文摘

微环境中发挥着重要作用的干细胞增殖和分化。大分子拥挤(MMC)最近被证明协助干细胞体外微环境形成自己的矩阵。MMC的能力来支持脂肪干细胞(ASC)增殖、代谢,和multilineage分化进行了研究在不同条件下:胎牛血清(的边后卫)和人类血清-基于(HS)的媒体和韩国帝王和无血清(XF / SF)媒体。此外,对asc在MMC的immunophenotype评估。的增殖能力对asc在MMC在每个条件减弱。然而,成骨分化增强在MMC,矿化沉积的增加矩阵所示的边后卫和商品文化。同样,明显更大的脂滴的积累和增加胶原IV沉积表示增强脂肪生成在MMC的边后卫和商品文化。相比之下,chondrogenic分化是减毒对asc扩大在MMC。ASC immunophenotype维持在MMC CD54的表达显著升高。然而,MMC受损的代谢活动对asc和分化能力在XF /科幻条件。 Both the supportive and inhibitory effects of MMC on ASC are culture condition dependent. In the presence of serum, MMC maintains ASC immunophenotype and enhances adipogenic and osteogenic differentiation at the cost of reduced proliferation.

1。介绍

在人体内部,细胞周围微环境,生理上挤满了可溶性因子,其他细胞和细胞外基质。典型的血清蛋白生物液体的浓度,例如,在组织液30 - 70 g / L, 80 g / L的血浆,甚至200 - 350 g / L细胞细胞质(1]。相比之下,典型的体外血清蛋白浓度是1 - 10 g / L,作文是保持朴素、简单的只有最基本的组件,例如,提供附件和生长因子(1]。因此,此不良对应原来的组织微环境。大分子拥挤(MMC)方法解决这个问题通过修改微环境,促进细胞外基质(ECM)的形成和改造(1,2]。大分子克劳德函数通过排除体积效应(夜)3]。围绕给定的分子体积变得不可用其他分子,从而导致更高的有效浓度不同的大分子在溶液中。此外,夏娃的数量依赖于部分体积占用(FVO),它被定义为大分子所占据的总量的一小部分。因此,MMC影响许多基础知识,例如,酶反应、细胞骨架的形成,细胞粘附和迁移1,3- - - - - -6]。

以前,MMC对干细胞行为的影响主要研究使用骨骨髓来源间充质干细胞在胎牛血清(BM-MSCs)——(的边后卫)基于文化(2,7- - - - - -9]。然而,人类脂肪组织是另一个有吸引力的和丰富的多功能干细胞来源,称为脂肪干细胞(对asc)。对asc能够分化成多种细胞类型中胚层起源的10,11和低免疫原性12- - - - - -14和免疫调节特性15- - - - - -18]。由于这些特点,对asc是有前途的候选人为临床应用和一些临床试验目前正在进行审查19,20.]。

干细胞疗法往往需要大量的细胞,通常在体外细胞扩张前体内植入。传统上,的边后卫被用于干细胞的文化。用于临床,动物组件在文化媒体提高安全问题与异种的污染在细胞移植和异种的转移感染(21,22]。牛抗原抗体也可以引起重复政府的细胞,这将影响细胞治疗的疗效。因此,xeno-free (XF)替代品如人类血清- (HS) (23- - - - - -25]或血小板——(PL)派生的补充剂26- - - - - -28)以及完全定义的XF和血清(SF)条件29日,30.)已经开发了ASC文化。HS-based方法不仅临床应用潜力还缺点,例如,有限的可用性和lot-to-lot变化(31日]。这些挑战可以避免代替定义和/或动物组件定义XF /科幻试剂有可再生的成分(29日,30.]。此外,仔细描述ASC行为临床相关体外培养条件对细胞疗法的进步至关重要。

本研究的目的是调查MMC的潜在支持ASC增殖和multilineage分化能力和分析对ASC的MMC immunophenotype和形态在不同培养条件下考虑临床应用。在最近的研究中,细胞隔离和扩张进行了并行的边后卫和HS-containing媒体和与XF定义/科幻条件。MMC方法在ASC文化中未见报道,特别是不同的文化条件MMC的使用是一种新颖的方法。我们当前的研究表明支持和MMC的抑制方面ASC文化在不同血清条件和显示了有前景的结果对ASC成骨、脂肪形成的差异化在MMC的边后卫和商品文化。

2。材料和方法

2.1。道德因素和组织采购

脂肪组织的集合是毕卡医院伦理委员会批准的地区在坦佩雷,芬兰(伦理批准R03058)。脂肪组织样本进行择期手术期间获得的整形手术,坦佩雷大学医院,坦佩雷,芬兰,与病人的书面同意,并依法进行的这项研究是1975年赫尔辛基宣言》,在1989年香港修订。对asc从脂肪组织分离样品的信息,4名女性捐赠者(平均年龄52±12)。

2.2。隔离和对asc的扩张

对asc脂肪组织中分离的样品分为三个不同的文化条件:中包含的边后卫,商品,或定义XF /科幻文化条件。对asc隔离进行了使用机械和酶方法如前所述10,11,30.,32]。短暂,脂肪组织是手工剁碎成小碎片和胶原酶消化NB 6 GMP级(美国赛瓦电泳GmbH,海德堡,德国,http://www.serva.de)。消化组织离心和过滤对asc顺序步骤单独从周围组织。的边后卫和HS条件,杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) / F-12 1: 1(位于马里兰州Rockville生命技术)补充1% L-alanyl-L-glutamine (GlutaMAX我;生命技术),1%的抗生素(p / s;100 U /毫升青霉素,链霉素0.1毫克/毫升;Lonza Walkersville,医学博士http://www.lonza.com),10%的边后卫(生命技术)或10% HS(人类血清AB型;Lonza)。XF /科幻条件下,细胞被孤立如前所述[30.]。短暂,先前描述的隔离步骤后,细胞被播种在carboxyl-coated烧瓶(PureCoat羧基T75;血压得到较好的控制BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,http://www.bdbiosciences.com)和扩展StemPro®MSC SFM XenoFree(生命技术)与1% GlutaMAX我补充,0.3%的抗生素,10% StemPro MSC SFM XenoFree补充。从通道1起,XF /科幻细胞扩大在StemPro MSC SFM XenoFree中补充了CELLstart CTS涂层(生命技术)根据制造商的指示。对asc在所有条件使用TrypLE选择分离(技术)。培养基配方用于的边后卫,HS和XF /科幻文化展示在表1。细胞从四个捐助者immunophenotype分别分析,增殖,代谢活动,向成骨分化和chondrogenic血统,而脂肪形成的差异化进行三个供体细胞的边后卫,HS和XF /科幻条件。

2.3。大分子拥挤在ASC文化

鸡尾酒的大分子包含FicollTM400 (PM400, 17-0300-50;通用电气医疗集团,生物科技AB)和FicollTM70 (PM70, 17-0310-50;通用电气医疗、生物科技AB)溶解在文化媒体在室温下温柔的风潮。体积分数入住率为17% (v / v)实现了浓度为37.5毫克/毫升的FicollTM70 25毫克/毫升的FicollTM400如前所述[3]。在使用前MMC培养基是无菌过滤。从通道1起,的边后卫,HS-expanded细胞被分成两个种群,一半是扩大在标准媒体和另一半在MMC,直到分析。因为技术原因,XF / SF-expanded细胞被分成两个种群从通道2起和扩大在标准XF /科幻媒体和MMC,直到分析。实验结果见图的工作流程1。

2.4。脂肪干细胞Immunophenotype

对asc扩大在标准条件和在MMC的边后卫,HS和科幻/通道4中使用流式细胞仪分析了XF (FACSAria;BD生物科学、Erembodegem、比利时)来确定的immunophenotype细胞。单克隆抗体(mab)对CD11a-allophycocyanin (APC), CD80-phycoerythrin (PE), CD86-PE, CD105-PE(研发系统公司,明尼阿波利斯,美国),CD3 (PE), CD14-phycoerythrin-cyanine (PECy7) CD19-PECy7, CD45RO-APC, CD54-fluorescein异硫氰酸酯(FITC) CD73-PE, CD90-APC (BD生物科学),CD34-APC, HLA-DR-PE (Friesoythe ImmunoTools GmbH,德国)。每样分析了10000个细胞,无污点的细胞样本用于正确的自发荧光背景(32]。

2.5。ASC形态、代谢活动和增殖

对asc是由光学显微镜观察发现形态变化在细胞扩张的边后卫,HS和XF /科幻在标准条件下媒体和MMC。在上述条件下对asc的代谢活动是评估与细胞计数Kit-8 (CCK-8)(豆类生物有限公司、志贺、日本)通道4。分析是基于四唑盐的乳沟线粒体脱氢酶酶,使色度评价细胞增殖和代谢活动。对asc被播种在48-well板密度2500细胞/厘米²和代谢/线粒体活动评估,4、7、11天。总之,在每个时间点,细胞培养基被删除,和DPBS(杜尔贝科的磷酸盐、Lonza BioWhittaker, Verviers,比利时)和CCK-8试剂添加10:1。48-well板是孵化3小时37°C,和相对线粒体活动标仪测量(Victor 1429 Multilabel计数器;Wallac;芬兰图尔库)在450海里。

细胞数据量化使用CyQUANT®细胞增殖试验装备(分子探针,表达载体,佩斯利,英国)在通道4如前所述[33]。短暂,细胞细胞溶解0.1% Triton-X 100缓冲区(Sigma-Aldrich)和上层的收集和储存在−80°C,直到最后的分析。荧光信号测量的标在480/520 nm。代谢活动被CCK-8细胞增殖试验是规范化的手机号被CyQUANT量化细胞增殖试验装备。

2.6。Trilineage分化潜能

成骨、脂肪形成的,和chondrogenic分化潜力评估XF /科幻条件与HS和媒体的边后卫在标准条件下通道4 MMC。对asc的成骨和脂肪形成的分化能力分析在四个不同的治疗组(I-IV)见图1和chondrogenic分化进行了研究在两个不同的治疗组(二世和IV)(图1)。用于分化的培养基配方分析如表所示1和工作流如图的实验1。

成骨分化,细胞被播种在12-well板密度为2.0×10³细胞/厘米²在媒体扩张和感应启动细胞48 h后播种。诱导后28天,成骨分化与茜素红S量化方法如前所述[25]。简而言之,与4%多聚甲醛固定细胞(PFA)和染色茜素红溶液(2% Sigma-Aldrich;pH值4.2),紧随其后的是几个用蒸馏水洗。光显微细胞成像用于定性分析和100毫米氯化十六烷吡啶萃取(3 h孵化;Sigma-Aldrich)是用于定量分析。染料强度标决心在540海里。

对asc脂肪形成的差异化,被播种在24-well板的初始密度1.05×10⁴细胞/厘米²。脂肪形成的分化开始当细胞达到融合如前所述[2)使用三个周期感应随后3天4天的维护。经过21天的分化,尼罗红染色和定量附着血细胞计数被用来评估胞质脂质积累的面积。总之,细胞培养与PBS冲洗,固定在4%甲醛和costained 30分钟,5人μ克/毫升的尼罗红(N3013;和0.5σ)胞质脂滴μ克/毫升的DAPI (D3571分子探针®;生命技术)核DNA如前所述34]。附着血细胞计数显示执行先前描述的协议(2]。简单,细胞获得使用2×放大图像cool-SNAP总部尼康相机连接到TE2000显微镜(尼康仪器)和分析使用Metamorph成像系统软件6.3 v3(分子设备)。脂肪形成的差异化的程度被尼罗红荧光和量化规范化核数。端数据与脂滴的总面积/归一化细胞数(μ米²/核)。

IV胶原IV)染色法被用来评估ECM蛋白质的沉积在MMC经过21天的脂肪形成的归纳。简单地说,对asc是固定的4%甲醛和阻塞的3%牛血清白蛋白(BSA)在PBS 1小时。使用主要抗体进行免疫荧光坳IV (Abcam ab6586, 1: 500年,剑桥,英国)和孵化一夜之间在4°C 1% BSA在PBS。二级抗体使用是594年山羊兔抗体(Alexa萤石A11072, 1: 400年,分子探针,Thermofisher科学)。图像被抓获的IX71倒置荧光显微镜(奥林巴斯)。

chondrogenic分化潜力评估micromass文化如前所述[32,35- - - - - -37]。简单地说,8×10⁴细胞被播种在24-well培养板10μL体积和球状体被允许在3小时内形成之前的chondrogenic感应介质。21天chondrogenic感应后,分化是利用阿尔新蓝染色证实如前所述[37]。短暂,micromass文化是固定的4% PFA和存储在70%乙醇。丸是脱水,嵌入在石蜡,切割5点μ米厚度。与阿尔新蓝染色的部分(pH值1.0)来验证存在的硫酸粘多糖(笑话)核快红溶液(美国马Biocare医疗、和谐)复染色。

2.7。统计分析

与IBM SPSS统计分析软件版本21 (IBM公司,阿蒙克,纽约,www.ibm.com)。由于数据不是正态分布,非参数Mann-WhitneyU测试是用于分析不同培养条件对细胞增殖率的影响,细胞表面的蛋白质,和分化潜能。的当多个值的数量乘以比较进行比较。(CyQUANT)增殖和代谢活动(CCK-8)价值乘以42,量化AR和NR染色数据价值乘以24的总数进行比较。非参数斯皮尔曼相关测试是用于研究细胞的DNA含量和代谢活动之间的相关性。结果被认为是显著的值小于0.05。数据的平均值±标准偏差(SD)。

3所示。结果

3.1。MMC在细胞表面标志物的影响

对asc的特征immunophenotype维持在MMC ASC-expressed干细胞标记CD73, CD90、CD105在所有研究条件(图2(一个))。没有表达CD3也CD11a、CD14、CD19, CD80、CD86和HLA-DR(图的研究条件2 (b))。有趣的是,CD54的表达显著增加(在MMC在所有文化条件下)。平均而言,对asc显示低到中度表达CD34造血祖细胞标记。虽然有些变化是观察之间的文化条件,可以确定无统计差异CD34由于大型捐赠者捐赠变异。对asc暴露在MMC在细胞扩张通道1到4的边后卫和HS媒体(图1)。然而,MMC不支持对asc XF / SF-expanded扩散。获得足够的细胞数量的流动仪分析,XF /科幻细胞进行了分析后7天的暴露在MMC。

3.2。细胞形态

MMC对细胞形态的影响是明显的在所有研究文化条件;细胞通过一个圆形的形态,成为更大的大小在MMC。特别是对asc XF / SF-expanded的形态发生了巨大的变化在MMC(图3(一个))。细胞数量显著下降特别是XF /科幻MMC条件与标准的文化。和几个扩展和多核细胞也观察到在XF /科幻小说中在MMC(图3(一个)插图)。

3.3。手机号

的存在与否对asc扩大在MMC (±MMC)从通道1到3的边后卫和HS媒体和段落2到4 XF /科幻媒体(图1)。DNA量指示细胞(图3 (b)4)分析了通道。发现显著增加细胞数量从1天在每个文化条件(图113 (b)),除了XF /科幻介质在MMC (XF /科幻+ MMC)。此外,观察细胞数量明显高于标准文化XF /科幻条件下相比,在标准的边后卫()和HS ()文化(XF /科幻−MMC的边后卫−MMC和HS−MMC)在每次points-days 1、4、7、11。细胞数量也显著增加在标准HS媒体(HS−MMC对HS + MMC)在第一天(),在标准的边后卫媒体(的边后卫−MMC对的边后卫+ MMC) 4天()、7和11 ()与MMC的文化。在MMC,时刻points-days 7和11细胞数量明显高于HS媒体(在媒体的边后卫)比(h + MMC和的边后卫+ MMC)。的扩散对asc XF /科幻研究了媒体在MMC只有一个捐赠者,因为细胞来源于其他三个捐赠者无法扩大MMC在XF /科幻的条件下。细胞数量减少XF在MMC /科幻小说中明显的价格相比标准XF /科幻文化(图3 (b)),但没有统计学差异可能是由于低数量的重复。

3.4。代谢活动

对asc的代谢活动与CCK-8测量分析和归一化总DNA CyQUANT细胞增殖测定(图3 (c))。统计上显著的增加代谢活动在媒体的边后卫在MMC ()1天的价格相比标准的边后卫媒体(的边后卫+ MMC和的边后卫−MMC)(图3 (c))。在MMC,细胞的边后卫媒体有一个更高的代谢活动与细胞HS媒体(的边后卫+ MMC和h + MMC) 4天()、7和11 ()时间点。自从MMC不支持对asc的扩散在XF /科幻媒体,研究代谢活动只能与一个捐赠者XF /科幻条件MMC (XF /科幻+ MMC)。代谢活动显著增加()随着时间的推移(11)从第一天到天在每个标准文化和媒体在MMC的边后卫。代谢活动也与ASC数量分析的斯皮尔曼相关测试(系数0.78;)。

3.5。Multilineage分化

成骨、脂肪形成的分化能力进行了研究使用标准感应协议存在与否的MMC (D±MMC)后细胞扩张的边后卫,HS和XF /科幻条件(E±MMC)从通道1到3 (HS的边后卫条件)和从通道2到3 (XF /科幻条件)(图1)。Chondrogenic分化进行了研究使用标准的感应(D−MMC)后细胞扩张的存在与否MMC (D±MMC)。成骨、脂肪形成的和chondrogenic分化诱导在通道4。细胞在XF /科幻条件MMC没有显示有效的分化能力,这是符合显著降低扩散能力观察在XF MMC /科幻媒体。因此,XF /科幻的分化的结果提出了在补充数据(见附加图在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/6909163)和multilineage分化的边后卫和HS细胞的结果给出数据4- - - - - -6。

3.6。成骨分化

在媒体的边后卫,在感应阶段的MMC显著增加成骨分化()细胞在MMC-free扩大媒体(E−MMC和D + MMC与E D−−MMC和MMC;图4使用定量茜素红染色法)进行了分析。显著增加成骨分化()在细胞扩大MMC-free媒体和诱导下MMC与细胞扩大MMC的边后卫和诱导MMC-free媒体条件下(E−MMC和D + MMC和E + MMC和D−MMC;图4)。然而,HS条件优越的成骨分化((图)相比的边后卫条件4)。没有统计学差异观察不同商品之间的感应组(图4 (b)),表明添加MMC对成骨分化HS媒体没有显著的影响。明显成骨分化观察所有商品的边后卫条件相比,各自noninduced(负控制)文化(补充图)。

3.7。脂肪形成的分化

分析了去使用规范化的尼罗红染色细胞数量。对asc的边后卫和HS条件,扩大在MMC-free媒体积累更多的脂质含量下感应与MMC ()与标准感应(E−MMC和D + MMC与E D−−MMC和MMC;数据5(一个)和5 (b))。增加脂肪形成诱导下MMC对asc也观察到在MMC扩大媒体的价格相比标准感应(E + MMC和D + MMC和E + MMC和D−MMC;数据5(一个)和5 (b))虽然不是定量意义重大。有趣的是,细胞,扩大在MMC和诱导下MMC-free媒体显示增加的脂肪形成能力(),而细胞扩大MMC-free媒体(E + MMC和D−−MMC和E MMC和D−MMC;数据5(一个)和5 (b))。此外,更多的脂质滴观察HS媒体()相比,在媒体的边后卫在标准归纳(HS E D−−MMC和MMC和的边后卫E D−−MMC和MMC)。的价格相比noninduced(负控制)文化相同的治疗组,观察明显更强的脂肪形成的差异化在所有条件的边后卫和HS媒体(补充图)。

MMC矩阵坳四世的沉积增加,这是评估使用坳静脉脂肪形成的诱导的免疫荧光染色后21天(图5 (c))。坳四世沉积是增强在MMC感应与标准脂肪形成的诱导下的边后卫和HS媒体(E±MMC和D + MMC与E±MMC和D−MMC;图5 (c))。此外,第四坳沉积在HS增强媒体的价格相比的边后卫在各种条件下的媒体,这是符合去观察HS媒体越强。基于定性坳IV染色,坳IV的数量依赖于脂肪形成的分化效率。XF /科幻条件,坳IV是沉积在MMC感应与标准感应(E−MMC和D + MMC与E D−−MMC和MMC;补充图)。

3.8。Chondrogenic分化

对asc Chondrogenic分化很明显在所有研究文化条件。然而,有更多的蛋白聚糖沉积后扩张基于定性阿尔新蓝染色标准条件。micromass颗粒的密度较低的组织架构是由扩展的细胞在分化(图之前MMC6)。

4所示。讨论

先前的研究已经表明,三菱汽车将增加热力学活动和生物过程由几个数量级,将促进细胞体外重建一个更健壮的微环境(5,38]。我们目前的研究表明MMC在ASC增殖和分化的影响临床相关的文化条件。这是一个新颖的方法,MMC ASC特性的影响并没有先前报道。然而,我们和其他人已经表明,不同文化条件下极大地影响ASC增殖和分化能力(24,29日,30.,39]。细胞治疗越来越普遍,有效的体外细胞扩张和分化方法是重要的实现最优的和可预测的临床结果。

在以往的研究中使用人类BM-MSCs MMC的好处已经被增加了增殖以及有效的脂肪形成的分化(2,3,40]。尽管大多数发表的研究都集中在MMC的积极方面,也存在不良影响如蛋白质不稳定和聚合形成[最近审阅的41]。我们目前的结果证明正面和抑制MMC对ASC行为文化的影响从扩大细胞达到治疗的角度相关的数字。减少扩散能力观察MMC在所有研究文化条件下的价格相比标准文化;另一方面,强大的分化能力被发现在MMC(见下)。MMC的不良影响是显而易见的XF /科幻条件显著降低扩散能力。事实上,细胞扩大标准XF /科幻条件优越的扩散率与细胞培养标准的边后卫和HS文化;然而,扩散XF /科幻在MMC细胞明显减少。有趣的是,对asc的边后卫条件MMC扩大显示增加代谢活动与那些在标准的边后卫文化相比,而代谢活动在海关和XF /科幻文化相似MMC和标准HS和XF /科幻文化。

此外,ASC形态的变化在MMC很明显,在所有的文化条件下与细胞采用一个更大的规模和更多的圆形形状。MMC的主要效应在XF /科幻文化的观察细胞形态学改变在MMC。细胞数量显著减少XF /科幻条件长期MMC曝光,细胞变得大而圆,有许多扩展与几个核偶尔观察到。类似的观察没有早些时候报道作为我们的研究是第一次报告的使用与XF对asc / SF-cultured MMC。结果表明,MMC方法不适合研究XF /科幻文化。

与前面的报道增加增殖率在MMC进行与BM-MSCs FBS-containing媒体,这也许可以解释不同的结果。MMC的功能依赖于FVO通过夏娃,这被定义为总量的一部分被大分子(3]。使用的70年和400年的混合物kDa聚蔗糖作为聚集剂由陈等人首次报道,他们计算大分子的最终浓度水平与血浆蛋白浓度大约是80毫克/毫升(3]。BM-MSCs FVO是计算最优,计算使用的血清白蛋白浓度作为基线。因此,FVO应该被进一步优化为ASC文化。此外,不同的血清条件的影响可能改变优化FVO的平衡。如前所述,MMC的基础功能是它能够支持细胞在体外重建自己的微环境2,3]。然而,细胞产生自然减少ECM不得诱导构建微环境即使在MMC (3对asc),可以申请。此外,它可以推测ECM生产减少化学定义XF /科幻文化阻碍MMC方法是否适合XF /科幻细胞。此外,较弱的细胞粘附在XF推测/科幻条件[30.可能会干扰MMC的影响。

由于细胞XF low-metabolic活动/科幻条件MMC,流仪分析后7天MMC。对asc的immunophenotype中培养分析了HS -和FBS-supplemented媒体文化后通过1 - 3在MMC。总体而言,对asc的特征immunophenotype MMC在所有研究的文化条件下维护。观察低到中度表达CD34先前报道[42,43]。根据我们目前的结果,CD34的表达似乎依赖于培养基配方比MMC曝光。有趣的是,CD54的表达明显高于MMC在所有研究的文化条件下。CD54是细胞间粘附分子1 (ICAM-1)通常是表达内皮细胞和细胞免疫系统的参与稳定和信息交互,例如,在白细胞和MSC交互之前报道44]。然而,更多的研究和信息交互和免疫原性的性质对asc在MMC需要演示如何增加对asc CD54表达转化为一个特定的函数。

在良好的协议与以前的研究,ECM被发现广泛沉积在MMC导致更成熟的ECM (2,3]。在MMC,内部和细胞外蛋白质变得一致,即使没有维护的影响细胞相互作用[1]。ECM反过来影响cell-matrix交互和促进细胞粘附,从而拥有一个影响细胞骨架的形成和结构(1]。目前的研究表明,脂肪形成的分化的效率符合矩阵蛋白的沉积,尤其是第四坳,脂肪细胞矩阵是一个重要的组成部分。这个结果表明一个更成熟的ECM MMC下产生。此外,文化条件(血清与XF /科幻条件)会影响ECM蛋白质的沉积。在我们的研究中,更多的第四坳存入海关媒体的价格相比的边后卫和XF /科幻条件;然而,ECM蛋白质的沉积可能与观察到的更有效的差异化商品媒体。

虽然MMC接触没有提高ASC扩散在目前的研究中,一个更有效的观察成骨、脂肪形成的差异化的边后卫和商品文化。在的边后卫的条件下,细胞成骨分化能力大幅升值的MMC感应与感应在标准条件下。此外,对asc积累更多的脂质滴下MMC在标准条件下感应与感应。这个结果表明支持MMC对脂肪形成的的影响和/或血清培养基对asc的成骨的承诺。正如前面演示了使用BM-MSCs拥挤促进微环境形成和稳定或驱动器分化2]。Ang等人表明,ECM广泛重新走向proadipogenic微环境在MMC在媒体脂肪形成的诱导下,进一步促进了一个强大的脂肪形成的分化。

相反,我们的结果表明,对asc培养XF /科幻没有回应MMC在分化诱导条件。显著差异在成骨分化的强度也观察到商品和媒体的边后卫,成骨分化较强观察相比,HS介质与介质的边后卫。符合这一结果,类似的减少对asc成骨分化潜能的培养的边后卫介质与HS媒体之前报道了我们组(25]。我们目前的结果突出的优越的成骨的潜力ASC-expanded HS-based媒介相比的边后卫的条件。

的边后卫和商品都含有一个未定义的鸡尾酒的生长因子和血清蛋白和血清组成有所不同。有几项研究对ASC文化的边后卫和HS, lot-to-lot变异的地方(23- - - - - -25,39]。大多数这些研究表明细胞扩大商品中显示更强的细胞成骨的潜力而扩大的边后卫的媒介。我们先前已经表明,不同培养条件对asc的增殖和分化能力很大的影响(30.]。因此,除了MMC的影响,细胞生存、增殖能力,ECM成分,和trilineage分化潜力受到选择文化条件的影响。在当前的研究中这种效果也明显。

此外,chondrogenic分化进行了研究在标准感应细胞扩张后媒体都在标准的媒体和MMC。基于定性阿尔新蓝染色,对asc扩大标准的媒体有更强的能力chondrogenic分化与细胞扩大在MMC相比,这是更强的沉积所示标准电池后的蛋白聚糖的扩张。micromass颗粒结构也是改变取决于文化条件,和细胞扩大在MMC密度较低的组织学结构。观察到的结构变化可能是由于增加了重构活动在MMC与脂肪形成的分化(见过以前2基于基质金属蛋白酶活性。密度较低和fibrous-like micromass颗粒结构下形成的MMC可能不是特定的软骨组织;但另一方面,改变结构类似于lacuna-like架构,是典型的软骨组织。应该进行更多的研究在拥挤的影响得出结论chondrogenic分化细胞的潜力。

5。结论

小心ASC行为特征对临床相关体外培养条件是非常重要的细胞疗法的进步。在目前的工作,研究了MMC作为替代方法来促进ASC分化和增殖。成骨的能力强,去观察血清对ASC在MMC的媒体,因此,MMC推荐用于增强ASC的分化能力。然而,在标准条件下细胞扩张应该执行。ASC immunophenotype维持在MMC除了CD54的表达显著增加。总之,我们的研究结果强调支持和抑制MMC对ASC的影响行为和MMC治疗似乎是文化的成功条件的依赖。尽管如此,新方法指导和加强ASC分化所需的和必需的。我们当前的研究表明,MMC是一个潜在的技术驱动通过修改ECM分化,似乎直接修改细胞形态和有一个影响测定细胞的命运。

信息披露

这些结果部分提出TERMIS-EU 2016会议45]。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢Anna-Maija Honkala,莎丽Kalliokoski Miia Juntunen博士为技术援助和技术。Reija Autio统计咨询。这项工作是由泰克,芬兰融资机构创新,芬兰的文化基础,学会芬兰和新加坡国立大学组织工程项目。

补充材料