文摘
骨头是第二大操纵组织后血液。脂肪干细胞(对asc)可能成为骨再生的一种方便的MSC协议。令人惊讶的是,最重要的是鲜为人知的生物分子osteoinduced后这些细胞产生和释放。因此,本研究旨在定量13个候选人中选择最具代表性的细胞因子,趋化因子,生长因子的条件媒体内osteodifferentiated对asc和无差别。两个承认成骨细胞的细胞模型,mg - 63和SaOs-2细胞,比较。值得注意的是,il - 6、引发MCP-1, VEGF对asc高度生产和检测。此外,而il - 6和引发似乎显著诱导成骨的介质,则没有这种效果MCP-1和VEGF。整体SaOS-2可怜的表达谱,这可能是一致的分化表型SaOS-2相比对asc和mg - 63。相反,在维护中,mg - 63显示一个非常富有的il - 12的分泌,MCP-1, IP-10, VEGF,显著降低成骨的条件下,MCP-1唯一的例外。高MCP-1和VEGF的表达,即使在成骨的承诺,可能支持对asc在骨再生的使用协议通过招募成骨细胞和破骨细胞的主机。
1。介绍
不像大多数成人组织,骨骼能够自我修复而不形成疤痕,因为大多数由自发愈合骨折演示(1)或通过温和的手术。尽管这种固有的骨再生能力,至少十分之一的620万多骨折(2每年发生的人治疗受损。此外,先天畸形、肺泡吸收和临界大小的骨缺陷造成严重创伤或恶性肿瘤切除术3充分利用骨第二移植组织后血液(4]。治疗方法包括移植与自体和同种异体的骨头,这并非没有限制(5]。
自体骨被认为是黄金标准的骨移植材料。尽管如此,仍有一些限制使用自体骨由于供体发病率,获得它的难度,延长治疗时间6,7]。最近,自体骨已被用于骨结构和缺陷的再生(8]。然而,自体骨政府一直高度与疾病传播的风险和免疫反应9]。此外,合成骨移植材料产生模拟骨骼结构和促进osteoconduction。然而,制造和生产这些移植材料排除他们的广泛应用由于涉及主要费用(7,10]。
组织工程的主要目标之一(11]是克服缺陷的传统技术的脸当应用于骨缺损治疗(12]。三个关键组件的每一个再生的协议,除了支架和信号分子,细胞中发挥重要作用。为此,主要多功能干细胞,连同几个永生化细胞系,已经广泛用于cytocompatibility测试和成骨的潜力评价生物材料的再生医学(13]。然而,这些细胞的异质性,往往简单地定义为造骨细胞或osteblastic前体,应该仔细考虑。
虽然容易获取和处理,tumor-derived细胞系可能存在特殊nonphysiological特性(14]。例如,骨肉瘤细胞株(SaOs-2、mg - 63和u - 2侦察机OS)明显的区别于主要造骨细胞,采用免疫标记和矩阵(15]。最常用人类细胞系SaOs-2细胞显示成熟的成骨细胞表型,形成一种类似编织骨的钙化矩阵(16]。SaOs-2细胞与主要分享人类成骨细胞相似的细胞因子的表达谱,生长因子和受体甲状旁腺激素(17]。mg - 63细胞株是一个不成熟的成骨细胞表型。对他们的矿化能力(尽管不一致14],mg - 63细胞已经被用于长期研究涉及细胞行为生物材料(18]。尽管有上述缺陷,SaOs-2和mg - 63细胞成骨细胞是研究最多的。
另一方面,主要的干细胞具有更高的可变性和通常可在少量(19]。虽然,从骨髓间充质干细胞产生某种archetypic [20.,21),最近,脂肪干细胞(对asc) [22已成为一个可行的替代来源的间充质细胞。因为它已经详尽的综述(23),对asc相对丰富和易于访问和可能因此成为选择性骨再生的间充质干细胞来源的协议。令人惊讶的是,然而,最重要的是鲜为人知的生物分子osteo-committed细胞产生和释放。因此,本研究旨在定量13个候选人中选择最具代表性的细胞因子,趋化因子,生长因子的条件媒体内osteodifferentiated对asc和无差别。免费分析,两个承认“成骨细胞的细胞模型进行比较,根据他们不同的成熟阶段。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
对asc从脂肪组织中分离获得从三个不同的捐赠者如前所述22)和维护在杜尔贝科的最低基本中富含丙酮酸钠和补充10%胎牛血清(的边后卫,Gibco生命技术),100 U /毫升青霉素,100μg / ml链霉素,250 ng / ml两性霉素b的不依从细胞群被48 h后,和粘附细胞层洗两次用新鲜培养基;细胞被不断的培养,因为他们的收获,直到第六段。SaOs-2(写明ATCC号码:htb - 85)和mg - 63(写明ATCC号码:crl - 1427)细胞,分别培养在本人的5 a (Gibco,生活技术)以15%的边后卫在杜尔贝科(基准,双子座生物制品)和修改鹰的介质(DMEM, Gibco,生活技术)与10%的边后卫。媒体都是补充1% penicillin-streptomycin (MD生物医学、热费希尔科学)。细胞总是在subconfluency通道,防止接触抑制,保持湿润下大气中5%的二氧化碳在空气中,37°C。
2.2。检测白细胞介素、趋化因子、生长因子使用Bio-Plex系统
分析的生物分子,细胞被播种在96孔板(103细胞/)在自己的维护中为1天。之后,细胞被孵化的RPMI存在2%的边后卫和2%的边后卫(50 +成骨的因素μM抗坏血酸、β甘油磷酸酯10毫米和100 nM地塞米松)7 (T1)、14 (T2) SaOs-2或21 (T1)、28日(T2)天对asc的mg - 63和。一天的收获,媒体被移除,细胞在PBS洗两次,饥饿和新鲜培养基(RPMI 0.5%牛血清白蛋白)孵化了2小时。条件媒体因此获得的特征,没有添加任何激活物质,通过测量以下特定生物分子的浓度:白介素2(- 2)、白细胞介素- 6 (il - 6)、interleukin-8(引发)、白细胞介素- 10”(il - 10), interleukin-12 (il - 12)、粒细胞集落刺激因子(g - csf)、移行细胞(INF -γ)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)、单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1) (CCL-2) CXCL10趋化因子(IP-10),血小板源生长因子(PDGF) basic-fibroblastic生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)。灵活的Bio-Plex系统(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)采用如前所述[24]。所有样本分析后,制造商的协议。至少两个独立的重复每样一式两份。分析物的浓度表示在pg / ml。平均一个标准曲线范围从0.15 pg / ml - 3700 pg / ml(高光电倍增管Setting-PMT设置)Bio-Plex经理准备然后安装的软件。
2.3。体外成骨变异测试
体外成骨分化表现在上述相同条件下运行的一系列分析旨在揭示建立骨标记,其他地方描述(25,26]。
2.3.1。碱性磷酸酶(ALP)活性测定
碱性磷酸酶(ALP)活性测定采用比色终点试验(27,28),衡量无色的转换衬底p-nitrophenol磷酸(PNPP)酶高山p-nitrophenol黄色的产品。测量高山活动,细胞细胞溶解0.05% Triton x - 100和孵化与试剂溶液包含磷酸酶底物(Sigma-Aldrich、米兰、意大利)37°C,持续15分钟。颜色变化的速率对应的酶量出现在解决方案。光密度测量的波长405 nm(引用620海里)。样品比较反对p-nitrophenol校准曲线的标准。最后的碱性磷酸酶浓度是每总蛋白质含量,调整以避免偏见由于细胞数量。因此,细胞溶解产物的一部分获得了高山量化是孵化BCA™(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)蛋白质分析,遵循制造商的指令。光密度测量的波长570 nm,和结果做了一些调整,校准曲线由已知数量的细胞。高山值测定和规范化整个蛋白质含量在第三天SaOs-2和对asc在mg - 63和第七天。
2.3.2。钙含量测定
细胞钙含量测定在第14天SaOs-2和钙对asc mg - 63和21天的比色测定试剂盒(BioVision研究产品、山景、钙、美国),根据制造商的协议。OD测量在575海里内自准备20分钟。校准曲线总是。
2.3.3。胶原蛋白和钙染色
在既定的时间点,细胞生长在six-plate井洗一次与PBS和固定4%多聚甲醛在室温下10分钟。解决办法是删除和细胞与PBS洗。胶原蛋白染色,天狼星红染色(直接红80,Sigma-Aldrich)溶解(1毫克/毫升)在饱和苦味酸溶液(Sigma-Aldrich)添加到固定的细胞培养。保持轻微的晃动下2小时后,样本迅速冲洗酸水(纯净水0.5%乙酸),然后大量用蒸馏水洗净。钙盐后被染色后冯Kossa出版协议(15]。picro-Sirius红和冯Kossa污渍,文化光学显微镜下观察和代表奥林巴斯相机拍摄的照片。
2.4。统计分析
数据分析GraphPad Prism6 (GraphPad软件公司,拉霍亚,CA,美国)。每个实验至少重复三次。使用非参数统计分析是由测试Wilcoxon-Mann-Whitney测试。一个值< 0.05被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。检测白细胞介素、趋化因子、生长因子
白介素2的浓度(- 2)、白细胞介素- 6 (il - 6)、interleukin-8(引发)、白细胞介素- 10”(il - 10), interleukin-12 (il - 12)、粒细胞集落刺激因子(g - csf)、移行细胞(INF -γ)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)、单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1) (CCL-2) CXCL10趋化因子(IP-10),血小板源生长因子(PDGF) basic-fibroblastic生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)在图1mg - 63,对asc和SaOs-2细胞保持在维护和分化的媒体。
(一)
(b)
(c)
有趣的是,有一个很大的不同的表达模式,白细胞介素,趋化因子,生长因子在不同的细胞。产生一个相当大的il - 6水平也引发,MCP-1, VEGF osteodifferentiated之间没有特殊的变化和控制条件(除了引发)。mg - 63显示高水平的表达il - 12, IP-10 MCP-1, VEGF。重要的是,在osteodifferentiating条件下,il - 12的表达,IP-10和VEGF降低。SaOs-2细胞显示考虑分子的表达水平很低,除了VEGF。值得注意的是,osteodifferentiating介质在SaOs-2抑制il - 12和VEGF的表达,类似于mg - 63细胞。进一步突出对asc考虑分子间的微分表达式,mg - 63和SaOs-2细胞,一个面板显示表达式值为每个生物分子报道在图2。
3.2。体外成骨变异测试
细胞的成骨的潜力已经被量化评估在早期阶段高山活动(图3),并通过小天狼星红染色胶原蛋白矩阵(图4)。有趣的是,osteodifferentiating条件显著增加高山活动水平为每个细胞类型。在后期,细胞外钙含量是决定colorimetrically(图5(图)和冯Kossa方法6)。在osteodifferentiating条件,显著增加细胞外钙含量为每一个细胞类型被发现。总的来说,区分条件出现比未分化的控制执行,证明的有效性成骨的媒介。
4所示。讨论
在目前的研究中,微分信号分子的表达以下三种不同的细胞类型中都osteodifferentiating首次显示和控制条件。为了达到这个目标,一个高度敏感的方法。特别是,细胞模型考虑这项工作是ASC, mg - 63, SaOs-2细胞。值得注意的是,对asc代表一种特殊的间充质干细胞的潜在应用在骨再生。另一方面,尽管他们不合宜的临床使用由于肿瘤推导(29日- - - - - -31日),mg - 63和SaOs-2细胞选择这项研究是一个广泛的扩散和接受体外模型,骨生物学领域的(16,17,32- - - - - -37]。本文也突显出不同的信号分子的表达变化在细胞之间的分化。
2001年,祖克et al。22)描述了一个假定的多功能干细胞分离人口通过酶消化脂肪组织的间质血管分数。培养一段时间后,这些附着细胞multipotency显示功能;具体地说,他们倾向于变得相对同质槽通道和有能力接受向脂肪细胞分化,成骨细胞,软骨细胞,在适当的条件下(38]。因为这是真的,即使从一个克隆扩张,这些细胞被称为“脂肪中提取干细胞”(对asc)基于第二年度会议上达成的共识国际脂肪应用技术协会(39]。
尽管大量的研究在体外和体内的水平,对asc的骨重建的临床使用是有限的。值得一提的是成功的,尽管几乎轶事,临界骨缺损治疗对asc的播种到保利lactic-co-glycolic酸(PLGA)支架40和磷酸beta-tricalcium颗粒41]。骨修复工作可能获利等结合传统技术移植和体外扩张在GMP技术(42]。增加兴趣都集中在生物材料作为载体,作为描述,例如,通过Mellor et al .,提出多层实际上电纺聚乳酸nanofibrous支架含有磷酸三钙纳米粒子(43]。
对asc的实际功效,然而,不仅仅局限于其分化能力,但它也欠大量的交付和局部分泌信号分子促进,最终,组织恢复。本研究路线后,最近的研究(43,44)在缺血性模型解释了对asc的疗效由于释放血管生成因素如HGF和VEGF。人类对asc证明分泌这两个因素既定的(45]。热爱旅行的人等。46对asc)报道,产生血管生成(HGF和VEGF),促炎(il - 6,引发,IL-11、生活和肿瘤坏死因子α),和hematopoietic-supportive细胞因子(g - csf - csf, gm - csf和IL-7)接触后常见的诱导因素,包括有限合伙人。里贝罗和同事检查参与组成分泌腺的特征对asc的神经影响(47),而Succar和同事异形细胞疗法和比较不同配方的骨关节炎(48]。然而,作者的惊喜,科学文献至今一直缺乏一个全面的描述相当范围的生物分子分泌受到成骨分化也极大的兴趣更集中在细胞内动态。
因此,本研究集中在检测代表小组对asc的信号分子,SaOs-2细胞,mg - 63细胞产生在维护或培养成骨的媒介。每个单元格类型表现不同。MCP-1,值得注意的是il - 6,引发对asc和VEGF高生产和检测在即使没有任何刺激。此外,而il - 6和引发似乎显著诱导成骨的介质,则没有这种效果MCP-1和VEGF。影城免疫系统采用称为Luminex®能够同时检测和量化分析物的几百多个样本,减少时间,成本,和样品要求相比,ELISA检测(49]。Luminex的捕获抗体识别特定分析物和连接到微磁谱定义地址。技术的敏感性从而达到浓度甚至低于1 pg / ml,这解释了,例如,为什么我们报告中il - 12的存在对asc矛盾热爱旅行和同事的结果基于ELISA试剂盒(46]。
整体SaOS-2细胞有一个可怜的表达谱(只有il - 12和VEGF结果大于10 pg / ml),这可能是符合SaOS-2细胞的分化表型对asc和mg - 63相比,为彻底他处14]。相反,当在维护中,mg - 63细胞显示一个非常富有的il - 12的分泌,MCP-1 IP-10, VEGF。这种不寻常的分泌活动抑制成骨的条件,除了MCP-1,激活巨噬细胞的趋化因子的关键,因此骨重塑。值得注意的是,MCP-1,这是既定的表达成骨细胞(50),这里是增强osteodifferentiated mg - 63细胞。
IP-10量化的高水平mg - 63细胞可能相关的肿瘤起源细胞线(50,51]。IFN-g IP-10可能产生的反应,发现只有在mg - 63(如图1和2)。对asc和SaOs-2相比,mg - 63生产,也更FGF-b虽然整体水平普遍偏低。考虑这些结果,它可能是有趣的调查相关TGF-b表达式(52]。
如上所述,与mg - 63和SaOs-2细胞VEGF没有趋势下行对asc osteoinduced时,即使地塞米松抑制作用,出现在成骨的媒介,是众所周知的内皮和tumoral细胞(53,54]。连同本构MCP-1的高表达,VEGF可能支撑的稳定版本的使用对asc的骨再生协议,这些生物分子可能导致招聘骨细胞在宿主(55- - - - - -58]。非常有趣的是,胡锦涛和奥尔森(55]研究了骨修复monocortical缺陷小鼠胫骨内皮层。Osteoblast-derived VEGF是证明刺激成骨细胞的之间的串扰,内皮,和造血细胞旁分泌的方式,而直接影响成骨细胞通过自分泌机制。MCP-1的作用是相反的调查期间PTH-induction osteoclastogenesis由Li et al。58),提供一个理由增加破骨细胞活动启动更大的骨重塑。
在这些前提,这将是极大的兴趣研究对asc在生理环境提供更多可靠的和预测的结果。一个可能的方法可能在于阐明的行为对asc在coculture系统中,与已知的内皮细胞在骨形成和再生关键球员5]。
5。结论
目前,对asc的使用建议的数量在组织修复和再生令人印象深刻。临床试验的数量评估的有效性和安全性对asc的重建和再生组织每年显著增加。根据临床试验数据库(ClinicalTrials.gov数据库2015),对asc 122研究目前使用(59,60]。
特别是,取得了积极成果使用自体对asc颅面骨重建在临床试验中,产生新的成熟,至关重要的,和血管化骨40- - - - - -42,61年- - - - - -63年]。到目前为止,骨再生的最有前途的领域临床翻译实验ASC协议(62年]。这个研究支持,再次对asc在骨组织工程的可行性的基础上,细胞因子,趋化因子,生长因子检测到。
信息披露
没有参与在任何阶段的研究报告或论文做准备。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
f . Mussano和t .热那亚同样导致了这项工作。
确认
这项研究部分由波里的皮埃蒙特地区D 'INNOVAZIONE-III Annualita(研究项目缩写:BIOBONE)。