文摘
人类间充质干细胞/基质细胞再生医学(hMSCs)产生极大的兴趣主要是由于他们的multidifferentiation潜力和免疫调节作用。尽管hMSC可以获得不同的组织,提供细胞的数量总是低的临床应用,因此需要在体外扩张。大多数当前的协议hMSC扩张利用胎牛血清(的边后卫)作为营养补充。然而,监管的指导方针鼓励小说xeno-free替代定义更安全、标准化协议hMSC扩张,保持其固有的治疗潜力。由于hMSCs贴壁细胞,附件表面和cell-adhesive组件也扮演着重要的角色在他们的成功的扩张。本文侧重于FBS-free媒体的优势/劣势和表面/涂料,避免使用动物血清,克服伦理问题和改善的扩张hMSC临床应用程序在一个安全的和可再生的方法。
1。介绍
再生医学的目的是修复或替换组织或器官功能,破坏由于老化,物理伤害,先天性缺陷,或疾病。移植的细胞疗法是基于新孤立或培养细胞的损伤。这些细胞通常是干细胞,具有自我更新能力和分化以及多个传承途径,从而促进组织修复和再生(1]。
在干细胞中,人类间充质干细胞/基质细胞(hMSCs)产生了极大的兴趣,因为它们比较容易分离,可以广泛地扩大,和现在的多分化潜能,即骨细胞骨细胞,软骨细胞,软骨细胞和脂肪细胞(组织)。因此,他们都非常适合细胞治疗方法对几种疾病,如心肌梗死(2),移植物抗宿主病(3),克罗恩病,神经退行性和肌肉退化性疾病(4),软骨和半月板修复(5),或中风和脊髓损伤6]。根据哈特和他的同事们的一项研究,2014年2月(7),457年临床试验涉及hMSCs注册全球被中国领导人在这个排名。在写这篇文章的时候,提出临床试验的数量到706年(http://www.clinicaltrials.gov)。
人类的MSC可以来自不同的组织如骨髓(BM-hMSC),成人脂肪组织(AT-hMSC)和动员外周血,以及胎盘和脐带血液(UC-hMSC),在临床使用BM最常见的来源。然而,hMSC患病率较低,在所有这些组织和总数量的孤立的细胞是临床应用的不足。例如,BM包含大约在3.4×104骨细胞(8),通常与总数减少供体年龄(9]。所需的BM-MSCs的数量取决于类型的疾病治疗,包括,例如,从2×106细胞每公斤8×10的移植物抗宿主病6细胞在心肌病/公斤,10×106细胞呼吸窘迫综合征/公斤(https://www.clinicaltrials.gov/)。因此,为了有足够的细胞数量成功移植,孤立hMSC必须首先扩大间接体内疗法,使用有效和安全的方法,保持关键属性在较短的时间内,以避免细胞衰老和可能的污染(10]。
一些争议与hMSC缺乏共同的标准协议在体外扩张。这是至关重要的,因为文化条件可能影响转录组、蛋白质组、hMSCs组织和细胞,这将影响他们的移植和性能在移植(11]。实验室之间的差异包括基底的选择媒体和添加补充因素。此外,hMSC anchorage-dependent细胞,文化表面通常涂有细胞外基质(ECM)蛋白质或其他商用细胞粘附因子,生成一个额外的元素之间的不连续扩展协议。最后,以减少临床前试验之间的差异,细胞培养实验必须遵守良好生产规范(GMP)指导方针和细胞操作的每一步必须定义在标准操作程序(SOP)。
在这种背景下,取得了相当大的努力,提高体外hMSC扩张的临床应用,在不同的水平。综述强调了缺点与胎牛血清的使用(的边后卫)作为营养丰富的培养基补充,重点是不同xeno-free的优势/劣势和/或血清补充剂和表面/涂料的hMSC扩张。
2。胎牛血清作为hMSC补充在体外扩张
MSC增长在体外必须支持的基底媒体如杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM),α修改后的最低基本培养基(αmem) [12),或媒体组合等50:50 (v/vDMEM):火腿的营养混合物F1213)一般包括:(i)细胞合成代谢,生物合成的前体(ii)分解为能量代谢底物,(iii)维生素和微量元素,和(iv)无机离子保持pH值和渗透性的文化14]。这个基础培养基是进一步补充的边后卫,高度丰富的补充,包含一个鸡尾酒的细胞连接蛋白,生长因子和其他重要的生物分子。
根据拉鲁等人在2012年描述(15),来自36个临床研究涉及hMSC, 27岁的边后卫作为媒体补充和5人血清虽然4没有指定使用的补充使用。表1描述了一些成功的临床试验几乎没有副作用,hMSCs FBS-supplemented介质中被扩展,即使有很多问题关于使用的边后卫的科学道德和经济的缺点。这些都是总结在表一起的边后卫的优势2。
的边后卫是一个不明确的补充,不一致的高质量和数量的生物活性化合物(16]。因为伟大的变化在不同的边后卫,预选的许多通常是必需的,这是昂贵,费时,也妨碍了比较不同的研究小组17]。例如,Knepper等人表明的边后卫从三个不同的商业来源不同的相对量和表观分子量一些转录因子(18),郑洁等人表明,不同的大量的边后卫不同浓度的蛋白质如增长刺激抑制因素,明显影响细胞增长率(19]。
当的边后卫受雇于hMSC扩张细胞疗法,还有一个关于污染的强烈关注与异种的化合物和微生物污染物,这样我们病毒、朊病毒,细菌,真菌和木糖醇。指令2004/23 / EC (20.)和最近的实现(21)指定要考虑安全措施在捐赠,采购、测试、加工、保存、储存、分布和使用用于人类的人类细胞和组织的应用程序。一个值得关注的问题是未知的潜在cross-specific或zoonic传播病原体相关博览会文化动物细胞的化合物。人畜共患病带来致命疾病的风险,如炭疽,问发烧,和克雅氏病(CJD),一个特别关切的牛海绵状脑病(疯牛病)传播的风险和它的关系到新变异型克雅氏病(vCJD) [22]。最近,遗传物质从牛病毒性腹泻病毒(BVD)23)和牛血清中发现了新病毒大规模并行测序(24),宏基因组技术可以识别病毒和其他外来代理,没有先验知识的本质和能够揭示潜在的或沉默的感染。此外,牛支原体污染物的种类,通常出现在的边后卫,经常孤立从细胞培养25,26),但这些方法很难检测到。事实上,受污染批次的血清可能有效地通过测试支原体为负样本,正如最近报道(27]。
关于伦理问题,从牛胎儿的边后卫是收获来自怀孕牛屠宰期间,通过心脏穿刺麻醉,没有任何形式的(28]。在这个过程中,胎儿缺氧,缺氧,暴露于痛苦和/或在一个程序可能被视为道德不人道的。最后,在细胞培养中使用的边后卫提出了物流和经济问题:约1 - 3胎儿需要生产一公升的血清,这意味着高成本相关的动物饲养,安装和维护必要的基础设施。最近,即将增加的边后卫的成本已经通知和合理减少供应和需求增加的生命科学和医药客户。考虑细胞疗法的广泛传播行业,血清的需求可能会大大超过全世界最大的量血清可用性(29日]。
3所示。FBS-Free媒体hMSC配方在体外扩张
合适的替代品的边后卫hMSC扩张应该保证一个良好定义的成分,降低程度的污染物,生产成本低,延长保质期,和简单的可用性。文献描述了不同的选择,可以大致分为(1)化学定义媒体和(2)媒体补充人体血液衍生品(表3)。
3.1。化学定义媒体
化学(CD)媒体只包括组件定义已知的成分。常见的CD媒体策略准备充分描述和验证(13]。一般来说,配方MSC文化包括基底的媒体,已经讨论过的,添加不同种类的补充剂。直到15 - 30年前,补充剂用于CD媒体,如高纯度激素或生长因子,往往从人类或动物血清,但如今,重组技术的进步,可以产生一个广泛的人类蛋白质,允许完全xeno-free CD媒体的发展。由于hMSCs可以孤立的从不同来源和不同捐赠者之间的不同,最优CD媒体有关媒介补充剂可能有不同的具体要求,将“通用的”CD媒体的发展成一个具有挑战性的任务。
不同CD介质(无血清和/或韩国帝王免费)对于hMSC现在商用。例如,TheraPEAK™MSCGM-CD™(Lonza)和PowerStem(锅生物技术GmbH)能够支持hMSC扩张和分化;然而,CD105表达后可以显著降低文化在这些CD媒体相比,serum-supplemented介质(30.]。目前的许多CD媒体需要预涂的文化与ECM蛋白质基质支持细胞附件(部分4)。例如,stemgro hMSC介质(康宁),使用时会同康宁CellBIND表面(部分4.6),使hMSC依恋和增长与血清的文化,包括MSC multipotency的维护。另一项研究[31日]表明,人类BM-MSCs成功扩散四个不同商用CD xeno-free媒体(MesenCult-XF STEMPRO MSC科幻,TheraPEAK MSCGM-CD,和康宁stemgro hMSC介质),特别是在播种在专有的表面(康宁Synthemax表面)。康宁介质,与合成表面,能够促进细胞明显高于长期扩张比传统的血清中组织培养聚苯乙烯(安全和)。
然而有一些缺点与CD的使用媒体,可能会限制他们的广泛应用在临床hMSC规模扩张。例如,即使商用CD媒体访问在线的数据库(14),他们的确切成分不指定的供应商。Cell-doubling时代可以改变在不同CD媒体(31日),在某些情况下,细胞形态和大小可能不同,可能出现在细胞液泡中改变。此外,质量/ CD媒体活动的生物化合物配方可以生成不同批次之间的差异影响实验重现性。ECM-like涂料的使用,通常是强制性的,也可以提出一些问题,因为批次的可变性,可怜的蛋白质含量信息,潜在的免疫原性的组件和耗时的涂层过程(12]。通常,指导细胞适应协议没有提供,也可以是一个费力,费时的过程。最后,正如我们已经提到的,这种类型的媒体可能会导致nonoptimal细胞生长,与血清中补充或其他动物相比补充剂,在文献中报道的一项研究中,不同商用CD介质的性能比较(32]。
3.2。人类血液衍生品
补充一些“人性化”源自人类血液已经提出,即(1)自体或同种异体人类血清(海关),(2)人类血小板溶解产物(hPL),(3)脐带血清(hUCBS),最近,(4)工业GMP人血浆衍生物(补充细胞培养(鳞状细胞癌))。使用这些补充剂以下部分将更详细地描述。
3.2.1之上。人类血清(hS)
人类血清(hS)可以从自体或同种异体的全血收集捐款。自体hS的积极作用已被广泛描述细胞扩张。例如,以10%中补充v/v自体hS被证明是有效的相同数量的的边后卫hMSC隔离和扩张,甚至更好的成骨分化的诱导物(33]。山本et al。34]表明,患者的自体海关可以用来扩大骨髓hMSC不必牺牲自己的成骨分化潜能。然而,它可能是有问题的收集足够多的自体血清传播hMSC临床应用。此外,根据患者自体血清可能不是最优的质量,特别是在那些接受其他类型的治疗(11]。同时,供体年龄之间的负相关和人类骨小梁细胞的产物与自体血清中演示的文化补充(35]表明自体血清的使用是不适合老年患者(36]。努力克服这些缺点,spe和同事证明,当细胞扩大中包含的边后卫,然后转移到观众+与生长因子(人类血清自体补充),的边后卫污染物的数量可以减少99.99%,这可以作为一个策略来规避低可用性的自体血清(37]。尽管如此,马丁等人证明hMSCs xeno-derived碳水化合物污染的培养与的边后卫N-glycolylneuraminic酸(NeuGc) [38,39]。随后的边后卫的替代商品不足实现完整的去污,因为细胞表达牛NeuGc表面,即使长时间的文化没有的边后卫(40]。
另一方面,商品从外源的捐款可以与捐赠者的变化。然而,Witzeneder等人建议池6捐助者足以减少人类血液样本之间的差异(41]。然而,结果干细胞扩张与同种异体的商品仍有争议,与文献中描述的积极和消极的结果。例如,自体血清+重组碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)和三个重组细胞因子(促血小板生成素、干细胞因子和FL或“Fms-related酪氨酸激酶3配体”)已被证明来支持扩张原发性骨髓基质细胞(42]。脂肪tissue-derived MSC扩大与人类同种异体的血清池从5捐助者展出更多的纺锤状形态和增加活性比相同的细胞培养的边后卫,和更高的增殖率(43]。此外,它已经证明了人类血清包含的因素,对BM-MSC相比的边后卫,产生戏剧性的影响细胞分化成骨、脂肪形成的活动的增加地塞米松(44]。然而,Anselme et al。45少)观察成纤维细胞的形成菌落(CFU-F) hMSCs培养时商品相比FBS-supplemented媒体。然而,BM-MSCs hS移植前的培养更高效的生产在活的有机体内骨形成比相同的细胞培养的边后卫(46]。Aldahmash和他的同事们(47)没有观察到任何显著差异在永生的增长率hMSC线在短期(10天)和长期(100天)文化媒体补充外源的商品相比的边后卫。最近,蔡等人相比的影响不同浓度的自体血清(1、2、5、10%)的扩张和脂肪形成的差异化AT-MSC使用10%的边后卫作为控制。他们发现,细胞隔离是成功没有媒体之间的差异,而扩散势遵循趋势:10%自体血清自体血清的边后卫= 5% > 2% > 10%自体血清自体血清[= 1%6]。
3.2.2。人类血小板溶解产物(hPL)
人类血小板溶解产物(hPL)可以从血小板获得使用不同的程序,其中最常见的是冻结/解冻技术由Holmqvist和Westermark [48]。这个过程从血保存他们的血小板隔离α粉末,含有多种生长因子如bFGF、表皮生长因子(EGF)、肝生长因子(HGF),胰岛素生长因子- 1 (igf - 1)、血小板源生长因子(PDGF)、转化生长因子-β1 (TGF -β1)和血管内皮生长因子(VEGF)。人类血清相比,hPL包含更高级别的强有丝分裂原(例如,EGF、PDGF和TGF -β1),而igf - 1的含量和蛋白质含量较低的免疫球蛋白和清蛋白在洗涤过程49]。在一些研究中,hPL比的边后卫更有效的关于hMSC的扩张,维护他们的分化潜能以及免疫抑制特性,即在hMSC来源于脂肪组织(50]。重要的是,没有区别的使用刚做好的和过期的血小板浓缩已经观察到的增殖潜力和成骨分化hMSC [51),这表明这种类型的补充的生物活性是相当稳定的。添加外源性生长因子已普遍采用在FBS-supplemented文化增加细胞增殖率(52]。然而,即使取得了更高的增殖率在文化补充的边后卫加上bFGF的边后卫,相比那些率仍低于获得的媒介补充hPL (10%53]。有趣的是,不加抗凝hPL形成柔软的水凝胶,提供一个三维(3 d)支架,已增加描述在体外扩张hMSC通过模仿更自然的3 d环境比常用的2 d聚苯乙烯表面(50]。最后,血小板衍生品已经在临床试验中测试,效果很好治疗病变和骨关节炎54,55和在炉失败56]。
然而,hPL的使用也带来了一些缺点。首先,它是细胞培养的补充,同样的边后卫,不是精确定义。高可变性之间存在个人hpl,作为他们的组合是强烈依赖于donor-related因素,我们这样的年龄、性别、血型、血小板个体数(57]。然而,池不同的捐赠可以减少可变性。Schallmoser等人证明了一个15捐款池可以提高标准化(58]。同时,hPL隔离过程可能影响血小板脱粒和,因此,生长因子hPL内容。额外的变化可能导致的过滤程序,存储类型,或肝素的内容或抗凝血剂55]。此外,作为补充其他人为媒体观察到,有一个问题关于免疫反应的可能性,在同种异体的设置,和人类疾病的传播。然而,Castiglia et al。59)最近所描述的方法命名ihPL(灭活hPL),确保高效的安全的hPL批次,一代通过UVA光线病毒失活。
3.2.3。人类脐带血清(hUCBS)
人类脐带血清(hUCBS)可以很容易地获得正常交付后,因此通常最常见的细菌或病毒污染,筛查和它的使用没有提出任何道德问题。它含有高水平的可溶性生长因子和60多个蛋白质,即白蛋白、转铁蛋白、和纤连蛋白(FN)在较高浓度下,不同的角色在细胞生长和干细胞分化12]。Phadnis et al。60]表明BM-hMSC显示32倍增加细胞数量5天播种后的联合反对增加10倍的边后卫文化条件。此外,近10%已被证明是更有效的促进hMSC成骨分化超过10%的边后卫由于其增强骨钙蛋白启动子的表达(61年]。
一般来说,药被认为是有利的,可以作为细胞培养补充考虑唾手可得的同种异体来源,容易和便宜的隔离程序(62年),几乎没有任何污染物。另一方面,必须考虑一些限制,比如lot-to-lot变异性高,关联到donor-related特性和不定的代理的存在可能最终摆脱常规筛查程序。
3.2.4。工业GMP人血浆衍生物(细胞培养(SCC)补充)
一种新型的补充细胞培养(SCC)最近描述在体外细胞扩张(63年),包括在GMP制药级xeno-free人类plasma-derived补充。鳞状细胞癌是通过cold-ethanol工业分离(从人血浆中获得64年]。一旦收集到等离子体健康的捐赠者在血浆置换联合FDA-licensed总部中心,来自1000多个不同的等离子体池捐助者组装在一个等离子体单元。每个人捐赠是检测病毒标记,等离子体测试,利用核酸技术,DNA或RNA的存在的相关致病原,符合欧洲和美国的立法。此外,SCC生产过程包括一个特定病毒失活(γ辐照)除了其他净化步骤与其他病原体清除能力(63年]。
鳞状细胞癌已被成功地用来补充在体外细胞培养基底介质支持干细胞文化如人类胚胎干细胞(他),诱导多能干细胞(iPSC)源自人类皮肤成纤维细胞(65年],hMSCs [63年]。当hMSCs扩大在鳞状细胞癌(SCC重组15%基础培养基(DMEM:火腿的营养混合物F12))包含一个鸡尾酒的生长因子和其他元素如胰岛素、亚硒酸钠、乙醇胺,细胞产量是类似于一个获得hMSC扩大在商业中获得hMSC供应商(Lonza组和PromoCell)。此外,SCC-supplemented介质维持扩张期间hMSC处于未分化状态,保持他们的脂肪形成的能力,chondrogenic,和成骨分化,诱导条件下63年]。
然而,SCC最近开发的一个补充,只有少数数据文献中关于其潜在用途作为hMSC中补充。因此,进一步的调查将有助于更好的描述,提高额外的应用程序。在市场上推出其他替代品的边后卫将显示其潜力作为补充在体外细胞扩张。
4所示。表面和涂层促进hMSC依恋和增长
Anchorage-dependent细胞,hMSCs等支持在活的有机体内ECM,许多蛋白质的组装和粘多糖(笑话),为他们的组织提供了一个3 d环境组织。特定的细胞表面受体和配体之间的相互作用在ECM调解细胞内信号通路和控制基因表达、细胞骨架组织和细胞形态中所涉及关键细胞活动,如细胞粘附、迁移、增殖和分化66年]。
在细胞培养FBS-supplemented介质时,容易吸附的蛋白质层组织培养聚苯乙烯(安全和)表面,材料一般用于商业细胞培养瓶。这种蛋白质层包含几个胶蛋白,如纤连蛋白(FN)和vitronectin (VN)调解细胞的早期阶段所必须的附件(67年前),细胞能产生自己的ECM (68年]。相比之下,hMSC培养缺乏的边后卫不正确连接到安全和[69年]。共同战略hMSC扩张在无血清条件下他们的预培养的边后卫短暂适应一步无血清培养基(69年]。这个过程可以赋予细胞必要的元素为附件。然而,这是不可接受的在GMP环境展示的需要确定细胞依恋因素定义并设计新的文化支持hMSC表面粘附和增殖,同时保持其多能——缺乏的边后卫。
4.1。表面涂层与Cell-Adhesive蛋白质
最简单的策略来改善附件hMSC在培养细胞由预涂安全和表面与纯化蛋白质粘合剂,可以从人血浆分离或合成了重组技术。表面改性与FN涂料可能是最广泛使用的策略,在无血清条件下改善hMSC粘附和增殖。FN是一个多功能,ECM糖蛋白,它包含几个功能和结构不同的领域,包括cell-binding RGD (Arg-Gly-Asp)等领域被细胞表面蛋白的序列,即α5β1,αvβ3 (70年]。其他涂料的蛋白质,如层粘连蛋白(LN)、胶原蛋白I型(I)上校和IV型胶原(IV)上校,明胶,也显示改善hMSC粘附和生长在无血清培养基(69年]。相比之下,的附加hMSC poly-D-lysine预镀表面很低甚至当研究进行的边后卫的存在(69年]。此外,细胞没有显示典型的呈spindled-shape形态,这可能与低扩散能力在这种类型的涂料71年]。颂歌等人也报告说,安全和预镀与FN以及坳,II, III, IV和纤维蛋白原(FG),但不与LN,诱发hMSC粘附和增殖serum-reduced条件(0.1%v/v的边后卫)[72年]。LN, ECM蛋白质尤其是丰富的基板内上皮和内皮组织,被称为细胞吸附和迁移的一个重要中介(73年]。然而,在hMSC LN-coated表面粘附的影响和经济增长是不清楚因为相反的结果报告(69年,72年,74年,75年]。hMSC LN-coated表面行为的差异可能与(i)蛋白质构象,这取决于类型的衬底,LN浓度、培养时间;(2)类型的LN,不同形式已确定;和(3)差距在细胞培养方面的协议,包括使用的介质类型。
Ogura et al。76年)也证明了hMSC附件和传播FN-coated菜肴增加相比albumin-coated菜肴。这并不奇怪,因为白蛋白蛋白质,存在于更高的血清中浓度和第一个到达和吸附的表面,而其nonadhesive特征(77年]。
除了影响hMSC附件和扩散,ECM蛋白涂层也可以影响细胞分化成特定的血统。例如,众所周知,FN在hMSC成骨分化中起着关键作用,而抑制脂肪生成(78年]。VN我坳涂料也显示诱导MSC分化成骨的(74年,78年通过与特定的交互坳我受体α1β1VN受体αVβ3整合蛋白。观察这个事实即使没有可溶性成骨诱导物(74年]。因子和LN-5显示促进xeno-free hMSC成骨分化条件(人血浆和血小板提取)79年),但LN-5抑制chondrogenic分化(75年]。因为表面化学将影响量和构象的蛋白质的吸附层,因此暴露特定integrin-binding序列,使用的基质类型会影响hMSC差异化形象即使相同的蛋白涂层使用(80年]。
安全和涂有角蛋白,分离出人类的头发,最近被认为是一种最常见的胶粘剂hMSC蛋白质在体外扩张(81年]。这种蛋白质包含LDV (Leu-Asp-Val)细胞粘附的主题被细胞膜整合素α4β1。此外,人类头发角蛋白可以很容易地获得丰富的甚至从一个自体来源。然而,需要进行更多的研究,以进一步验证其是否适合这种应用程序。
4.2。表面修改促进粘合剂的足够的吸附蛋白质
底层基板用于细胞培养的类型也会影响hMSC粘附和增殖,因为它决定了自然,形态,和定向吸附蛋白质,因此,活性配体的接触(cell-binding域)细胞识别和绑定。商业细胞培养瓶通常安全和做的。通过修改这些表面疏水聚苯乙烯表面,通常通过等离子体处理,将其亲水性和带负电。这可以促进的吸附血清FN和VN等附件蛋白质,与其他蛋白质如白蛋白(82年),为后续的细胞粘附提供更好的表面。
事实上,它是目前众所周知,cell-binding域FN蛋白质时隐藏的原生结构,成为暴露在吸附表面有足够的润湿性和电荷83年]。所以,吸附FN对细胞的影响附件很大程度上取决于底层的底物的属性。例如,Dolatshahi-Pirouz等人表明,尽管FN在黄金(Au)表面吸附是高于对羟磷灰石(HA)表面,附加hMSC更常规的形态学公顷。这是解释为高暴露cell-binding域FN吸附上哈,这是证实使用单克隆抗体针对FN cell-binding域(84年]。表面润湿性能的影响(亲水和疏水表面)的选择性吸附FN和VN cell-binding域中的边后卫和各自的曝光也研究了利用自组装单层膜(SAMs)准备通过混合不同比例的哦(亲水)和CH3(疏水性)终止alkanethiols [67年]。hMSC粘附和增殖增加表面亲水性的增加(增加哦/ CH3),直接与cell-binding域暴露的增加吸附FN和VN [67年]。然而,柯伦et al。85年)没有发现差异hMSC−CH之间的附着力和活力3,−−NH2−SH,−羧基玻璃silane-modified表面存在的边后卫。不过,他们证明了表面化学能够调节hMSC分化的潜力。他们报告说,只有−CH3表面能够维持MSC表型,因为细胞扩大不拨款的刺激下失去分化能力。NH2和−SH表面促进成骨分化而−哦和−羧基表面支持chondrogenic分化甚至在基础条件(85年]。
尽管所有这些研究进行的边后卫的存在,他们强调的重要性,表面化学吸附胶蛋白的构象和数量,基板的设计中不可缺少的一步无血清或xeno-free hMSC文化。
4.3。表面化学修饰Cell-Adhesive肽
因为表面涂层的过程简单的蛋白质吸附并没有提供一个高水平的控制cell-binding域的表示,不同的策略被理想化的共价固定cell-binding主题(例如,RGD)衬底(86年,87年]。这个策略,问题与表面涂层与蛋白质从动物或人类的起源是可以克服的,因为细胞可以直接绑定到功能化衬底。其他优点的化学改性合成表面存储期间高稳定性和低批次的变化。
数组与不同RGD密度bioinert背景开发使用不同浓度的固定化肽序列RGDSP (Arg-Gly-Asp-Ser-pro)乙烯glycol-terminated地对空导弹。结果表明,密度更高的肽诱导MSC传播和粘着斑形成的边后卫的存在(88年]。事实上,众所周知,尽管携带RGD图案的表面可以增加hMSC附件和传播,它的有效性很大程度上取决于其表面密度(87年和模式89年]。表面官能团与RGDs xeno-free hMSC文化已经商业化的BD生物科学(部分4.6)。
4.4。与脱细胞基质表面涂层
单一蛋白涂层上面描述的缺乏细胞分泌ECM的复杂性。涂料与脱细胞基质可以作为替代单一蛋白质提高细胞生长和增殖在体外没有干细胞特性的丧失(90年]。获取这些涂料,hMSCs培养组织文化板块(或其他感兴趣的衬底)足够的时间允许细胞产生自己的ECM,涂层是通过适当的脱细胞处理后,只留下ECM组件。脱细胞基质涂层可以保持在最初的基质中,在后续hMSC人口可以直接培养或可以收集和转移到其他底物而不失去其意义的潜力90年]。
赖昌星等人所描述的特点,ECM涂层前后hMSC去细胞产生的。使用共焦显微镜,可以想象我和上校三世的本地化,FN,小富亮氨酸蛋白聚糖等实验和decorin和基底膜的主要成分,如大分子量蛋白聚糖perlecan和LN (91年]。
涂层与ECM源自人类胎儿MSC (fMSC)改善成人hMSC扩散维持多能——相比,ECM源自成人MSC和安全和。这一事实可能与fMSC的高增殖能力相关的大量的ECM生产(92年]。这些结果是非常有前途的体外hMSCs扩张;然而,他们不是在xeno-free条件执行。此外,可用的fMSCs与伦理问题可能是一个关心这一策略。
最常用的去细胞过程是基于完整细胞的分离使用酶过程或使用洗涤剂化合物裂解的细胞。然而,所有这些过程有缺点,即使用蛋白酶如胰蛋白酶,可损害ECM组件和污染的细胞裂解合成与细胞内ECM组件。Rao Pattabhi等人描述了一种新的去细胞协议基于冷EDTA从ECM没有删除完整的细胞酶和洗涤剂,用最小的ECM损伤和污染。他们证明了ECM源自hMSCs获得使用这个过程提高了天真的扩散hMSC维护他们的潜力骨生成和脂肪生成93年]。
然而,所有这些化验进行标准中包含的边后卫,因为他们的目标是开发协议,可以增强维护multipotency hMSC扩散。因此,额外的实验是需要这些策略适应xeno-free MSC文化。
4.5。表面改性的插科打诨
重复是ECM多糖,参与多种细胞外和细胞内功能和被广泛地探讨组织工程应用,使用时既表面涂层(94年]随着3 d支架hMSC文化(95年,96年]。
肝素是一种含有硫酸几个线性呕吐和羧基组,与负电荷密度高和特征明显几个域名绑定到不同的生长因子和基质蛋白,如FGF-2、FN、LN, VN,坳,骨形成蛋白(BMP) [97年,98年]。
Heparin-functionalized表面可能是设计来吸引和可溶性生长因子结合,集中从表面上看,这避免了需要使用额外的高浓度的可溶性期间生长因子在体外hMSC扩张。然而,除了促进hMSC粘附和增殖,这些表面也诱导成骨分化在标准培养基(95年]。这一事实与肝素能够隔离从培养基不仅蛋白质必不可少的hMSC附着力(例如,FN和VN)和扩散蛋白质(如FGF2)也参与成骨分化(例如,bmp) [99年]。
在一个不同的方法,可以设计专门隔离serum-borne肝素表面测量界面,从而吸引和结合溶性生长因子。Heparin-binding表面是由共价固定的小Heparin-binding肽(GGGKRTGQYKL)和integrin-binding肽(RGDSP) bioinert地对空导弹。RGDSP包括改善细胞粘附bioinert地对空导弹。在的边后卫的存在,这些表面能够增强hMSC增殖和成骨分化的放大内生FGF-2和BMP的活动,分别为(99年]。
然而,它也暗示upregulation hMSC肝素诱发成骨分化可能与FN构象变化。最近的证据指出,肝素诱发更扩展构象纤维FN包含在ECM支架。扩展FN可能暴露隐藏的许多生长因子结合位点(如FGF-2 BMP-2, VEGF)上基本hMSC成骨分化(One hundred.]。
4.6。对MSC文化商业涂料和改性表面
不同xeno-free蛋白质表面涂层或修改文化hMSC文化目前已开发和商业化。他们是hMSC如今广泛使用在体外扩张,尤其是当结合血清或化学定义媒体。表中描述的一些示例4旨在说明,而不是所有的包容性。
5。结论
hMSCs的生物学性质,对现在被认为是一个最有前途的细胞类型的细胞疗法,已经在许多临床试验使用hMSC得到验证。然而,hMSCs稀缺和细胞移植,达到足够数量在体外扩张的步骤是必需的。这个过程需要改进以保证安全准备hMSC的治疗产品。
具体挑战关心动物组件的替换如hMSC期间的边后卫在体外扩张,因为它使用了科学、经济和伦理问题。提高临床使用hMSC先进疗法,细胞培养/扩张xeno-free条件下应得到鼓励。目前的策略包括更换的边后卫与化学定义媒体或人工等离子体衍生品如海关、hUCBS, hpl,最近GMP-compliant补充细胞培养(SCC)。可溶性成分之外,最近的一项调查也包括hMSC精制文化发展的表面在体外文化:为了增强吸附胶和/或刺激代理人,表面可以携带足够的化学组和修改固定的肽配体或整个ECM的笑料和FN等蛋白质。然而,大多数这些研究正在进行的血清和额外的实验是需要转置这些策略xeno-free MSC文化。
近年来,提出了不同的有前途的实验设置对临床安全hMSC体外扩张和插图。然而,这仍然是一个缺乏标准化的协议的意图;因此,高质量的翻译研究,许多研究小组之间的交流感兴趣的领域是要求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作是由欧盟第七框架计划资助下,玛丽·居里初始培训项目网络:IB2 (MC ITN-EID没有。317052(转化)),由项目北- 01 - 0145 -菲德尔- 000012,由北葡萄牙地区运营项目(北2020),葡萄牙2020年合作协议下,通过欧洲区域发展基金(ERDF)和底部Europeu de Desenvolvimento区域(菲德尔)基金通过竞争力和国际化竞争2020 - operacional规划(POCI), 2020年葡萄牙,葡萄牙基金通过Fundacao para Ciencia e Tecnologia (FCT) / Ministerio da Ciencia Tecnologia e教学优越的框架项目“健康科学研究和创新研究所”(POCI - 01 - 0145 -菲德尔- 007274)。画面c . c(如果/ 00296/2015)和Goncalves r . m .(如果/ 00638/2014)感谢FCT的研究职位。