文摘
高度耐药肿瘤细胞和正常细胞的毒性是关键因素,限制了化疗。在这里,我们使用两个模型的高度耐药肺癌细胞:(1)长时间附着在细胞生长的血清饥饿(pps)和(2)细胞生长浮动tumorspheres (FTs)探讨维拉帕米(VP)的影响结合索拉非尼(SF)。相比常规培养条件下细胞生长(信用社)、公私合伙制细胞或FTs是高度敏感的短期暴露(24小时)副总裁100μM +科幻5μM (VP100 + SF5)。复苏实验暴露细胞VP100 + SF5 24 h后孵化无毒媒体48 h表明pps以及英国《金融时报》时细胞无法恢复,癌症细胞和非癌变细胞行Beas-2B增长在信用社不太敏感,也能明显恢复。VP100 + SF5诱导显著的变化与细胞凋亡相关蛋白的表达,自噬,在较小程度上necroptosis。Coincubation实验z-VAD-FMK necrostatin 1或显示的证据表明氯喹necroptosis发挥了核心作用。我们的数据表明,高度耐药肿瘤细胞可以有选择地消除VP +科幻,necroptosis扮演着中心角色。
1。背景
抗癌药物的毒性细胞癌是一个重要的障碍,限制了抗癌药物的疗效(1]。此外,肿瘤细胞的耐药性等机制增加药物流出,改变或突变的药物靶点,改变DNA修复,逃避凋亡[2)经常限制抗癌药物的疗效。癌症干细胞的存在的族群(二者)或癌症干细胞样细胞(CS-LCs)与药物抗性和肿瘤复发也已经与许多癌症化疗反应差(3]。新颖的治疗选择,有选择性地针对癌症细胞,尤其是那些高阻抗癌药物,与很少或没有毒性正常细胞密集研究的焦点,但成功是有限的。例如,靶向治疗的成功干扰特定蛋白质参与肿瘤发生癌症治疗而不是使用广泛的基础是有限的特定癌症标志物的困难(4)和获得性耐药的发展通过目标蛋白质的突变或替代癌细胞的生存策略的适应性5]。药物更有选择性地针对二者/ CS-LCs再次被确定,但对正常的细胞毒性限制了这些药物的临床应用。例如,盐霉素已被确定为一个高度特定药物对癌症干细胞(6),但它的使用在人类身上可能是有限的由于相当大的毒性观察哺乳动物(7]。
Tumorspheres是有用的药物筛选模型,因为它们在癌症干细胞丰富(二者)或癌症干细胞样细胞(CS-LCs)通常更耐non-CSCs / CS-LCs[相比8),认为形成克隆的能力二者的球体是一个独特的特征(9,10]。维持增殖信号和分裂的能力没有外源性促有丝分裂的刺激导致的不受监管的扩散被认为是肿瘤细胞的标志(11]。这已经证明了神经胶质瘤(12,13)、肺(14),和乳房二者/ CS-LCs [15能够形成球体在无血清没有外源性促分裂原媒体。肺tumorspheres (LTs)和mammospheres (MSs)获得没有任何外部的促有丝分裂的刺激显示增加抵抗传统抗癌药物如紫杉醇(PX)、羟基脲(胡),秋水仙碱(CX)和Obatoclax (OBT)。我们还报道,附着H460肺癌和乳腺癌细胞存活很长一段时期血清饥饿分裂缓慢,成为高度耐PX,胡,残雪,OBT, PI3激酶抑制剂渥曼青霉素(WT)和LY294002 (LY) [16,17]。LTs显示stemness-associated标记的表达升高可能导致二者/ CS-LCs相关的抗多种抗菌素的表型。另一方面,抗多种抗菌素的表型的细胞生长在pps可能广泛的信号通路重新布线的结果而不是增加具备干细胞(16]。这些特征使细胞生长在pps和tumorspheres有用的互补模型筛选药物能够克服多药耐药性以及识别潜在的机制(s)。副总裁是一种钙通道阻滞剂,可以抑制凋亡蛋白的活性和显示潜力作为敏化剂来克服二者的化学抗性/ CS-LCs在各种癌症,包括肺18),胰腺(19),和乳房20.癌症细胞。索拉非尼(SF)是一个multikinase抑制剂,还能抑制ABGC2耐多药蛋白的活性。然而,组合治疗使用VP和科幻小说还没有广泛的特点。
本研究的目的是评估的影响副总裁结合科幻在肺癌细胞生长pps tumorspheres。我们发现短term-exposure VP +科幻选择性和不可逆转地减少可行性,可能通过激活necroptotic细胞死亡,癌细胞生长在pps或tumorspheres但很少或微不足道的影响在信用社非癌症细胞或癌细胞生长。
2。方法
2.1。化学药品和试剂
2.1.1。药物
维拉帕米(副总裁)、z-VAD-FMK (zVAD),氯喹(CQ), poly-HEMA(保利(2-hydroxyethyl丙烯酸甲酯)),和MTT(蓝色四唑溴噻唑基)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,太)。索拉非尼(SF) necrostatin 1 (Nec1)和1-methyl-D-tryptophan (1-D-M-T)从VWR购买(宾夕法尼亚州,二)。股票的解决方案的科幻小说(10毫米),Nec1(10毫米),和zVAD(10毫米)在DMSO和存储在整除−20°C。CQ准备作为股票的解决方案(10毫米)蒸馏无菌水和过滤消毒并存储在整除−20°C。副总裁(50毫米)是刚做好的蒸馏和过滤消毒无菌水。1-D-M-T(20毫米原液)是由在0.1 N氢氧化钠溶解,并使用盐酸pH值调整到7.5,过滤消毒(21),并存储在整除−20°C。最终稀释在文化媒体使用前刚做好的。
2.1.2。细胞培养
人类的肺上皮癌细胞线NCI-H460和非癌变细胞线Beas-2B得到从美式文化集合(弗吉尼亚州马纳萨斯)。Beas-2B细胞是上皮细胞,分离出正常的人类支气管上皮细胞从解剖获得非癌变的个人(http://www.atcc.org)。常规培养条件(信用社),细胞被镀完成媒体和传播(CM) = RPMI 1640 (NCI-H460)或DMEM /高葡萄糖(Beas-2B)补充5%的边后卫,谷酰胺,100 U /毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升。谷氨酰胺浓度rpmi - 1640和DMEM / high-glucose媒体2或4毫米,分别。所有细胞培养在5%的股份有限公司2环境在37°C。常规培养条件下细胞生长(pps)或增长浮动tumorspheres,细胞无血清培养系统中维护媒体(厘米但是没有一样的边后卫,见下面的细节)。
2.1.3。代的肺Tumorspheres (LTs)
代的详细协议浮动tumorspheres生长在没有任何外部的促有丝分裂的刺激可以在Yakisich et al。15]。短暂,H460细胞生长在CM confluency(70 - 80%)无血清培养系统在媒体(SFM厘米一样,但没有的边后卫)。然后,细胞使胰蛋白酶化和孵化SFM至少14天poly-HEMA-coated镀以防止附件。LTs维护,SFM取代每3 - 4天。LTs生长在SFM程度天被用于后续的实验。
2.1.4。短期抗增殖试验(MTT测定和CCK试验)
常规培养条件和附着文化(父母H460和Beas-2B),细胞在96孔细胞培养板微型板块(美国合演)~ 2000细胞/好,一夜之间在CM中孵化。细胞生长在长时间的血清饥饿(pps)细胞(~ 500细胞/)在96孔细胞培养板微型板块和孵化一夜之间在CM中让他们遵守,然后保持在SFM 7 - 12天。然后,细胞暴露在适当浓度的药物或车辆24 - 72 h。细胞生存能力对贴壁细胞MTT试验评估。可溶性甲瓒的吸光度是阅读2.0 570海里使用创5一体化微型板块读者(Bio-TEK,仪器公司)。浮动LTs和海量存储系统(MSs)中,细胞生长在15毫升猎鹰poly-HEMA盘子收集管,离心机在700 rpm×3分钟,resuspended新鲜SFM。为了板相同数量的细胞,这种细胞悬液分离1毫升整除。车辆或药物被添加到每个整除,然后150年μl细胞悬液被加载到每个microwell(96孔板)和孵化72 h。浮动LTs,细胞被CCK-8评估可行性分析(Dojindo实验室)。
在所有情况下,DMSO浓度最高的是用于控制和这个浓度保持在0.01%以下(v/v)。这DMSO浓度没有任何明显的抗增殖作用细胞系或tumorspheres短期试验。
2.1.5节讨论。西方墨点法
制备细胞溶解产物和西方墨点法进行如前所述[22]。PARP抗体,裂解PARP、半胱天冬酶3、半胱天冬酶9日RIP1, MLKL, Beclin, p62, peroxidase-conjugated二级抗体购自细胞信号(丹弗斯,MA)。抗体对GAPDH是购自圣克鲁斯生物技术(达拉斯,TX)。探索了印迹膜1:1000稀释初级抗体和1:4000 peroxidase-conjugated二级抗体。免疫复合物是由化学发光检测使用SuperSignal™西方毫微微最大灵敏度衬底(大热费希尔科学岛,纽约)并使用myECL成像仪拍摄仪器(大热费希尔科学岛,纽约)。
2.1.6。统计分析
所有成对多重比较程序(方差分析,Student-Newman-Keuls方法)使用SigmaPlot (v . 11.0)软件。
3所示。结果
3.1。短期暴露于维拉帕米结合索拉非尼抑制高度耐药肿瘤细胞的可行性
我们第一次调查的能力VP +科幻抑制人类肺癌的可行性H460癌细胞的增长促进具备干细胞的培养条件下,使细胞高度耐药的抗癌药物:(1)细胞生长在长时间的血清饥饿(pps)和(2)细胞生长浮动tumorspheres (FTs)。细胞生长在pps 8天的孵化与副总裁(100 24小时μ米)、旧金山(5μ(50副总裁米)μ(2.5米)+科学小说μ米),或副总裁(100μ米)+科幻(5μ米),可行性是MTT试验测量。图1(一)表明,副总裁或科幻单独或低浓度的VP (50μ(2.5米)+科学小说μ米)对细胞生存能力没有显著影响,但高浓度的副总裁(100μ米)+科幻(5μ米)显著减少的可行性H460癌细胞。类似的效果观察这些药物H460 LTs测试时,和生存能力是衡量CCK试验(图1 (b))。它可以观察到,如图可以在网上https://doi.org/10.1155/2017/5987015与DMSO LTs治疗24小时仅在96 -裸微型板块,细胞能够重新接上。相比之下,副总裁(100μ米)+科幻(5μ米)治疗细胞无法再植和失去完整(图)表明该药物组合诱发细胞迅速死亡,同意大幅减少细胞MTT和生存能力测量CCK化验在pps和罚球,分别。
(一)
(b)
3.2。短期暴露于维拉帕米结合索拉非尼几乎没有影响癌症和癌的可行性在常规培养条件下细胞生长
为了评估VP的效果,科幻小说,和VP +科幻癌细胞(H460)和非癌症细胞(Beas-2B)生长在信用社,文化条件相对高度敏感的肿瘤细胞的抗癌药物和stemness-associated标记的表达水平较低,细胞生长在信用社与副总裁(100孵化24小时μ米)、旧金山(5μ(50副总裁米)μ(2.5米)+科学小说μ米),或副总裁(100μ米)+科幻(5μ米),可行性是MTT试验测量。图2(一个)显示,癌症和非癌症细胞生长在信用社相比更耐VP + SF细胞生长在pps或FTs(见图1)。同时,我们测试了72小时的接触副的影响(图或科幻单独或组合2 (b))。
(一)
(b)
3.3。短期暴露于维拉帕米结合索拉非尼不可逆地抑制肺癌细胞生长的可行性下长时间的血清饥饿(pps)
评估如果短期暴露于VP +科幻小说的影响可以不可逆转地减少肿瘤细胞的生存能力,我们进行了“复苏”的实验,而“连续治疗”实验显示在图 。信用社“复苏”的实验中,在细胞生长和细胞生长在pps 8天治疗与不同浓度的VP +科幻(VP 100μ2.5 M +科幻μM;副总裁50μM +科幻5μM;或副总裁100μM +科幻5μ米)。24 h后治疗,药物,细胞被允许恢复无毒媒体48 h, MTT测定和可行性评估。图3(左面板)表明,细胞治疗24小时,然后允许恢复48 h无毒媒体无法恢复显示比控制细胞生存能力下降。并行实验(“连续治疗”实验),细胞治疗与VP + 72 hs(图的科幻小说3,对面板)。整体而言,这些结果表明,短曝光(24小时)VP +科幻能够不可逆转地诱导细胞死亡在癌细胞增长pps但癌细胞和癌细胞(Beas-2B)可以恢复明显从短期暴露于VP +科幻。此外,我们做了相同的“复苏”的实验,但允许细胞恢复长时间(5天细胞处理VP100 + SF5 24 h)无毒媒体以确保细胞种植在信用社继续恢复,并不像pps的不可逆损坏细胞。在这组实验中,MTT试验将不可靠的细胞由于大量预期控制井~ 6天后文化。相反,最后的实验,细胞被沾染了丙烯酸- 3®染色根据制造商的指令集(Fisher诊断,米德尔顿,弗吉尼亚州)和显微镜下进行评估。图3(一个)显示,当细胞生长在信用社治疗只有24小时VP100 + SF5然后允许恢复连续5天他们能够成长虽然在较低密度相比,控制细胞。再治疗(72 h)完全消除Beas-2B和H460细胞。相比之下,在细胞生长在pps 9天,短期(24小时)和长期(72 h)治疗,完全消除H460细胞(图3 (b))。这些结果是一致的MTT数据如图3。
(一)
(b)
(c)
3.4。VP +科幻调节关键蛋白质的表达参与了细胞凋亡,细胞自噬,Necroptosis泛型类型的方式
来洞察的机制VP +科幻消除癌细胞,我们评估的关键蛋白质的表达参与细胞凋亡(PARP、半胱天冬酶3和半胱天冬酶9),自噬(Beclin-1和p62), necroptosis (RIP1和MLKL)。蛋白溶解产物收集从浮动和附加H460细胞生长在pps 8天,100年12或18 h VP暴露μM +科幻5μM,蛋白质的表达被西方的屁股评估。控制细胞处理当量浓度的车辆(H2O + DMSO 18 h)。相比之下,这些蛋白质标记的表达也是评价信用社在未经处理的细胞生长。图4表明VP100 + SF5调节这些关键蛋白的表达在pps培养细胞。例如,细胞凋亡标记(裂解半胱天冬酶3和裂解PARP)被发现是升高的。VP100 + SF5显著降低自噬标记p62和Beclin-1的表达。necroptosis标记的RIP1水平显著降低。组蛋白溶菌产物对西方的屁股不是表现在稍后时间(例如,24小时)因为显微观察显示广泛的细胞死亡与生存能力(在协议数据呈现在图1)和细胞完整性的损失。
3.5。Necrostatin 1 (Nec1)部分阻止VP +科幻细胞生存能力的影响
由于监测蛋白质表达谱的困难在以后的时代里,我们使用药理抑制剂细胞凋亡(zVAD-FMK (zVAD)), necroptosis (necrostatin 1 (Nec1)),或自噬(氯喹(CQ))来进一步阐明细胞死亡的机制由VP +科幻。H460癌细胞生长在pps与副总裁孵化100 8 - 10天μM +科幻5μ单独或与Nec1 coincubated (50μM)和zVAD (10μ米)。Nec1和zVAD部分获救时细胞生存能力孵化24小时100副μM +科幻5μm .这种保护作用是生长在pps(图中观察到的细胞5(一个))。在细胞生长FTs, Nec1但不是ZVAD部分阻止VP +科幻小说的影响细胞的生存能力(图5 (b))。自噬抑制剂CQ没有保护作用的降低引起的细胞生存能力VP + SF在细胞生长在pps(图6)或FTs(图)。事实上,在细胞生长在pps, CQ显著增强VP 100的效果μM +科幻5μM(图6)。自从Nec1也是一个被罩抑制剂,1-methyl-D-tryptophan的影响(1毫米),一个经典的被罩抑制剂,并不影响necroptosis (23),测试并没有保护作用在细胞生长在pps(图6)或FTs(数据没有显示)。
(一)
(b)
4所示。讨论
肺癌是癌症相关死亡的主要原因24,25],抵抗化疗是治疗这些肿瘤的主要挑战。因此,药物或治疗可以选择性地杀死癌细胞而不伤害正常细胞被认为是神奇的子弹来治疗恶性肿瘤。在这项研究中,我们评估维拉帕米的抗癌效应结合索拉非尼(VP + SF)在肺癌细胞生长在三种不同的文化条件下:常规培养条件(信用社),长时间的血清饥饿(pps)和细胞成长为浮动tumorspheres (FTs)。FTs生长在缺乏外部的促有丝分裂的因素显示升高等传统抗癌药物抵抗PX,残雪,胡14)这是一个特征通常发现在二者/ CS-LCs [9]。肺二者,抵制PX (26)和其他传统抗癌药物如顺铂、阿霉素和依托泊苷(27]。在目前的研究中,我们发现,副总裁和科幻小说,即使在高浓度(100μ米和5μM, resp)。作为一个单独使用时几乎是无效的药物。当结合使用,只有高浓度的VP +科幻(100μM + 10μM,分别地)对细胞的抑制作用表现出强大的生存能力在细胞增长pps(图1(一))以及在细胞增长为浮动tumorspheres(图1 (b))。这种效应是在24小时内观察到的风险。更重要的是,(1)癌细胞和癌细胞生长在信用社更耐24小时接触副总裁(100μ米)+科幻(5μ米)和(2)24小时接触副的影响(100μ米)+科幻(5μM)对细胞生存能力被发现在癌细胞的增长不可逆转的pp。相比之下,信用社在癌细胞和癌细胞生长,细胞能够恢复以来的影响是可逆的一旦VP + SF从媒体(图中删除3)。这表明VP (100μ米)+科幻(5μ米)触发细胞死亡只在细胞生长在pps在24 h以不可逆转的方式。因为技术原因,可逆性测试只有在媒体的贴壁细胞(信用社和pps)可以很容易地更换不需要离心步骤,将FTs所需。
在我们的研究中,我们使用一个非常高浓度的VP: 50 - 100人μm·维拉帕米的平均测量稳态等离子体水平大约是0.5μ米(28]。然而,维拉帕米已经使用在体外作为一个经典的凋亡抑制剂50μ米(18,29日),200μ米(19]。在人类中,科幻小说达到药物的大约10水平μ米(30.)这足以抑制ABCG2浓度(31日]。提到的机制是很重要的VP +科幻结合在一起使用时浓度升高降低高度耐药肿瘤细胞的生存能力可能是与他们无关的表达下调凋亡或ABCG2的表达能力,分别。这种假设背后的解释是,因为我们之前报道,癌症细胞生长在pps反应异常,有时矛盾的各种药理代理人。例如,在H460细胞生长在pps,我们发现VP和科幻小说(单独或联合)诱导而不是减少凋亡和ABCG2的表达式,分别。同样,Obatoclax (bcl - 2抑制剂)下调bcl - 2表达的信用社在细胞增长但诱发矛盾的增加,这种蛋白质在细胞的水平增长在pps (16]。我们认为这个响应的“重组”作为适应反应的细胞信号通路长期血清饥饿,和很可能类似的变化可能发生在FTs,通常生长在无血清条件。额外的实验背后的范围这手稿需要更好地理解这些模型的生物化学抗性为了阐明机制VP +科幻施加强有力的影响在本研究报告。这将有价值的新知识识别或开发新的有毒化合物具有类似活动的高度耐药癌细胞。不管使用高浓度的副总裁可能限制其临床使用的在我们的研究中,我们的数据提供了重要的小说洞察的生物学抗多种抗菌素的癌细胞。首先,我们已经确认的组合药物,不需要长时间暴露于有选择地和不可逆转地消除chemoresistant细胞(如二者/ CS-LCs)尽管有很少或没有影响non-CSCs / CS-LCs以及非癌变细胞(如Beas-2B)。这一发现可以利用发展化疗方案不可逆chemoresistant癌细胞诱导细胞死亡的短期治疗(24小时)。第二,在分子水平上,我们发现VP +科幻调制的关键蛋白质的表达参与细胞凋亡、自噬,necroptosis(图4),但没有确凿的数据可以获得关于类型的细胞死亡引发的这种化合物组合通过分析蛋白质的概要文件。而VP +科幻增加裂解PARP的表达和裂解半胱天冬酶3 H460细胞,这种治疗的水平降低P62和Beclin-1 RIP1表明自噬可能起到保护作用。然而,药理学证据表明necroptosis,在较小程度上,在细胞凋亡中发挥重要作用引起的细胞死亡VP +(1)以来科幻VP +科幻细胞活力的抑制作用可能部分由Nec1阻止细胞生长在pps和tumorspheres。zVAD,一锅半胱天冬酶抑制剂,部分避免VP +科幻小说的影响细胞生长在pps但在FTs(数据没有影响5(一个)和5 (b)),(2)自噬抑制剂CQ没有阻止VP +科幻小说的影响细胞生长在pps和在细胞增长的罚球。此外,显著增强细胞生存能力的减少当CQ VP +科幻(图6)强烈表明,诱导自噬具有保护作用的VP + SF-induced细胞死亡。最后,IDO的缺乏影响抑制剂1-M-D-T表明Nec1施加RIP1的保护作用可能是通过抑制。总的来说,我们的结果显示一个复杂的细胞凋亡之间的串扰,necroptosis,自噬和支持一个模型necroptosis已经引发了一个重要的角色在细胞死亡VP +科幻。zVAD差动保护作用的细胞生长在pps FTs相比,需要进一步评估。一个可能的解释是,在我们的实验系统对细胞生长在pps和细胞生长FTS,我们只使用无血清媒体没有任何外部促有丝分裂的刺激(如表皮生长因子或bFGF)和缺乏促有丝分裂的因素的长度就让细胞死亡机制不同的地位取决于细胞已经多长时间适应SFM条件。支持这个假说微分PARP的蛋白质含量和procaspase 9观察细胞生长在pps与细胞生长在信用社(图4)。我们先前已经表明,细胞生长在pps重建信号通路与多药耐药性和多药耐药性抑制剂的反应异常蛋白质如凋亡[16]。
我们的研究结果清楚地表明VP + SF消除高度耐药肿瘤细胞的能力可能是一个主要阐明底层机制组合(s),需要有选择地消除高度耐药肿瘤细胞负责化学抗性和肿瘤复发。
5。结论
我们首次报告,癌症细胞生长在pps或增长FTs显示耐多药表型,细胞增长的文化条件下相比,高度敏感的VP +科幻。我们提出了药理证明短接触VP +科幻不可逆转地触发死灵法师/凋亡细胞死亡的细胞生长在pps和necroptotic细胞死亡细胞越来越多的罚球。更重要的是,非癌症细胞几乎可以完全恢复从短期暴露于VP +科幻。因此,我们发现了一种新颖的治疗机会,可以被认为是一个“致命弱点”,可以针对有选择地杀死高度耐药肿瘤细胞包括二者/ CS-LCs负责抗肿瘤和肿瘤复发,同时保留非癌症细胞。
缩写
| 信用社: | 常规培养条件 |
| pp: | 长时间的血清饥饿 |
| FTs: | 浮动tumorspheres |
| 副总裁: | 维拉帕米 |
| 科幻小说: | 索拉非尼 |
| CQ: | 氯喹 |
| zVAD: | z-VAD-FMK |
| Nec1: | Necrostatin 1 |
| 1-M-D-T: | 1-Methyl-D-tryptophan。 |
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
本研究从美国国家癌症研究所支持的格兰特CA173069 (NIH / NCI)和HL112630 (NIH / NHLBI)。
补充材料
图S1。代表图像的LTs治疗仅24 h和DMSO(控制)或副总裁(100µM) +科幻(5µM)。放大:20 x (Bar = 200µM)。细胞的插图显示了一个示例再植时板DMSO单独对待。相比之下,在药物治疗板,电池不能再植和清楚显示细胞完整性的损失。图S2。简化模式“复苏”(A)和“连续”图3 (B)实验进行治疗。复苏的实验控制或实验细胞(Exp) DMSO和维拉帕米治疗+索拉非尼(VP + SF),分别。24 h后改变了媒体(MC),孵化与无毒媒体(媒体孤独)48 h和细胞生存能力为72 h。为治疗“连续控制或实验细胞(Exp) DMSO和维拉帕米治疗+索拉非尼(VP + SF),分别和细胞生存能力为72 h。图S3a。代表图像Beas-2B和H460细胞生长在信用社然后治疗72 h和DMSO独自(控制、顶部图片)或副总裁(100µM) +科幻(5µM) (VP100 + SF5) 24 h(图片)或72 h(底照片)其次是孵化无毒媒体长达5天(用于细胞治疗24小时)。 Magnification: 20X. The results clearly shows that Beas-2B and H460 cells treated for 24 h with VP100+SF5 are able to recover while treatment for 72 h is toxic leaving only cellular debris. Figure S3b. Representative images of H460 cells growing under PPSS for 9 days and then treated for 72 h with DMSO alone (control, top picture, left) or VP (100 µM) + SF (5 µM) (VP100+SF5) for 24 h (middle picture, left) or 72 h (bottom picture, left) followed by incubation in drug-free media for up to 5 days (for cells treated for 24h). Magnification: 20X. The insets show examples of control cells (top picture, right) and cell debris (bottom picture, right) showing that treatment with VP100+SF5 for 24 h or 72 h irreversible eliminates H460 cells growing under PPSS. Figure S4.CQ并不妨碍VP + SF在FTs细胞生存能力下降。细胞生长为14 - 16天孵化了FTS VP(100µM) +科幻(5µM)单独或在CQ 24 h。细胞生存能力是衡量CCK化验。结果(X±SD)在第六的代表执行的两个独立的实验。