孕产妇七氟醚暴露导致胎儿不正常发育的前额叶皮层和引起认知功能障碍的后代

文摘

孕产妇七氟醚在怀孕期间接触与行为的风险增加有关赤字的后代。一些研究表明,神经发生异常可能是负责sevoflurane-induced神经毒性,但七氟醚对胎儿大脑发育的具体影响仍然知之甚少。我们旨在调查孕产妇是否七氟醚暴露导致后代学习和记忆障碍通过诱导异常胎儿的前额叶皮层(PFC)的发展。怀孕的老鼠在妊娠期15.5日收到2.5%七氟醚6 h。学习函数的后代与莫里斯水迷宫测试评估产后30天。胎儿的老鼠的大脑组织进行免疫荧光染色评估分化、增殖、细胞周期动力学的胎儿曼宁七氟醚麻醉我们发现产妇学习能力受损的后代通过抑制深层未成熟神经元输出和神经祖复制。细胞周期动力学的评估,我们建立了这些影响是通过细胞周期阻滞神经祖细胞介导的。我们的研究提供了洞察细胞cycle-related机制孕产妇七氟醚暴露能引起神经发育异常和学习障碍,吸引人们考虑麻醉的神经毒性当考虑nonobstetric手术的益处和风险。

1。介绍

产前影像学的进步和创新外科技术已经导致了广泛的胎儿干预措施(1]。因为相对较长时间的过程和全身麻醉的必要性,长期吸入七氟醚等麻醉管理帮助子宫静止和降低早产的风险。然而,吸入麻醉剂可以强大的大脑发育和监管机构已报告为有害行为赤字(2]。几家大型队列研究调查了麻醉对大脑发育的神经毒性3- - - - - -5),但是数据仍然是难以捉摸的。最近,“药品安全通信”发出警告,全身麻醉用于孕妇在怀孕后期的发展可能会影响儿童的大脑(6]。吸入麻醉药七氟醚是一种最普遍的nonobstetric手术。虽然七氟醚有较小的力量对大脑发育造成神经毒性与其他麻醉等异氟烷(7),仍有一些临床研究报道,七氟醚可能导致神经赤字(8,9]。虽然神经发生异常被认为扮演着至关重要的角色(10- - - - - -12),七氟醚对胎儿大脑发育的具体影响仍然知之甚少。

大多数研究sevoflurane-induced神经毒性主要集中在海马体的变化发展(10,13]。值得注意的是,第三个阶段是一个舞台,有高水平的神经发生在大脑皮层和前额叶皮层(PFC)的发展,最高位的认知功能的一个座位,扮演着关键的角色在许多神经发育缺陷的发生和发展14]。三种主要类型的神经祖细胞,神经干细胞,放射状胶质细胞,和中间祖细胞,已确定参与的增殖和分化PFC (15]。PFC的神经发生是通过神经元的正常生产和迁移深表面的秩序(16]。前在体外研究表明,自我更新能力和随后的神经祖细胞的分化可能是被七氟醚(12,17]。我们之前的研究也显示出一个重要的神经祖细胞的增殖抑制七氟醚暴露后(10]。细胞周期动力学,包括细胞周期的进展和退出,是重要的细胞命运决定在神经发生(18]。我们以前的研究发现,七氟醚可能导致术后认知功能障碍的老年小鼠神经元通过干扰细胞周期动力学(19]。

所有上面提到的知识促使我们确定sevoflurane-induced神经毒性可能归因于细胞cycle-related异常胎儿曼宁的发展因此,我们假设孕产妇七氟醚暴露可能会扰乱神经祖细胞分化与增殖的干预细胞周期动力学,最后导致学习赤字的后代。我们的研究结果表明,产妇七氟醚暴露诱导细胞周期阻滞神经祖细胞的胎儿PFC,导致神经元输出减少和抑制神经祖复制,最后导致学习赤字的后代。

2。材料和方法

2.1。小鼠麻醉

所有程序都通过复旦大学动物保健和使用委员会,机构的指导方针。四个月的老C57BL / 6 j雌性老鼠交配了4个月大的雄性小鼠C57BL / 6 j和怀孕的老鼠被安置后单独确认。所有的动物都在一个温控(22°-23°C)的房间在12 h光明/黑暗时期;水和标准鼠标chow随意。怀孕的老鼠被随机分配到对照组或七氟醚组妊娠期15.5天(G15.5)。怀孕的老鼠在七氟醚组2.5%七氟醚在100%的氧气6 h麻醉的盒子,而怀孕的老鼠在对照组收到100%的氧气6 h。麻醉的盒子的大小是20×20×20厘米³。气体流量是2 L / min感应在第一个5分钟,然后1 L / min进行维护。七氟醚和氧的浓度连续监测与气体分析仪(德尔格Inc .)。七氟醚麻醉被终止七氟醚供应中断。死亡率< 1%,目前的研究。

2.2。莫里斯水迷宫测试(微波加工)

我们描述的微波加工测试执行前研究[10]。分组,雄性后代出生后30天交付给同一组为他们的母亲。具体来说,后代是进行微波加工四个试验连续5天每天意思是(e)。每个鼠标是60年代搜索平台。在P35区域平台被移除,老鼠被放置在60年代的相反的象限游泳。游泳速度、逃避延迟,平台跨越时间和目标象限的时间百分比记录的视频跟踪系统(上海Jiliang软件技术有限公司,中国)。所有的老鼠干5 - 8分钟后加热灯下。

2.3。测量扩散、退出细胞周期和s阶段持续时间与溴脱氧尿苷的神经祖细胞(BrdU)和Iododeoxyuridine (IdU)

扩散的决心,怀孕的老鼠注射与单个BrdU ip(σ,B5002)剂量(50毫克/公斤体重)的实验和怀孕的老鼠牺牲6 h后(最后七氟醚/氧气接触)。BrdU增殖细胞的百分比计算⁺/ DAPI [10]。退出细胞周期分析,怀孕的老鼠也给ip注射相同剂量的BrdU开始实验,但牺牲了18 h后。皮质的胚胎与BrdU标记18 h是可视化Ki67反应和BrdU合并。这些神经祖细胞分裂前18 h和随后退出细胞周期会占用BrdU但不会Ki67的污点;因此,BrdU的评价⁺Ki67⁻/总BrdU⁺可以作为一种有效的检测方法对细胞周期退出(20.]。确定s阶段持续时间、怀孕的老鼠在G15.5 ip注射是IdU(σ,I7125)剂量(50毫克/公斤体重)4 h后开始的七氟醚/氧气接触,其次是BrdU注入(50毫克/公斤体重)1.5 h。然后怀孕的老鼠死亡的最后6 h七氟醚/氧暴露(0.5 h BrdU注射后),和胚胎免疫荧光显示诱导器/ BrdU处理。s阶段的长度(T_年代)是计算使用以下模式所描述的奎因et al。21:细胞的数量与IdU但不是BrdU标记被认为是l_细胞,指的是细胞诱导器但s阶段期间,未能占据BrdU IdU和BrdU注入之间的间隔( )。细胞用BrdU标记指定的数量 。然后可以用以下公式计算: 。

2.4。免疫荧光

进行剖腹产提取胚胎,和胎儿的大脑被固定在4%多聚甲醛。cryosectioning,固定的大脑平衡在PBS (wt /卷)蔗糖20%其次是30%蔗糖在PBS一夜之间在4°C。大脑被嵌入Tissue-TEK (O.C.T.樱花Finetek)和cryosectioned 12μm。免疫荧光,cryosections首次用PBS然后孵化与屏蔽解决方案(PBS山羊血清10%,0.03% Triton x - 100)为2 h 37°C。部分是下孵化主要抗体稀释阻塞一夜之间解决方案在4°C。组织被洗在PBS和孵化适当的二次抗体在室温下1 h。细胞核与DAPI复染色(σ1:1000)。BrdU和诱导器检测,一个额外的抗原检索步骤是之前执行阻塞用盐酸(2 N HCl, 15分钟孵化37°C) (10]。以下主要使用抗体:Tbr1 (Abcam ab31940 1: 200), Satb2 (Abcam ab51502 1: 200), NeuN (Abcam ab104224 1: 200), GFAP (Abcam ab10062 1: 200), BrdU只(Abcam ab6326 1: 1000), Ki67 (Abcam ab16667 1: 500), caspase-3 (Abcam ab13847 1: 200)、巢蛋白(Abcam ab6142 1: 200), Pax6 (Abcam ab5790 1: 200), Tbr2 (Abcam ab23345 1: 200), BrdU和诱导器(BD生物科学,347580,1:200),Ccnd1 (Abcam ab6134175 1: 200)和PH3 (Abcam ab5176 1: 200)。488年二次抗体是山羊anti-mouse Alexa萤石,山羊anti-mouse Alexa萤石594年,594年山羊anti-rat Alexa的萤石,山羊anti-rabbit Alexa萤石488(从Abcam,稀释1:200)。

2.5。形象和细胞计数

免疫荧光分析收集的数据从皮质至少3 ( 每组的胚胎。荧光图像获得使用徕卡TCS SP2共焦显微镜,和所有图片显示的目标参数组和七氟醚组获得了相同的设置在每个显微镜会话。在100年四个细胞数μ米宽条穿过前额叶皮层,在至少三个不相邻的部分从每个胚胎,图像J pro +软件。

2.6。统计分析

值意味着±SEM。双向与重复测量方差分析是用来分析逃脱延迟的差异在微波加工测试,和Bonferroni方法被用来调整的多重比较。双尾学生的t以及进行统计评价免疫荧光。值小于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。孕产妇七氟醚暴露的空间学习和记忆能力受损的后代

G20.5-G22.5交付的所有怀孕的老鼠的后代,和后代饲养30天之前分配给微波加工测试。之间没有统计学意义的游泳速度控制组和七氟醚组(图1(一))( , , ),排除这样一种可能性,即学习变化观察到在当前的研究中被感觉运动障碍的影响。双向和重复测量方差分析逃脱延迟(每个鼠标的时间达到了平台)显示一个统计时间和集团(图之间的交互1 (b))( , .740, 在暗示试验。特别,七氟醚组有显著的后代不再逃避延迟P33与对照组相比,意思是(图1 (b))( 和0.013,分别地)。此外,我们发现%时间相反的象限是长在七氟醚组与对照组在探头检测P35区域( , , )。然而,我们没有发现显著差异在平台跨越时代(图1 (c))( , , )。这些数据表明,产妇七氟醚暴露的空间学习和记忆能力受损的后代。

3.2。七氟醚的生产减少胎儿PFC深层未成熟神经元

调查是否七氟醚扰乱胚胎大脑发育,我们首先检查胎儿神经细胞的数量曼宁区分上层和深层新生神经元,我们使用了建立Tbr1标签层V−VI未成熟神经元和Satb2标签层II-IV未成熟神经元(22]。我们也选择NeuN和GFAP识别成熟神经元(23和成熟的星形胶质细胞20.),分别。Tbr1⁺未成熟神经元的胎儿PFC七氟醚暴露后明显减少(数字2 (b),2 (c),2 (d))( , , ),而没有显著差异Satb2的数量⁺不成熟的神经元(图2 (b),2 (c),2 (d))( , , ),NeuN⁺成熟的神经元(数据2 (e),2 (f),2 (g))( , , ),GFAP⁺成熟的星形胶质细胞(图2 (h),2(我),2 (j))( , , )。总之,这些数据显示,产妇七氟醚暴露深层未成熟神经元的生成减少。

3.3。七氟醚抑制胎儿的PFC的扩散

减少数量的深层Tbr1⁺未成熟神经元可能导致减少胎儿PFC的增殖或凋亡增加,所以我们接下来研究七氟醚对这些过程的影响。七氟醚组显示的胎儿PFC Ki67的数量减少⁺(数据3 (b),3 (c),3 (d))( , , )和BrdU⁺神经细胞(图3 (e),3 (f),3 (g))( , , ),强调增殖的抑制作用。然而,我们没有发现任何差异在两组之间细胞发生细胞凋亡的数量根据染色caspase-3(数字3 (h),3(我),3 (j))( , , )。

3.4。七氟醚抑制神经祖细胞在胎儿PFC的扩张

Ki67和BrdU标记指数降低神经祖细胞池的PFC建议减少七氟醚暴露后,我们进一步进行巢蛋白,Pax6,和Tbr2疣状标记神经干细胞,放射状胶质细胞,分别和中间祖细胞(15]。我们找到了一个软弱,稀疏的巢蛋白染色(数字4 (b),4 (c),4 (d))( , , ),Pax6(数字4 (e),4 (f),4 (g))( , , 七氟醚组)和Tbr2(数字4 (h),4(我),4 (j))( , , ),这表明,胎儿的神经祖细胞丰度PFC孕产妇七氟醚暴露后抑制。

3.5。七氟醚减少退出细胞周期持续时间和增加s阶段胎儿PFC的神经祖细胞

从细胞周期动力学可能影响大脑发育的增殖和分化(24),我们假设sevoflurane-induced减少神经祖细胞增殖和新生神经元生产可以反映细胞周期失调。退出细胞周期的评估,我们发现七氟醚组包含更少的胎儿全氟化物Ki67-negative神经祖细胞,结合BrdU在前18 h(数字5 (b),5 (c),5 (d))( , , )。此外,我们的双标记实验诱导器/ BrdU显示显著增加七氟醚暴露后的s阶段持续时间(数字5 (f),5 (g),5 (h))( , , )。综上所述,我们的数据表明,七氟醚退出细胞周期和增加了s阶段持续时间减少胎儿PFC的神经祖细胞。

3.6。七氟醚没有影响的持续时间G1 - M -, G2-Phases胎儿PFC的神经祖细胞

除了退出细胞周期和s阶段持续时间、G1的失调,M, G2也可能改变细胞命运在发育中的大脑25]。在最近的研究中,没有发现显著差异七氟醚组与对照组在分析神经祖细胞的比例,表示Ccnd1 mid-G1到后期的细胞周期蛋白表达G1(数字6 (b),6 (c),6 (d))( , , )。PH3, G2 - M-phases后期的具体指标,已被用于调查G2的持续时间和M-phases神经祖细胞(26,27]。我们没有发现任何显著差异表达的PH3(数字6 (e)和6 (f))( , , )。这些数据表明,七氟醚不影响G1 -持续时间,M -, G2-phases胎儿PFC的神经祖细胞。

4所示。讨论

在这项研究中,我们评估了在活的有机体内毒性作用的孕产妇七氟醚暴露通过调查孩子的学习能力和胎儿曼宁的发展我们的数据表明,孕产妇妊娠期暴露于七氟醚与学习的风险增加有关赤字的后代。七氟醚神经毒性可能是由于细胞周期的减少出口,增加s阶段持续时间的神经祖细胞,从而导致胎儿PFC增殖抑制和分化异常。

麻醉剂可以有毒的大脑发育,脆弱性主要取决于三个因素:大脑发育阶段和暴露的浓度和持续时间28]。在人类、孕产妇和胎儿的过程通常是在第二或第三阶段初期,增殖和分化的关键时期的胎儿大脑29日]。从发展的角度来看,这些过程在啮齿动物,与人类不同的是,从中间开始怀孕中期和继续出生的时间29日]。在目前的研究中,我们选择了怀孕的老鼠在晚期妊娠早期(G15.5)的神经毒性研究七氟醚。而低浓度的七氟醚等1.5%据报道不伤害到大脑发育(30.],我们之前的研究[10)发现,2.5%七氟醚可能导致学习赤字的后代。此外,长期接触七氟醚等6 h报道抑制神经祖细胞的增殖(17在后代中,引起学习障碍8]。因此,怀孕的老鼠七氟醚组在当前的研究中被暴露于2.5%七氟醚6 h研究胎儿大脑的神经发育变化。

莫里斯水迷宫是一个可靠的方法来评估学习和记忆的能力31日]。在该测试中,空间学习能力是由逃避延迟暗示试验和参考记忆与偏好评估平台区域探测试验(31日]。我们发现显著增加的后代的平均逃避延迟七氟醚组(图1 (b)),表明产前七氟醚暴露后空间学习能力障碍。在分析探针测试中,我们没有发现任何显著差异的平台跨越时间和%的目标,左和右邻象限(数字1 (c)和1 (d))。然而,我们发现,%的时间相反的象限时间在七氟醚组比对照组(图1 (d)),表明母体七氟醚暴露可能导致记忆障碍的后代。我们的发现与之前的研究报告是一致的,七氟醚麻醉用于怀孕的老鼠可能影响认知功能的后代(8,10]。

学习是一个高度动态的过程,PFC据报道将在这个过程中扮演重要角色(32]。一些精神疾病症状的认知失调通常导致结构和病理生理异常PFC (33]。胎儿大脑神经发生的一个基本特性是神经元的定位到垂直数组指定它们的功能(34]。神经发生收益,新生神经元的径向迁移增殖区,过去神经元生成之前,解决更多的外层,最后形成一个six-layered皮层(34]。上层(层II-IV)由late-born神经元而深层(第5层)early-born神经元(35]。在前额叶皮层的神经发生失调,如不完整的集群和大量的新生成的神经元,据报道在神经系统疾病(36]。在目前的研究中,未成熟的生产深层皮层神经元,七氟醚曝光后被Tbr1,显著抑制(数字2 (b),2 (c),2 (d))。Tbr1指导未成熟神经元是一个转录因子必要glutamatergic表型,Tbr1的差别,对这些⁺神经元在大脑发育的过程中可能会导致神经障碍(37]。因此,减少Tbr1⁺神经元生产可能部分属性七氟醚暴露后的学习障碍的后代。Satb2参与指定胼胝体的投射神经元(38Satb2染色),结果(数据2 (b),2 (c),2 (d))可能表明胎儿胼胝体的连通性的大脑没有明显影响产前七氟醚暴露。此外,我们还没有发现任何显著差异的数量成熟神经元(被NeuN染色)和成熟的星形胶质细胞(被GFAP染色)PFC(数字2 (e),2 (f),2 (g),2 (h),2(我),2 (j))。鉴于神经祖细胞产生不同类型的神经元和胶质细胞根据内在时间进程(39],G15.5七氟醚曝光时间的选择在我们的研究中可能只是在特定的时间窗口,当深层未成熟神经元出现。

减少生产深层未成熟神经元的PFC可能归因于神经发生减少和/或增加神经退化。在目前的研究中,我们清楚地表明,七氟醚BrdU-labeled和Ki67-positive细胞的数量减少胎儿老鼠的PFC(数字3 (b),3 (c),3 (d),3 (e),3 (f),3 (g))。这是符合先前发表的报告显示,神经祖细胞的增殖培养七氟醚暴露后显著降低(12]。郑et al。8)报道,七氟醚激活caspase-3总胎儿大脑,但是我们并没有发现任何显著变化caspase-3的数量⁺细胞在PFC(数字3 (h),3(我),3 (j))。不同的研究我们发现和郑和的研究可能表明,产妇七氟醚暴露对胎儿大脑的不同区域有不同的影响。

神经发生,发病的神经干细胞,主要的皮质干细胞表达巢蛋白和顶端的皮质表面进行有丝分裂。放射状胶质细胞从神经干细胞和表达的转录因子Pax6 [40,41]。放射状胶质细胞也接受部门生成中间祖细胞,表达Tbr2 [15,41]。这些神经祖细胞不断进行自我更新的有丝分裂,形成一个祖池顶皮层表面(15]。当我们注意到增殖抑制作用主要发生在顶端表面皮层(数字3 (b),3 (c),3 (d),3 (e),3 (f),3 (g)),该地区的神经祖细胞,我们认为产妇七氟醚暴露可能会扰乱神经祖细胞池的扩张。因此,我们估计神经祖细胞的数量与免疫荧光和发现巢蛋白的数量明显下降⁺,Pax6⁺,Tbr2⁺细胞(数据4 (b),4 (c),4 (d),4 (e),4 (f),4 (g),4 (h),4(我),4 (j))。PFC神经元的主要来源,很容易推断出这减少神经祖是其中一个原因导致深层未成熟神经元的减少生产。

神经祖细胞的增殖和分化影响不仅退出细胞周期,而且细胞周期进展(40]。BrdU和Ki67的染色,我们发现在细胞周期的比例明显降低七氟醚暴露(数据后退出5 (b),5 (c),5 (d)),这表明神经祖细胞在七氟醚组不能退出细胞周期和分化不成熟的神经元。细胞周期的减少出口和深层的差别,对这些神经元生产(数字2 (b),2 (c),2 (d))表示异常胎儿大脑中分化。s阶段的长度被报道的主要细胞周期与增生性行为,相关参数和自我更新神经祖细胞表现出相对比长s阶段致力于神经元生产(27]。我们发现显著增加s阶段持续时间的神经祖细胞暴露于七氟醚(数据5 (f),5 (g),5 (h)分化的差别),进一步表明对这些胎儿曼宁s阶段持续时间是主要的神经祖细胞DNA复制的质量控制(27),和七氟醚被报道能显著增加DNA损伤在啮齿动物42]。因此,我们长时间的观察s阶段也可能表明,七氟醚组神经祖细胞的DNA复制是不正常,等待进一步的研究。有趣的是,细胞周期的减少出口,增加s阶段持续时间并没有伴随着扩大神经祖细胞池(图4)。这促使我们思考是否孕产妇七氟醚暴露可能导致神经祖细胞的细胞周期阻滞。来验证我们的假设,我们进一步测试了其他细胞周期的变化参数,包括G1 -、M -和G2-phases。在最近的一项研究中,据报道,七氟醚是推迟g1期,导致胚胎干细胞细胞周期阻滞(43]。然而,Ccnd1标签在我们的研究中,神经祖细胞g1期没有影响产前七氟醚暴露(数字6 (b),6 (c),6 (d))。七氟醚可能影响g1期是合理的,通过不同的机制在不同的细胞类型。改变G2 - m期时间已经报告给直接改变细胞命运在神经祖细胞(44,45的影响),但七氟醚在这两个神经祖细胞的细胞周期阶段尚未详细研究。在目前的研究中,我们没有发现任何显著差异PH3(数据的表达6 (e)和6 (f)有丝分裂期和晚g2期(的),一个指标26]。在一起,退出细胞周期的评估和发展表明,产妇七氟醚暴露可能导致细胞周期阻滞在s阶段神经祖细胞,这是与中断相关胎儿PFC的分化和增殖。

我们的研究结果表明,胎儿的神经祖细胞的细胞周期扰动PFC导致孕产妇七氟醚暴露后异常增殖和分化,这可能最终导致神经功能障碍的成年子女。我们的研究有助于了解术后神经损伤的机制后,产前七氟醚暴露和呼吁人们考虑麻醉的神经毒性当考虑nonobstetric手术的益处和风险。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢的成员的复旦大学医学神经生物学国家重点实验室技术援助和讨论。这项工作是支持由中国国家自然科学基金(81400867)和上海市科学技术委员会(16 zr1406000)。

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