文摘

间充质干细胞(msc)是一种很有前途的工具研究棘手的疾病。不幸的是,msc期间可以很容易地进行细胞衰老在体外由具备干细胞失去扩张。本研究的目的是为了提高使用glabridin msc的具备干细胞和分化,一种自然的类黄酮。评估细胞的生存能力,细胞增殖,β牛乳糖活动,分化,随后逆转录PCR和基因表达的缺失或执行glabridin的存在。Glabridin增强msc的自我更新能力,表明upregulation的OCT4基因。此外,它导致增加成骨分化潜能诱导osteogenesis-related基因的表达等DLX5和RUNX2。我们确认glabridin改善骨的msc的表达显著提升骨钙素和骨桥蛋白基因。总的来说,这些结果表明,glabridin增强msc诱导的成骨分化OCT4基因;因此,对干细胞疗法glabridin可能有用。

1。介绍

间充质干细胞(msc)来自各种组织非常有前途的来源细胞治疗和再生医学,因为它们容易分化成多种细胞类型,包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞(1,2]。msc已经应用于细胞疗法由于其众多的优点包括抗炎和免疫调节作用[3,4]。然而,尽管msc的扩张潜力,培养在体外逮捕,他们容易接受扩散之前重要的端粒缩短由于内在或外在环境因素5,6]。众所周知,氧化应力失衡之间的生产自由基和身体排毒的能力他们的有害影响是诱导衰老的一个主要因素(7]。细胞衰老是一个被捕的状态仍然可行但不刺激增殖血清或通过文化。细胞衰老的msc可以减少功能,这可能会损害他们的再生潜力(8]。因此,msc需要扩大临床应用在体外长期的培养没有早期增长停止或细胞衰老。

Glabridin是一种isoflavan化合物中发现甘草的根提取物(9]。大量的研究报道,glabridin展品对抗氧化压力保护功能和细胞毒性10,11]。此外,据报道抑制人类乳腺癌细胞的癌症干细胞的特性,表明它可以提高乳腺癌治疗的有效性12]。最近,它还表明glabridin变弱氧化损伤和细胞功能障碍和移植成骨细胞分化成骨细胞的细胞基因(13]。这些发现表明了有趣的可能性,对MSC glabridin有积极作用的文化在体外。尽管有证据表明,glabridin保护细胞免受氧化应激,没有研究调查glabridin是否可以防止衰老MSC。因此我们假设glabridin将保留MSC对MSC文化功能和将是有益的在体外。

本研究的目的是检查的影响glabridin MSC在体外文化。治疗的msc glabridin具备干细胞提供了一个有利的环境,改善通过upregulationOCT4基因,参与多能性。探讨glabridin对msc的分化潜力的影响,我们研究了基因对成骨的因素(DLX5和RUNX2),chondrogenic因素(BMP7和SOX9),脂肪形成的因素(PPARG和C / EBPA)。我们发现治疗msc与glabridin导致成骨细胞分化成骨细胞的upregulation标记等骨钙素和骨桥蛋白。据我们所知,这是第一个研究表明glabridin是一个有益的诱发因素OCT4msc在文化的基因,提高成骨分化在体外。这些发现将有助于高度功能性msc对细胞的临床应用做准备。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

骨髓是来自健康的捐赠者在获得书面知情同意。本研究机构审查委员会批准离职延世大学医院的卫生系统,首尔,韩国。如前所述,单核细胞被Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离(法玛西亚生物技术,乌普萨拉,瑞典),和msc培养使用塑料依从性的方法(14]。细胞在DMEM维持低葡萄糖补充10%胎牛血清(青霉素、链霉素的边后卫)和1% (P / S)在37°C公司为5%₂(所有从表达载体,卡尔斯巴德、钙、美国)。每3或4天中被改变。细胞是用0.05%胰蛋白酶/亚文化的EDTA(表达载体)当他们到达大约80 - 90%的融合。Glabridin (0.01 -100μ米)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。

2.2。细胞生存能力测试

细胞被播种到12-well板块(美国纽约康宁公司康宁)4×10的密度⁴细胞/评估细胞的生存能力。第二天,细胞治疗glabridin (0.01 -100μ米),直接添加到介质,24 h。细胞的可行性进行了分析使用CCK-8工具包(Dojindo有限公司、熊本、日本),衡量细胞代谢活动,根据制造商的指示15]。简单地说,50μM CCK-8的解决方案是添加到每个培养板的文化时期的结束。4 h孵化后,吸光度测量在450海里。细胞没有glabridin被用作控制孵化。

2.3。细胞增殖实验

细胞被镀在2×10的密度⁴/在12-well板块(康宁)分析细胞生长。当细胞被山肩,glabridin (0.01 -100μ米)被添加到每个文化板块。使用CCK-8工具包进行扩散试验。CCK-8包含WST-8 [2 - (2-methoxy-4-nitrophenyl) 3 - (4-nitrophenyl) 5 - (2, 4-dissulfophenyl) 2 h-tetrazolium,味精盐),减少生产水溶性甲瓒染料在电子载体的存在。CCK-8,非放射性仪器,让敏感的比色测定可行的细胞的数量在细胞增殖。文化保持了7天,然后分析了细胞生长1天,4、7根据制造商的指示。细胞培养基孵育仅被用作控制。细胞的吸光度是各自第0天吸光度的规范化。

2.4。逆转录聚合酶链反应(rt - PCR)

总RNA分离使用试剂盒试剂(表达载体)。执行标准逆转录使用转录酶II(表达载体)。rt - PCR进行使用PCR引物(Bioneer、大田、韩国)条件下表列出1。甘油醛3磷酸脱氢酶(GAPDH)是作为内部控制水平。产品的信号强度是其各自的规范化GAPDH信号强度。

2.5。殖民地Forming-Unit-Fibroblast (CFU-F)测定

自我评估的属性,一个CFU-F试验。简单地说,1×10³细胞被镀在100毫米菜(康宁)和细胞培养14天。孵化后14天,细胞被洗磷酸盐(PBS;英杰公司)。然后,细胞被沾0.5%结晶紫(Sigma-Aldrich) 5分钟在室温下,和彩色的殖民地被计算在内。

2.6。β牛乳糖染色

衰老细胞显示增加细胞的大小和senescence-associated表达β牛乳糖活动。衰老检测设备(美国CA BioVision Inc .)是用于组织化学地检测β牛乳糖培养细胞的活动,根据制造商的指示。简而言之,培养细胞与PBS洗在室温下和4%多聚甲醛固定。与PBS洗涤后,细胞被孵化β牛乳糖染色溶液在24小时37°C。的数量β光显微镜下-galactosidase-stained细胞数(Olympus-IX71;奥林匹斯山,日本东京)。

2.7。分化分析

诱导MSC分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞,细胞是成骨诱导培养介质,chondrogenic感应介质,或脂肪形成的诱导培养基为3周(Cambrex Lonza,医学博士,美国),分别。媒介是改变每3或4天,和chondrogenic分化的细胞治疗10 ng / ml转化生长因子(TGF)β3 (Cambrex)每当中取代了。与冯Kossa诱导细胞染色证实骨生成,番红精O证实软骨形成和油红O证实脂肪形成。使用阶段的彩色细胞图像拍摄显微镜(奥林巴斯- ix - 71)。测量骨中的钙含量,钙LiquiColor工具包(美国Boerne Stanbio实验室)是根据使用先前描述的方法(16]。简而言之,这些细胞被洗PBS和盐酸处理0.5 N。摇晃3 h后通过使用轨道振动器,浮在表面的被转移到一个新的管进行分析。Ortho-cresolphthalein氨羧络合剂(OCPC)添加到样本,并在550 nm吸光度测定。脂肪形成的定量分析,吸光度测量在500海里与异丙醇使脱色后30分钟根据以前报道的方法(16]。的吸光度定量评估软骨形成硫酸粘多糖为656 nm利用Blyscan化验设备(Biocolor有限公司、安特里姆郡、英国)。短暂,上层清液被转移到一个新管,每个样本与1混合,9-dimethylmethylene蓝色(DMMB)染料,用于衡量硫酸粘多糖(sGAG)内容,根据制造商的说明和一个以前的报告17]。

2.8。统计分析

定量数据表示为±标准差(SD)的手段。是由学生的统计比较t以及和单向方差分析与事后Bonferroni调整(方差分析)。被认为是具有统计学意义的差异 。使用SPSS统计分析软件SPSS Inc .)、芝加哥,美国)。

3所示。结果

3.1。Glabridin对msc的可行性和扩散的影响

调查在MSC glabridin生存的影响,细胞培养与提高浓度(0.01 -100μ米)glabridin 24 h,然后使用CCK-8测定细胞活力测定。Glabridin -50 0.01的浓度μM细胞存活率没有影响,而与100年孵化μM glabridin msc(图的细胞生存能力下降1(一))。这些结果表明,100年μM glabridin本身是msc的细胞毒性。

评估glabridin在MSC增殖的影响,MSC在培养7天,以确定glabridin刺激MSC增长,然后使用CCK-8测定细胞增殖测定。减少细胞生长中检测出msc与100年培养μM glabridin,细胞培养有0.01 -50人μM glabridin展出扩散性质类似的控制细胞(图1 (b))。这些结果表明,glabridin没有促进msc的增长率。

3.2。Glabridin对MSC具备干细胞的影响

为了确定msc的自我更新能力,我们分析了具备干细胞标记物的表达水平在msc培养有0.01 -100人μM glabridin。NANOG,SOX2,cMYC,KLF4,LIN28也表达了与所有浓度的glabridin(图2(一个))。有趣的是,OCT4基因在未分化的干细胞的自我更新细胞明显发现在msc培养5μM glabridin(图2(一个))。因此,我们选择这个glabridin(5的浓度μ米)为所有后续的细胞实验。CFU-F试验是用来调查OCT4表达与glabridin促进msc的自我更新能力。Glabridin相比显著增强自我更新能力的细胞治疗与控制细胞(图2 (b))。此外,确认glabridin是否影响细胞周期,信使rna表达水平P53,P16^INK4a,P21^Cip1与测量glabridin msc治疗。的表达水平P53,P16^INK4a,P21^Cip1的msc治疗glabridin下降相比在控制细胞(图2 (c))。我们下一个检查是否glabridin阻止MSC衰老。msc治疗glabridin显示下降的百分比β-galactosidase-stained细胞相比,控制细胞(图虽然没有意义2 (d))。在一起,这些结果表明,glabridin增强upregulation的自我更新能力OCT4基因。

3.3。Glabridin msc分化潜力的变化

我们随后检查了骨,软骨形成和adipogenesis-related msc glabridin治疗后的基因表达水平。DLX5和RUNX2基因,参与骨,被glabridin显著调节(图3)。对软骨形成,BMP7基因调节,而的表达SOX9基因是类似于msc glabridin处理(图3)。的adipogenesis-relatedC / EBPA表达的基因同样glabridin-treated msc与控制细胞相比,而的表达水平PPARG基因减少glabridin治疗(图3)。这些结果表明,glabridin强烈影响成骨的msc的潜力。

3.4。Glabridin增强骨msc

评估msc的分化能力,细胞被glabridin形成诱导成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞。msc治疗glabridin显示大量的冯Kossa染色法,对含钙矿化结节检测,而控制细胞(图4(一)),的表达骨钙素和骨桥蛋白成骨分化标记的基因调节在msc glabridin处理(图4 (b))。此外,我们确认msc与glabridin培养有较高程度的钙积累而控制细胞虽然没有明显差异(图4 (c))。软骨形成评估了红色染料染色。chondrogenic感应后,msc培养glabridin表现出chondrogenic分化能力(图略高5(一个))。然而,电脑及相关知识和I型胶原蛋白chondrogenic分化标记的基因同样表示尽管chondrogenic归纳在两种情况下(图5 (b))。硫酸粘多糖含量略增加与glabridin msc成长,无论PCR(图数据5 (c))。没有显著差异。在脂肪生成,glabridin稍微抑制脂肪形成的差异化,如图6(一)。此外,AP2和LPL基因glabridin-treated adipogenesis-related标记略有减少的细胞没有显著差异(图6 (b))。我们还证实,脂滴的吸光度值与glabridin msc诱导减少(图6 (c))。在一起,这些结果暗示glabridin显著增强移植msc的成骨分化能力的骨钙素和骨桥蛋白基因。

4所示。讨论

成体干细胞,msc已经广泛用于临床应用,因为他们的塑料和抗炎作用18,19]。虽然msc代表一种新的方法来治疗棘手的疾病,临床试验使用这些细胞阻碍了低数量的细胞和细胞培养的困难,称为细胞或复制衰老。msc可以很容易地进入一个国家经济增长的逮捕,被称为衰老,尽管高自我更新能力的内部和/或外部刺激(5]。因此,msc的文化和维护不具备干细胞的损失非常重要的广泛的临床使用。

一般来说,细胞受到多种生物化学和生物物理因素的影响,如细胞外基质(ECM)和可溶性因子(20.,21]。以前,我们使用poly-L-lysine预防衰老和增强MSC增长(锁相环)的基质蛋白(22]。锁相环绝对msc的增殖能力和功能的改善。然而,使用锁相环作为涂层基质是耗时的,因为文化船只应该孵化和锁相环涂层后干了很长时间。金等人报道,glabridin,最近的一个主要活跃在甘草黄酮类化合物,变弱氧化损伤和改善成骨分化功能13]。也称glabridin抑制肝癌细胞的癌症干细胞的特性(23]。细胞衰老是非常与氧化应激密切相关(24]。在目前的研究中,我们应用glabridin,有抗氧化活性,细胞培养条件。我们发现glabridin没有显著影响骨骨髓来源msc的可行性。此外,glabridin没有激活细胞增殖在体外文化。我们的表达水平进行了分析OCT4,NANOG,SOX2,cMYC,KLF4,LIN28具备干细胞基因被称为标记的干细胞研究分子模式的自我更新能力。NANOG,SOX2,cMYC,KLF4,LIN28参与的多能性干细胞自我更新,也表达了在所有条件。OCT4,一个重要的转录因子在多能性的维护,在胚胎干细胞中表达的是25]。此外,OCT4是一个非常重要的基因的产生诱导多能干细胞(26]。众所周知,OCT4作为一个特定标记的胚胎干细胞,也表达了msc (27]。然而,很难探测到的表达OCT4在msc,因为它容易消失的文化在体外(28]。最近,Piccinato等人表明,高OCT4基因表达可能是一个潜在的特点和预测更大在体外寿命和增长潜力的msc (29日]。这些结果表明的表达水平OCT4基因可能是一个特定的因素影响MSC衰老。

在这项研究中,OCT4强烈诱导基因的5μM glabridin。然而,没有存在剂量依赖的相关性OCT4由glabridin表达式。相反,msc治疗100μM glabridin没有表达OCT4。的表达OCT4可能是抑制生存能力下降,如图1。msc glabridin处理时,观察他们的自我更新能力的显著增加,这意味着glabridin增强CFU-F通过诱导能力OCT4基因。几项研究已经报道,细胞衰老的监管P53,P16^INK4a,P21^Cip1通过活性氧的积累途径(30.- - - - - -32]。我们已经确认了P53,P16^INK4a,P21^Cip1信使rna表达水平受到抑制glabridin尽管没有意义。这些结果与以前的研究结果一致,证明细胞衰老的msc可以通过抑制抑制P53和P21^Cip1(33]。此外,glabridin推迟MSC衰老所观察到的β牛乳糖染色,表明glabridin积极影响在msc培养细胞衰老在体外。在一起,这些结果强烈支持,glabridin antisenescence效果。

最近,据报道,MSC治疗glabridin导致碱性磷酸酶(ALP)活性的一个重要高度,胶原蛋白含量,和成骨细胞分化基因的表达13]。调查glabridin对MSC分化的影响潜力,trilineage(成骨、软骨形成,脂肪生成)-相关关键转录因子分析rt - pcr与glabridin而控制细胞治疗后。msc glabridin处理时,重要基因表达的增加DLX5和RUNX2观察骨生成。在差异化分析,我们的研究结果表明,glabridin可以显著提高成骨分化能力的重要upregulation骨钙素和骨桥蛋白骨生成的基因标记。关于软骨形成,硫酸粘多糖含量也升高glabridin,但glabridin没有影响chondrogenic分化标记基因。此外,glabridin略减脂肪形成的分化能力的变化与脂肪形成相关基因的表达水平。这些结果与之前的结果,证明超表达的DLX5骨生成的一个关键因素,抑制脂肪形成的标志基因的表达(34]。在目前的结果,增强骨生成人类msc的抑制脂肪形成,由于反向分化成骨、脂肪形成的关系。

总之,我们已经表明,glabridin提高成骨分化能力的msc诱导的表达OCT4多能性的基因因素和增加DLX5和RUNX2基因表达对骨生成如图7。我们得出这样的结论,glabridin可用于MSC文化系统在体外。此外,使用glabridin MSC文化将极大地促进再生医学和细胞疗法包括骨骼疾病。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。作者没有商业、专有或经济利益在本文中所描述的产品或公司。