。所有使用软件分析GraphPad Prism 6.0 (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。

qPCR数据的统计分析是使用基于web的RT2分析器执行™PCR数组数据分析软件(SABiosciences,http://www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php)。

3所示。结果

共产党与同质球状体形状(数字2(一个)和2 (c))和大小(数据2 (b)和2 (d)与300年)是由两个nonadhesive水凝胶μ或800μ在每个循环深处米直径。只有1球体/圆形深处被观察到。与300年预期,micromolded nonadhesive水凝胶μ米直径共产党形成球状体直径的减少,大约比800年两次小μ圆形凹槽对应(图2 (b)和2 (d))。细胞培养21天之后,共产党形成的球状体micromolded nonadhesive与300年水凝胶μ米直径在每一个角落已经减少了他们的直径。相反,中国共产党形成的球状体micromolded nonadhesive与800年水凝胶μ米的圆形深处已经增加了他们直径大约在100微米(图2 (d))。

由于共产党在nonadhesive只发现球状体的直径稳定性与800年水凝胶μ米直径在每个循环深处,随后的实验都使用这种类型的模制水凝胶。执行的可行性分析流式细胞仪显示高百分比的可行的细胞消化后中共球状体球体压实的质量(为期两天的文化)和自发的软骨形成(21天文化)(数据3(一个)- - - - - -3 (c))。中国共产党在消化细胞被发现CD44积极性中共球状体(数据的质量3(一个)和3 (b))。此外,凋亡细胞(膜联蛋白V阳性细胞)是罕见的(数字3 (d)- - - - - -3 (f))。

三种亚型的TGF -的剂量β因为这总科执行启动chondrogenic分化。球体压实后(为期两天的文化)的合成TGF -β1、TGF -β2,TGF -β3相比明显高于单层(图中观察到4(一)- - - - - -4 (c))( )。三个TGF -的水平β蛋白质后评估在这项研究中提出了一个减少自发软骨形成TGF -(21天的文化)β3表现出细胞球体培养(图的最低水平4 (b))。尽管减少观察合成的TGF -β1 21天后的细胞培养,TGF -的水平β1仍高于TGF -β3个层次(图4(一)和4 (c))。

作为软骨组织,典型的功能性试验抗压测试进行比较后自发的软骨形成球状体的生物力学性质(21天文化)与压实后(为期两天的文化)。中共培养21天显示球状体的增加他们的部队(μN) 4倍与培养(图2天5 (d)),导致原始直径的25%(的最大变形数据5 (b)和5 (c))。

组织学部分由苏木精和伊红染色显示外部层中共球状体的成纤维细胞的形态与一个圆形的形状(图6(一))。中国共产党完全N-cadherin阳性(图球状体6 (b))。考虑到细胞外基质成分,共产党也积极的球状体胶原蛋白II型和VI(数据类型6 (c)和6 (d))和硫酸粘多糖aggrecan和硫酸软骨素(数字6 (e)和6 (f)自发的软骨形成后(21天的文化)。

SOX基因的表达水平参与chondrogenic过程比较细胞之间培养作为单层和球状体。SOX5和6基因调节后自发的软骨形成(21天文化)( )。如图6 (h)SOX5、SOX6基因表达超过一百倍比单层球状体对应用作控制。尽管SOX9了叠化高于30倍球体样本与控制(单层)相比,这种差异在表达水平无统计学意义( )。

比较后中共球状体压实(为期两天的文化),之后自发的软骨形成球状体(21天文化)融合的能力降低。球状体镀密切联系,1小时后,1和7天,逐步增加这样的距离是注意到(数字7(一)- - - - - -7 (f))。完全融合后观察7天只有共产党球状体压实后(为期两天的文化(图)7 (c))。

4所示。讨论

scaffold-free 3 d来自鼻中隔软骨结构从人类年度"特别关注国"成功的低成本生产使用micromolded nonadhesive水凝胶技术。球状体显示均匀性在他们的大小和形状,一个有效的关键交付scaffold-free软骨结构再生医学的方法(22]。中国共产党建立了基于自组装原理和球状体chondrogenic分化途径评估TGF -完成β1、TGF -β2,TGF -β模块3的合成,增加力量,提出了软骨细胞外基质成分,和过表达SOX5 SOX6基因。此外,我们表明,在体外中共球状体的能力接近对方,甚至融合,可以有趣的成功在活的有机体内植入和长期保留。

通常scaffold-free 3 d技术用于软骨组织工程是基于颗粒文化(20.,悬滴23),和96孔板10,24),最后负责球体形成的两种方法。悬滴是一个可扩展的技术;然而,在文化只有几天可以维持球状体(23]。最近,micromolded水凝胶已成为另一个球体文化由于自动化能力和长期的文化差异分析(25]。相对于96孔培养板,micromolded nonadhesive水凝胶允许种子细胞悬液与单一的移液,大幅减少技术错误反映在球状体大小和形状的均匀性。此外,相比于96孔培养板,可以获得10倍的球状体/板(3]。

在这项研究中,中共在它们的大小和形状显示均匀性和稳定性球状体只有在micromolded nonadhesive与800年水凝胶μ在每一个角落。之间的区别这两种类型的micromolded用于这项研究阐述每个圆的直径深处,因为他们两人现在的800μ在每一个角落(m深度http://www.microtissues.com/3d-cell-culture-products.html)。我们假设micromolded中的直径300μ米在每个角落并不足以让一个精确的自组装过程在整个细胞群在每一个角落。

中国共产党成立与800年的球状体μm micromold直径从486年提出的μm±65。通常,共产党的直径小于球状体,观察到深处由于压实现象由粘附分子,主要是N-cadherins,类似于胚胎发育过程中凝结阶段(5,9]。在这项研究中,压实现象观察2天后中共球体文化。

除了同质性和稳定性在大小和形状球体文化、中国共产党与micromolded 800球状体μm在每个角落显示比例高(88.1±2.1)可行的细胞即使在自发的软骨形成(21天的文化)。很大一部分的细胞分化和随后的可行性是强制性的在活的有机体内植入scaffold-free 3 d结构(26]。可行的细胞被消化后的流式细胞术量化球状体(21]。除了7 aad染色排斥策略(死亡细胞),我们使用表面标记识别共产党细胞CD44 (20.在消化细胞球状体的质量。只有7个aad-negative细胞和cd44阳性的细胞被认为是在我们的分析。更重要的是,细胞可以通过细胞凋亡死球状体的核心。最近,墨菲等人显示相当大的细胞凋亡率只有在700年间充质干细胞从球状体μ米(27]。在我们的研究中,细胞凋亡是一种罕见的事件即使自发软骨形成(21天的文化)。

后压实现象(为期两天的文化)的合成TGF -β1、TGF -β2,TGF -β3中共大大增加比较球状体单层。增加可能与软骨形成的第一步,称为凝结现象(5),类似于压实现象观察到由钙粘素球状体。有趣的是,所有的合成TGF -β亚型减少后自发的软骨形成(21天的文化)。我们的结果支持假设TGF -β对软骨形成的第一阶段是至关重要的(28]。

TGF -β1、TGF -β3亚型是由于软骨形成过程中,同种型β3具有较强的在体外成功的软骨形成的证据在人类间充质干细胞(28]。在软骨细胞,TGF -β1诱导细胞外基质合成[29日]。因为我们代表一个祖细胞来源的细胞来源于软骨,它是合理的属性高的合成TGF -β1 - 21天的细胞外基质合成评价中国共产党球体文化。此外,TGF -β1合成支持我们的假设的自发的软骨形成的球状体。在21天的文化,此外,中国共产党球状体显示抗压缩随时间增加的球体文化成功chondrogenic分化过程的一部分。我们中国共产党支持球状体的变形原始直径的25%,达到约200的最大力量μN,可能由于细胞外基质components-collagen II型和aggrecan30.]。

免疫组织化学分析显示一个成熟的软骨组织的细胞外基质后自发的软骨形成(21天的文化)。我们注意到一个强大和均匀染色的胶原蛋白II型,胶原蛋白类型VI, aggrecan,和硫酸软骨素,都是典型的软骨组织的标记。奇怪的是,N-cadherin的积极性保持直到21天中共球体文化。在胚胎发生过程中,粘附分子间充质凝结是至关重要的,chondrogenic分化[的第一步5]。

一些研究表明,N-cadherin乳沟是软骨形成的进步所必需的(31日]。然而,其他研究显示积极影响N-cadherin不仅在缩合步骤也在细胞外基质的合成在活的有机体内植入(32]。除了cell-extracellular矩阵附着力,cadherin-mediated附着力也参与转导(33]。在这项研究中,N-cadherin维护后自发的软骨形成的积极性(21天文化)可能考虑阻力的增加压缩球体文化随着时间的推移。在21天的文化,巨大的袜三人的过度表达,尤其是SOX5和SOX6,支持中国共产党的成功分化对球状体chondrogenic通路(8]。同样,就像N-cadherin,袜三徒一起增加细胞外基质合成相关蛋白的表达,比如COL2A1 [34),主要的软骨组织的胶原蛋白。

作为一个初步的步骤在活的有机体内化验,我们已经测试了中共球状体相互融合。有趣的是,尽管中共观察到的细胞外基质含量高后自发的软骨形成球状体(21天的文化),他们可以开始互相融合。然而,完整的观察融合后只在共产党球状体压实现象(为期两天的文化)。融合的能力可以反向与阻力的增加压缩球体文化随着时间的推移。由于遵循流体力学定律(球状体35),它是合理的假设,表面张力的增加会导致阻力在球状体融合。另一方面,表面张力的增加反映了稳定和可能表明组织成熟度球状体。尽管scaffold-free方法似乎与周围软骨组织集成,集成边界仍然脆弱(4]。融合的内在能力从共产党球状体后压实现象(为期两天的文化)可以长期保留在植入网站的关键。

的micromolded nonadhesive水凝胶承诺技术是自动化的生物制造scaffold-free 3 d结构。在这项研究中,确定特别关注国球状体负责成功的低成本的组织工程软骨scaffold-free没有外源性刺激(自发分化),支持中共球状体用于组织工程和再生医学方法。我们的下一步将交付中国共产党在临床前球状体在活的有机体内化验。此外,自动化协议的发展进步,目标细胞球体文化的扩展和scaffold-free 3 d软骨大型构造生物制造生物打印方法(36]。

5。结论

3 d scaffold-free软骨结构的制造使用micromolded nonadhesive水凝胶负责软骨结构均匀的尺寸和形状和高细胞生存能力一起使用自动化扩展细胞球体培养的可能性。我们所知,这是第一次在球状体的科学文献年度"特别关注国"从人类鼻中隔生产使用micromolded nonadhesive水凝胶,实现一个成功的组织工程软骨低成本scaffold-free没有外源性刺激。交付共产党介绍一个伟大的承诺改善球状体保留在软骨组织植入网站。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Jose m . Granjeiro弗拉基米尔·米罗诺夫,安德拉·巴普蒂斯塔/概念设计。Mellannie·斯图尔特Renata a . m .松井Matheus f·s·桑托斯伊希斯议会,Mayra美国代理,卡琳娜r·席尔瓦安德森Beatrici,保罗埃米利奥·c·雷特和巴西Falagan-Lotsch方法论。Mellannie·斯图尔特卡琳娜r·席尔瓦安德森Beatrici,保罗埃米利奥·c·雷特和巴西Falagan-Lotsch做数据分析/解释。Mellannie·斯图尔特卡琳娜r·席尔瓦巴西Falagan-Lotsch,安德拉·巴普蒂斯塔和分配的起草。安德拉巴普蒂斯塔,和弗拉基米尔·米罗诺夫Jose m . Granjeiro被分配的重要修订。安德拉·巴普蒂斯塔被批准的文章。

确认

这项工作由国家科学和技术发展委员会(CNPq)通过两个公民授予457541/2013-0 467513/2014-7。这项工作也是部分由卡洛斯恰加斯球场基础研究支持里约热内卢州(FAPERJ)槽国家拨款110.817/2013和190.201/2013。巴西Falagan-Lotsch承认CNPq / PROMETRO(批准号563165/2010-3)。塞萨尔Claudio-da-Silva博士和他们的医疗团队是提供人类软骨样品承认。资金担保了Jose m . Granjeiro安德拉·巴普蒂斯塔,巴西Falagan-Lotsch。这项工作是支持的部分国家再生医学科技中心——INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/)

引用

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