文摘

诱导多能干细胞(iPSC)构成一个强大的工具来研究心脏生理和代表一个有前途的治疗策略解决心脏疾病。然而,万能干细胞分化后仍相对不成熟。此外,工程心脏组织(过去)已经在临床前研究作为治疗选择疾病模型和有前景的结果,虽然他们的血管化和功能改进的余地。胸腺素β4 (Tβ4)已经被证明可以促进祖细胞系分化心肌细胞,同时也诱发血管生成和血管成熟。我们检查了T的潜在影响β4从万能提高心肌细胞的成熟。评估与心脏分化相关的转录因子的表达,我们能够证明增加一代的细胞在体外显示心肌细胞的特征。此外,我们表明,在斑马鱼胚胎血管的发展模式,Tβ4正确执行是至关重要的淋巴管和血管生成血管萌芽。最后,利用Tβ4-transduced过去产生内皮细胞体外小鼠转基因标签,我们表明,治疗Tβ在过去4促进血管化和收缩性,强调Tβ4作为生长因子改善心肌细胞从iPSC的形成和提高的性能从新生儿心肌细胞生成的过去。

1。介绍

工程心脏组织从新生儿心肌细胞生成一直是一个有用的工具来研究心脏生理和提出了一种有前途的治疗选择患者心肌梗死后心力衰竭或过度的疤痕组织的形成,已经证明在临床前动物模型心肌替代疗法(1,2]。然而,在生成功能的主要障碍EHT-grafts足够大仍然存在。例如,移植可以生成原始血管网络(3),这些容器通常无法支持过去增加厚度(4]。此外,myocardial-grafts来源于新生儿心肌细胞缺乏在成人心肌的成熟度级别。一方面,这些过去的显示特性完全成熟,成人心肌细胞,如收缩蛋白的表达,他们组织成sarcomeric结构和功能模拟基本心肌细胞生理学(5- - - - - -7]。然而,因而生成的工程心脏组织移植仍有更高比例的胎儿肌凝蛋白重链和无法产生类似的力量8),这反映了他们的相对不成熟。

胸腺素β4 (Tβ4),尽管第一次描述了G-actin隔绝肽调节细胞骨架重排和细胞活性(9),最近被证明具有附加功能在细胞命运的决心和血管生成。因此,它是证明了Tβ4在心肌缺血小鼠模型促进间充质干细胞的增殖,改善心脏功能(9),并提出心外膜的祖细胞的分化转化综合心肌细胞(10]。此外,Tβ4是促进血管生成萌芽,通过激活SRF目标基因通过核易位MRTF-A [11,促进壁画细胞内皮细胞管的附件,改善血管的功能(12,13]。

的胸腺素β4促进心肌细胞分化和改善组织与功能血管供应,我们研究了T的影响β4万能干细胞心肌细胞的分化及其对工程质量的影响心脏组织。

2。材料和方法

2.1。代的诱导多能干细胞

诱导多能干细胞来源于小鼠胚胎成纤维细胞被乌尔里希·马丁(请提供14]。细胞培养在mitotically灭活小鼠胚胎成纤维细胞(mef;50 000细胞/厘米²)6-well盘子。培养基是由杜尔贝科修改鹰的介质(表达载体,加州卡尔斯巴德)与15%胎牛血清(热费希尔科学德国),0.2更易/ L谷酰胺(表达载体),0.1更易与Lβ巯基乙醇(表达载体),0.1 L更易与不必要的氨基酸股票(表达载体),和0.1%的人类白血病抑制factor-conditioned媒介,已产生的瞬时转染人类白血病抑制因子表达的质粒293人类胚胎肾细胞。启动身体胚状体的形成,细胞培养的“挂掉”技术与600细胞/ 20μL的分化中,由Iscove修改杜尔贝科的中有15% FCS 0.2更易/ L谷酰胺,0.1更易与Lβ巯基乙醇和0.1 L更易与不必要的氨基酸。经过3天的分化EBs转移到不依从1% agarose-coated 96 -威尔斯,紧随其后的是一个10 EBs /转让在0.1% gelatin-coated 6-well培养皿。

2.2。在斑马鱼血管模式

胚胎和成年斑马鱼在标准条件下生长和维护。转基因斑马鱼行如前所述(使用15]。吗啉代用于击倒tmsb-like表达式和控制吗啉代,在1 - 2细胞注射到胚胎阶段(15 ng /胚胎)。发展中脉管系统是使用徕卡SP5共焦显微镜检查。

2.3。流式细胞术

诱导多能干细胞使胰蛋白酶化,在寒冷的PBS洗,RT 3.7%甲醛固定20分钟。与0.4% Triton x - 100细胞permeabilized PBS,随后孵化与抗体表示2小时37°C在PBS 0.4% Triton x - 100。与抗体染色进行心肌肌钙蛋白I (BD Pharmingen,圣地亚哥,美国),αMHC (BD Pharmingen,圣地亚哥,美国)α辅肌动蛋白(西格玛奥德里奇,圣路易斯,美国)。一个FITC共轭IgG抗体作为控制。洗后,分析了细胞库尔特史诗XL-MCLTM流式细胞分析仪(贝克曼库尔特,Krefeld,德国)。

2.4。定量实时聚合酶链反应

RNA分离的细胞则在时间点和reverse-transcribed cDNA表示。执行qPCR iQ-cycler (Bio-Rad,慕尼黑,德国)与SYBR-Green Supermix (Bio-Rad,慕尼黑,德国)。qPCR,以下引物被使用:Brachyury (T):上:5′ACCCAGCTCTAAGGAACCAC 3′;低:5′ACTCCGAGGCTAGACCAGTT 3′;加工:上:5′CTCTAGACTCCAGCGACTCC 3′;低:5′GCCTTTGGAGGTGTCTTTAC 3′;Mesp1:上:5′CAGTACGCAGAAACAGCATC 3′;低:5′GGTTTCTAGAAGAGCCAGCA 3′;nkx - 2.5:上:5′CATTTACCCGGGAGCCTACG 3′;低:5′GCTTTCCGTCGCCGCCGTGC 3′; ANF: upper: 5′ GCAAATCCTGTGTACAGTGC 3′; lower: 5′ CAGGTGGTCTAGCAGGTTCT 3′; CX43: upper: 5′ CTGTCGGTGCTCTTCATTTTC 3′; lower: 5′ GTGGGCACAGACACGAATATG 3′.

2.5。一代过去

新生儿的老鼠心脏细胞分离得到Cdh5-CreERT2×Rosa26-LacZ老鼠,表达LacZ在内皮细胞如前所述16]。细胞和纤维蛋白原(1毫克/毫升,σ,F4753),中等(DMEM),基底膜基质(100μL / mL, BD生物科学,356235),凝血酶(100 U /毫升,σ,T7513),随后在琼脂糖strip-format模具打的(维度12×3×3毫米)与双弹性硅胶帖子从上面放置。纤维蛋白原聚合(2小时后,37°C, 7%的公司₂),模具架被转移到一个新的24-well板和过去与DMEM培养(Biochrom F0415),补充10%马血清(Gibco 26050),小鸡胚胎中提取2%,1%青霉素和链霉素(Gibco 15140),胰岛素(10μg / mL,σI9278),氨甲环酸(400μmol / L, 857653年σ),抑肽酶(33μg / mL,σA1153)。

2.6。皮肤褶室

BALB / c裸小鼠麻醉的腹腔内注射咪达唑仑,medetomidine,芬太尼和放置在一个变暖的平台。脱毛后,通过针脚缝合固定的皮肤,两个开口的底部皮肤褶是准备室的连接螺丝穿过这都过去了。观察窗的标志和一个皮肤层移除。随后,先前生成EHT-grafts被缝合到观察窗和密封的盖玻片保存在一个圈。下半年修复室后,麻醉与atipamezole被激怒,flumazenil,纳洛酮和老鼠被安置在单独的笼子里,直到进一步的使用。成像的血管生成发芽源于EHT-grafts,整个山半乳糖苷染色派生的过去了,随后通过光学显微镜成像。

2.7。统计分析

数据给出均值±SEM。使用方差分析差异几组测试和学生纽曼Keuls事后分析。一个< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。所有数据使用SPSS软件包进行评估(版本20.0;http://www.spss.com)。提供的样品尺寸图的传说。

3所示。结果与讨论

3.1。胸腺素β4驱动心脏在诱导多能干细胞分化

探讨胸腺素的潜力β4 (Tβ4)在小鼠诱发心脏分化诱导多能干细胞(iPSC),我们分析了多种转录因子的表达差异和心脏标记物在不同的时间点治疗期间的万能Tβ4(图1(一))。我们发现在早期阶段的区别(第四天)Tβ4显著增加mRNA的表达编码T-Bos-transcription因素Eomesodermin(加工)和Brachyury (T)为中胚层的形成一般是不可或缺的,是早期中胚层标记(17,18)(图1 (b)和1 (c))。除了促进早期中胚层的形成,治疗Tβ4加强MesP1的表达,心血管祖细胞(最早的标志19,20.],nkx - 2.5,这已被证明是至关重要的心脏发展(21)(图1 (d)和1 (e))。类似的结果的表达式MesP1和观察nkx - 2.5 Tβ4治疗gse胚胎干细胞(数据没有显示)。最后,Tβ4治疗分化后6天能显著提高心肌蛋白的表达心房利钠因子(曾帮工)和联接蛋白43 (CX43)和心脏的生产特定蛋白质α肌球蛋白重链(αMHC)、肌钙蛋白α辅肌动蛋白(图1 (f)- - - - - -1 (h))。收缩心肌蛋白的表达增加与T细胞则通过这些细胞的治疗β4导致显著增加感染心肌细胞相比,控制(图1(我))。

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图1

胸腺素β4促进心肌细胞的小鼠诱导多能干细胞的生成。(一)未分化的细胞则是处理Tβ4-peptide和表达的转录因子编码mrna测量4(加工,Brachyury (T)), 6 (Mesp1)或8 (nkx - 2.5)天后Tβ4治疗(红色)。在另一种方法,小鼠细胞则被分化了6天,治疗Tβ4-peptide。8天后Tβ4治疗,心肌细胞的表达水平标记(曾帮工,CX43)测量和流量仪评估心脏特定蛋白质(αMHC、肌钙蛋白α辅肌动蛋白)。此外,跳动的数量测量领域(蓝色)。(b-g)的相对表达水平记录显示((中)未经分化的细胞则(f和g) 6天前分化),通过定量实时PCR,测量显示,Tβ4诱导转录因子的表达调节通过间充质干细胞向心肌细胞的分化和心脏祖细胞阶段和心脏的表达特定的记录。(h)流式细胞术在细胞内染色αMHC、肌钙蛋白α辅肌动蛋白揭示了T后增加这些心脏特定蛋白的存在β4刺激。(我)Tβ4治疗则显示一个高速率的自发的跳动而未经处理的细胞则没有跳动。(,)。

T的作用方式β4由两个独立的生理过程:首先,Tβ4结合单体的G-actin,防止形成或通过profilin进入肌动蛋白丝,绑定后,对公司有利的肌动蛋白丝(22]。其次,Tβ4可以调节的表达数量的血清反应因子(SRF)目标基因。这种影响取决于核易位myocardin-related转录因子(MRTF-A),也是一个G-actin结合蛋白(23]。增加肌动蛋白绑定到Tβ4释放actin-bound MRTF-A导致核易位和SRF-binding [24,25]。在细胞核内,MRTF-A作为转录辅激活身体与SRF [26]。有趣的是,中胚层形成信号似乎是必不可少的。SRF-deficient老鼠死在胚胎发育早期从E9.5受损的原肠胚形成,缺乏中层细胞(27]。此外,胚胎干细胞缺乏SRF不能驾驶Brachyury (T)表达在诱导分化(28]。此外,南等人证明MRTF-A是一个强有力的心脏在重组蛋白表达的诱导物人包皮成纤维细胞,成纤维细胞表达心肌肌钙蛋白的增加0,2%(2%)到17%(13%)在格林尼治时间(或GHMT)诱导心脏分化(29日]。此外,胸腺素β4是众所周知的促进胚胎干细胞的分化30.)和驱动纤维母细胞心肌缺血的心肌细胞分化模型31日]。此外,胸腺素β4可以促进增殖和减少细胞凋亡在间充质干细胞(应力情况下9),突出T的可能性β4可能增加干细胞分化的池通过扩散和屏蔽细胞凋亡。这些发现指出T的可能性β4促进万能干细胞的分化心肌细胞通过直接诱导分化,通过增加大量的中胚层祖细胞,随后区分独立于Tβ4,或者通过保护细胞则在分化。

3.2。抑制胸腺素β在斑马鱼4诱导淋巴管畸形

探讨T的角色β4在斑马鱼在开发过程中,我们首先试图确定哪些可能的Tβ4在斑马鱼同种型对应于人类和老鼠亚型。为此,T的氨基酸序列β4从人类和老鼠与斑马鱼直接同源β胸腺素和βThymosin-like(图2(一个))。调整这些序列表现出更紧密的共识肌动蛋白绑定序列的同源性(32)的βThymosin-like比斑马鱼的哺乳动物的胸腺素β胸腺素。此外,基因定位在靠近tlr7和egfl6 tmsb-like更像小鼠和人胸腺素β显示在图42 (b)。由于这些原因,我们评估的影响吗啉代ββThymosin-like的击倒,而不是胸腺素介导的。之前评估的影响tmsb-like吗啉代介导血管发展击倒,斑马鱼胚胎与GFP-tagged microinjected tmsb-like tmsb-like存在与否的吗啉代(tmsb-like-MO,图2 (c))调查可拆卸的效率。这导致了一个清晰的表达GFP-tagged蛋白质,而额外注入tmsb-like-MO钝化GFP-tmsb-like的表达,表明我们的效率吗啉代胸腺素β介导的像击倒(图2 (d))。的tmsb-like吗啉代和控制吗啉代随后被注入转基因斑马鱼,增强型GFP表达fli1启动子的控制下在整个血管评估血管和淋巴系统的胚胎发育33]。

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图2

胸腺素的识别β4在斑马鱼直接同源。(a)的氨基酸序列比对斑马鱼β胸腺素和βThymosin-like和鼠标和人类的胸腺素β4所示。黄色框显示共识肌动蛋白绑定主题,表明近斑马鱼的同源程度比β胸腺素βThymosin-like到哺乳动物的胸腺素。(b)的比较基因组定位β胸腺素和βThymosin-like在斑马鱼,在小鼠和人类的关系定位,显示了一个近距离的哺乳动物的胸腺素βThymosin-like比β胸腺素β4所示。(c)向量用于集成pEGFP-N1-tmsb-like表示结合位点的斑马鱼tmsb-like吗啉代(tmsb-like-MO)用于击倒tmsb-like斑马鱼。(d)治疗pEGFP-N1-tmsb-like表达斑马鱼胚胎与tmsb-like-MO演示了可拆卸的效率高。

在调查吗啉代治疗斑马鱼postfertilization 5.5天(dpf),不同程度的水肿形成明显在tmsb-like-MO对待动物而没有形成水肿control-MO斑马鱼(tmsb-like-MO中度水肿:40%,严重水肿:37%,数字3(一)和3(b))。由于过度水肿的形成是与畸形的淋巴系统和有缺陷的胸导管形成(TD) [34- - - - - -36),我们调查如果tmsb-like击倒损害胸导管发展通过评估其在10体节。这些结果表明,在tmsb-like-MO对待动物,TD形成严重受损5.5 dpf没有动物显示TD各体节形成,68%没有管形成,而在control-MO对待动物96%显示适当的TD(数据形成3(c)和3(d))。由于胸导管是之前的出现parachordal淋巴管(PC),从胚胎开始发芽后红衣主教静脉(PCV)在32小时postfertilization(高通滤波器)37,38),我们调查的影响tmsb-like KD PC-formation的模式在60高通滤波器的体内共焦成像斑马鱼。在这个阶段,已经形成的主要血管(背主动脉(DA)和后红衣主教静脉(PCV)),形成约在1 dpf [39),显示没有明显的表型。节间血管(ISV)和背纵向吻合的血管(DLAV),然而,似乎杂乱无章,显示hypersprouting表型tmsb-like-MO对待动物相比,控制数据3(e)和3(g))。此外,PC-development严重受损,减少parachordal lymphangioblast携带体节(数字3(e)和3(f))。T的角色β4在淋巴管发展仍然知之甚少,而T的影响β4血管成熟研究近年来密集,展示T的强有力的稳定作用β4新成立的船只。为此它已经表明,Tβ4,除了通过激活诱导血管生成发芽CCN1 [40),促进招聘壁画细胞(特别是周)的通过激活血管MRTF-A和下游SRF目标基因的诱导CCN2 [41]。因此,节间血管的瓦解和背纵向血管可能是基于缺乏稳定的壁画细胞。增加血管不稳定的假设没有tmsb-like进一步支持的观察tmsb-like-MO治疗动物遭受大脑血管出血率高,不稳定的船只由于缺少一个标志壁画细胞(42),而出血control-MO对待动物是罕见,指着不稳定的存在血管tmsb-like-MO动物(数字3(h)和3(我))。相似的表型变化,增加血管出血减少由于壁画细胞覆盖,已经证明了T的小鼠模型β缺4,表明T的重要性β4在适当的血管在脊椎动物发展13]。在淋巴系统的情况下,无能在淋巴管萌芽在tmsb-like-MO斑马鱼可能是由于不受监管的组装和拆卸所需的丝状肌动蛋白细胞在胚胎lymphangioblasts迁移。另一个可能性是萌芽和船舶成熟机制由tmsb-like淋巴管或类似的缺陷parachordal lymphangioblast发芽源于ISV的障碍是必要的指导线索lymphangioblast迁移后的红衣主教静脉(37]。

图3

吗啉代效应介导tmsb-like击倒在斑马鱼。(一)在斑马鱼tmsb-like-MO治疗水肿的形成。击倒的动物显示中度(′)重度(′′)水肿的形成与控制((a),箭头),量化的(b) (tmsb-like-MO control-MO和114年)。(c)胸导管(TD)形成钝化是一个温和的(c′)切断(c′′)学位tmsb-like-MO动物相比,适当的TD形成控制动物5.5天postfertilization (dpf (c),箭头)。结果量化(d) (tmsb-like-MO control-MO和103年)。(e)击倒tmsb-like导致的异常形成节间血管(ISV)显示一个无效的hypersprouting表型(箭头)和微扰的parachordal淋巴管生成由parachordal lymphangioblasts (PL) 60高通滤波器。(PCV:红衣主教静脉后,大卫·爱登堡:背主动脉,DLAV:背纵向吻合的血管)。(f)存在parachordal lymphangioblasts连续10体节(control-MO和118年tmsb-like-MO)和(g)的平均数量的异位ISV分支点5双边ISV (每组,)展示过度分支和无效parachordal船在动物缺乏tmsb-like形成。(h和i) tmsb-like-MO对待动物显示大脑血管出血率高而control-treated动物60小时postfertilization (tmsb-like-MO control-MO和204年,)。

3.3。治疗心脏组织和Tβ4提高血管化和收缩性

有证明治疗与T细胞则β4增加心肌细胞功能的丰富和知道Tβ4促进血管稳定是必要的,适当的angiogenetic发芽,我们试图调查如果治疗工程心脏组织从小鼠心脏细胞和T(过去)β4促进血管化的组织移植。为此,过去从新生小鼠心脏细胞生成的Cdh5-CreERT2×Rosa26-LacZ老鼠,在内皮细胞表达LacZ,对待Tβ4-peptide。最初,过去的横截面显示毛细血管密度明显高于如果处理Tβ4(图4(一))并显示增加收缩力(数据没有显示)。随后,过去在小鼠植入皮肤褶室。宏观上,Tβ4治疗,移植过去,形成血管会急剧增加(图4(b)),它证实了量化每个象限的血管植入后过去5天(ctrl。Tβ4船舶/象限)成为植入后8天(ctrl更加突出。:6.4±0.8,Tβ4 24.5±2.4船/象限,数字4(b)和4(c))。此外,静脉注射FITC-dextran证明这些血管灌注,强调这些血管的功能(补充电影1在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/6848271)。调查这些新船的起源,我们从Cdh5-CreERT2植入过去×Rosa26-LacZ后小鼠Tβ4或控制治疗和观察,之后β牛乳糖染色,新成立的脉管系统主要有它的起源在过去发芽的周围组织皮肤褶室(图4(d))。最后,为了研究植入移植物的功能,大量的收缩是评估和显示数量的大幅增加每分钟宫缩在Tβ4对过去(图4(e))。总的来说,这些发现表明,过去的血管化和性能可以提高治疗的过去与Tβ4所示。与我们的结果对于万能,这种效应可能归因于增加新生小鼠心肌细胞在过去生产的保真度,可能是由于细胞凋亡减少和增加生存机制已在以前的工作从我们组在新生大鼠心肌细胞(43]。

图4

增加血管化和收缩性工程心脏组织在胸腺素β4治疗。(a)横截面的过去记者老鼠表达LacZ在内皮细胞(Cdh5-CreERT2×Rosa26-LacZ)揭示毛细血管密度的增加,如果治疗Tβ4所示。AAV-mediated转染和T (b和c)β4 (rAAV.Tβ4,与rAAV。GFP作为过去的控制)植入皮肤褶钱伯斯导致增加graft-vascularization,植入后5和8天(每组,;)。(d)的图像整体皮肤褶室包含过去产生LacZ记者老鼠显示小萌芽的居民内皮细胞移植到宿主组织,而rAAV.Tβ4治疗大大诱发血管生成发芽的宿主组织皮肤褶钱伯斯(虚线表明移植/主机边界)。与rAAV.T (e)治疗β4的自发收缩导致增加植入rAAV相比过去。GFP控制(每组,)。

结合我们的实验结果对诱导多能干细胞和斑马鱼,我们的结果表明,Tβ4促进中胚层祖细胞的扩张,随后分化成血液和淋巴管。反过来,这些增加的灌注和维护我们的过去。Tβ4此外可能稳定心肌细胞表型的新生儿心肌细胞在EHT-generation通过促进心肌蛋白的表达。另一个可能的机制,Tβ过去4增强功能,通常可能通过促进增殖和抑制细胞凋亡,呈现过去更稳定在装配和随后的植入。

4所示。结论

在这里,我们表明,Tβ4的数量显著增加cardiomyocyte-like细胞分化诱导多能干细胞和各自的祖细胞(中胚层细胞、心原性的祖细胞和心脏前体),Tβ4是淋巴管的胚胎发育所必需的。此外,Tβ4提高血管化和打过去的能力从新生儿心脏细胞生成,可能通过促进整体扩散,保护细胞凋亡,诱导血管生成和lymphangiogenesis。这些结果引入Tβ4作为一个潜在的司机过去iPSC-differentiation和血管化,提高发电效率的过去进行进一步的临床前和临床使用。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢乌尔里希·马丁提供诱导多能干细胞。罗伯特•大卫是由DFG BMBF,德国心脏基金会和潮湿的基础。Rabea Hinkel和基督教Kupatt德意志Forschungsgemeinschaft支持,德国教育与研究,Else-Kroner费森尤斯公司的基础。

补充材料