文摘
人类羊水细胞immune-privileged低免疫原性和抗炎作用。他们能够自我更新、高度增殖和有一个广泛的分化潜能,使他们可以对细胞疗法。羊水(AF)经常获得通过羊膜穿刺术和包含异构foetal-derived祖细胞的数量包括间充质干细胞(msc)。在这项研究中,我们分离人类msc在AF (AF-MSCs)获得剖腹产(剖腹产)和特征。这些AF-MSCs显示典型的MSC等形态学特点,在体外分化潜能,表面标志物表达和分泌的因素。除了波形蛋白和干细胞标志物CD133的亚种群AF-MSCs表示pluripotency-associated SSEA4等标记,c - kit, TRA-1-60,交易- 1 - 81。检查参与组成分泌腺的和相关的基因本体论(去)条款强调他们的免疫调节特性。此外,转录组分析显示相似之处与本地胎儿骨骨髓来源msc。重大KEGG通路以及术语大多是与免疫功能有关,胚胎骨骼系统,TGFβ信号。一个AF-MSC-enriched基因集包括假定的AF-MSC标记PSG5,EMX-2,EVR-3。从本质上讲,C-section-derived AF-MSCs可以经常得到和造型的个性化细胞治疗和疾病。
1。介绍
最近人类房颤研究表明干细胞从第一和第二阶段可以收集在羊膜穿刺术(一种侵入性的产前诊断方法的染色体异常和胎儿感染)(1]。治疗可能包括在体外描述人类羊膜fluid-derived干细胞(AFSCs)首次报道了阿塔拉集团(2]。因为他们的低免疫原性、消炎和高增殖和分化能力在体外,AFSCs的临床应用和组织工程。此外,他们缺乏致癌作用在裸小鼠移植后和有能力创建胚状体后的身体,就像结构特定的治疗。他们可能从外胚层起源,证明了与原始生殖细胞的存在共同的特征,也在讨论(2,3]。AFSC人群在本质上是异构的,foetal-derived-differentiated和未分化的祖细胞(4]。1993年,托里拆利和同事首次报道一个族群的造血祖细胞在房颤5]。有趣的是,在2003年,据报道,一个小族群AFSCs表达pluripotency-regulating标记,octamer-binding转录因子4 (OCT4) [6]。之后,Moschidou同事报道,AFSCs孤立于妊娠早期表达NANOG等多能干细胞细胞相关标记,决定性别的地区Y-box 2 (SOX2) Kruppel-like因子4 (KLF4) stage-specific胚胎antigen-4 (SSEA4), CD133和c - kit (7,8]。他们的自我更新能力也证实,从而表明AFSCs高可塑性和容易可重复编程的作为我们的先前的研究证明(9,10]。在转录水平,它也表明,一个族群的ESCs AFSCs具有较高的重叠与人类分享大约82%的转录组身份(11]。此外,AFSCs被发现旁分泌活跃的媒体含有细胞因子对血管生成产生深远影响,血管生成和骨生成12- - - - - -14]。AFSCs有可能用于临床应用如图所示例如角化细胞分化和后续改善伤口愈合15]。
间充质干细胞(msc)多功能基质干细胞(16,17]。形态,它们呈纺锤状细胞。在体外,这些单独的细胞很容易坚持塑料表面和high-replicative能力(17,18]。几个来源报告从成人和胎儿组织的这些类型的msc可以获得,例如,骨髓(BM)和脂肪组织(19和胚胎外的组织如脐带血液20.,21)和胎盘组织如羊膜和蜕膜而且从第二学期羊水22]。在体外和在活的有机体内msc分化为中胚层细胞如成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞(16,23]。国际社会细胞疗法(ISCT)假定用于移植和细胞疗法,msc不能分化成造血的血细胞,因此不表达任何标记血统如表面标记CD14、CD34、CD45。相比之下,骨髓msc应该表达CD73, CD90、CD105指的是他们的最小特征标准24]。msc等已经被广泛用于治疗移植物抗宿主病,正是在700多个临床试验直到日期(https://clinicaltrials.gov)。频率和分化能力以及增殖潜力BM-MSCs已表现出随着年龄增长而减少(25]。
一个族群间充质特色AFSCs已经从第二和晚期妊娠AF孤立,因此称为羊水间充质干细胞(AF-MSCs)。他们孤立基于塑料的依从性和类似的细胞表面标记成分msc从其他来源。此外,他们还能够分化为骨,软骨,脂肪细胞在体外(23,26- - - - - -28]。各种研究表明,这些AF-MSCs也表达OCT4 [27,28];然而,这仍然是有争议的,因为还没有人的自我更新函数定义在AF-MSCs OCT4已被证明在人类胚胎干细胞(29日]。
AF-MSCs有利的发展阶段,但有问题关于集合的侵袭性procedures-amniocentesis和胎儿感染。因此,C-section-derived房颤可能是这些细胞的另一个来源。然而,羊水只是丢弃在这个过程中这就是为什么很少有研究孤立AFSCs在这个阶段的妊娠。问题是是否足月AF港口AF-MSCs相似能力的细胞获得最初的三个月和其后三个月的怀孕。
在这项研究中,我们为人类AF-MSCs来自剖腹产(第三阶段)和测试他们multilineage分化能力在体外immunophenotype表达间充质标记,检查参与组成分泌腺multipotency标记,转录组,他们的。我们的数据表明,房颤从剖腹产可能代表一个有前途的间充质来源的干细胞来源。目前,最常见的msc的来源是骨髓(BM)。然而,收获和加工BM-MSCs的主要缺点和局限性。因此,重要的一点是,房颤期间收集的剖腹产是AF-MSCs的另一个来源是不成熟和拥有高可塑性使它们适合临床应用。
2。材料和方法
2.1。羊水的准备
三个羊水样本收集人类健康的捐赠者在足月剖腹产的妇产科教授,海因里希海涅大学杜塞尔多夫,德国,与病人的同意以及制度伦理批准和保持在4°C到处理。一般来说,收集和处理之间的时间尽可能短,以减少细胞死亡。首先,房颤是用PBS (Gibco;热费希尔科学、达姆施塔特,德国)和离心机300×为5分钟。浮在表面的丢弃,和颗粒洗了PBS和溶解在氯化铵(杜塞尔多夫大学医院;药房)溶解剩余的红细胞。此后,细胞在4°C的解决方案是孵化20分钟,再次离心。这个过程被重复,直到小球有明确的颜色。之后,这些细胞被张C培养基培养(欧文科学、钙、美国)包含88%αMEM(最低基本培养基鹰α修改;GlutaMAXσ)和10%的边后卫,1%,1%,青霉素和链霉素(所有Gibco), 10% Chang B基础培养基,2% Chang C补充剂(欧文科学)37°C和5%的公司2。一旦连接,细胞可见后4 - 7天,中了。confluency在达到90%,细胞分离使用TrypLE表达(热费希尔科学)和播种到其他板块格式或冻结。
2.2。流仪分析羊水细胞
三个独立的immunophenotyping AF的准备工作是使用人类的MSC表现型工具包(Miltenyi研究GmbH, Bergisch格拉德巴赫,德国)是根据制造商的指示。收获后,2×105AF-MSCs被转移到两个试管。2毫升PBS被添加到每个管和离心300×为5分钟。浮在表面的丢弃,颗粒resuspended在100年μl PBS内管。在一个管,0.5μl MSC表现型的鸡尾酒和其他管0.5μl的同形像鸡尾酒添加和涡的控制。包含的MSC表现型鸡尾酒fluorochrome-conjugated单克隆抗体CD14-PerCP, CD20-PerCP, CD34-PerCP, CD45-PerCP, CD73-APC CD90-FITC, CD105-PE。同形像表现型鸡尾酒包含fluorochrome-conjugated抗体不应该专门检测人工抗原,因此作为消极的控制。管是在4°C的环境在黑暗中10分钟。冲刷不具约束力抗体,1毫升PBS添加和离心300×5分钟了。后来,细胞颗粒固定用4%多聚甲醛(PFA;美国Polysciences Inc . PA)。流仪分析pluripotency-associated AF-MSCs的标记,TRA-1-60,交易- 1 - 81,SSEA4 dye-coupled抗体被用于(anti-TRA-1-60-PE,人类(克隆:REA157), 130-100-347;反-运输- 1 - 81 - pe,人类(克隆:REA246),数量130-101-410,anti-SSEA-4-PE,人类(克隆:REA101), 130-098-369;Miltenyi研究GmbH)。染色过程如上所述。
这些细胞被储存在4°C在黑暗中,直到流仪结果通过BD FACSCanto (BD生物科学、海德堡、德国)和青色ADP(美国贝克曼库尔特,CA)。直方图0.9.3使用FCSalyzer创建的软件版本。
2.3。免疫荧光染色
分析特定标记的细胞,AF-MSCs培养12 -或24-well盘子。confluency在60 - 80%,细胞被洗,随后固定使用4% PFA在室温下15分钟(RT)摇摆平台。固定细胞治疗1% Triton x - 100(卡尔罗斯GmbH & Co . KG,卡尔斯鲁厄,德国)5分钟和阻断缓冲区被加入到细胞。细胞内染色,这个缓冲区包含10%正常山羊血清(门店;σ),0.5% Triton x - 100, 1% BSA(σ),和0.05%渐变20(σ),溶解在PBS。如果被染色的细胞外结构,Triton和渐变都被省略了。在RT阻塞2 h后,第一抗体OCT-4A (C30A3)兔马伯2840号,SSEA4 (MC813)鼠标马伯4755号,钙粘蛋白(e10) 24日兔子马伯3195号,波形蛋白(5 g3f10)鼠标马伯3390号,TRA-1-60鼠标马伯4746号,交易- 1 - 81鼠标马伯4745号(细胞信号技术、马、美国),CD133 PA2049(美国宾夕法尼亚州博士德生物)和c - kit (h - 300)兔多克隆免疫球蛋白(Tebu生物,奥芬巴赫,德国)在阻塞缓冲/ PBS稀释和添加到细胞的培养时间1 h RT,洗了三遍后PBS渐变20 0.05%,相应的二级Cy3或Alexa萤石488 -抗体(热费希尔科学)和赫斯特33258染料(Sigma-Aldrich化学GmbH, Taufkirchen,德国,1:5000年阻止缓冲区)应用的可视化主要抗体和细胞核,分别。图像是用荧光显微镜(LSM700;蔡司、从、德国)。
2.4。在体外分化成脂肪形成的,Chondrogenic和成骨的血统
AF-MSCs从段落5到6的区别进行了使用StemPro脂肪形成分化装备,StemPro软骨形成分化装备,和StemPro成骨分化工具包(Gibco,生命技术、钙、美国)。微分媒体由混合90毫升制定各自的基底媒体10毫升的相应的补充和1.1毫升的青霉素和链霉素。confluency 60 - 70%,培养细胞的分化媒体或Chang C(控制井)发起的。媒介是每2 - 3天更换一次三个星期。这一时期后,介质被移除,这些细胞被洗的PBS和固定的4% PFA在RT摇摆平台上30分钟。随后,细胞被染色的不同开发结构。
2.5。油红O染色脂肪细胞
固定细胞用50%乙醇洗净,然后0.2%油红O工作的解决方案是添加到井和孵化为30分钟RT摇摆平台上。这个解决方案彩色发达脂肪空泡。0.2%油红O工作解决方案是由稀释0.5%油红O原液(σ)和蒸馏水和过滤。与50%乙醇洗两次后,至少3次用蒸馏水,直到所有多余的油红O的解决方案是,细胞被保存在PBS和图像与光学显微镜拍摄。
2.6。阿尔新蓝染色的软骨细胞
固定后,应与阿尔新蓝染色细胞,软骨细胞蛋白多糖硫酸存款明显蓝色。细胞首先用PBS和1%阿尔新蓝8 gx(σ)解决方案,准备在0.1 N盐酸(HCl),是补充道。这些细胞被染色在RT摇摆平台上30分钟。之后,这些细胞被洗了三次0.1 N HCl溶液和蒸馏水,直到阿尔新蓝的解决方案是完全移除。细胞被保存在PBS显微成像。
2.7。茜素红S染色为成骨细胞
茜素红S(σ),特别污渍发达钙沉积后用于染色细胞成骨分化。细胞被洗与PBS固定后,在蒸馏水和2%茜素红S的解决方案。30分钟后孵化RT摇摆平台上,细胞用蒸馏水洗净,然后用PBS去除剩余的染料。光显微分析,细胞被保存在PBS。
2.8。Secretome分析
由AF-MSCs检测细胞因子的分泌蛋白质组分析器人类细胞因子数组面板(研发系统、马、美国)根据制造商的说明进行。最初,1.5毫升的条件培养基(汇集等于卷三个独立AF-MSC样本用于这项研究)是使用。该数组被发射的化学发光检测评估。每个发现的像素密度使用软件ImageJ细胞因子进行了分析。膜上的所有景点包括引用和消极控制地点分别测定。相关变化和基于像素密度值计算。50的像素密度值被设置为阈值。
2.9。RNA隔离
孵化后试剂盒(热费希尔)5分钟在RT摇摆平台上,这些细胞被分离和冷冻在这个解决方案在−80°C。RNA被孤立使用Direct-zol RNA MiniPrep工具包(Zymo研究、钙、美国),已经包含DNase。结果RNA是溶解在RNA / DNAse自由水和分析使用NanoDrop 2000(热费希尔)分光光度计。
2.10。转录组分析
微阵列实验进行PrimeView人类基因表达阵列(Affymetrix热费希尔科学)的两个样品AF-MSCs (AF-MSC1 AF-MSC2),胎儿骨骨髓来源msc (fMSC)和胚胎干细胞(H1、H9)以及人类包皮fibroblast-derived诱导多能干细胞(万能)和在线提供在国家生物技术信息中心(NCBI)基因表达综合(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE100448)。非规范珠摘要通过R / Bioconductor[数据进一步处理30.使用包affy(环境)http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/affy.html)[31日]。background-corrected获得数据,转换为对数刻度(2)底部,并归一化采用健壮Multiarray平均法。使用的热图的热图和聚类分析生成的。2function from the gplots package, and the correlation coefficients were measured using Pearson correlation as similarity measure (http://CRAN.R-project.org/package=gplots)。
2.11。基因本体论、KEGG通路和网络分析字符串
后转录组分析基因本体相关条款和KEGG通路(32)的不同的基因集生成使用大卫工具(https://david.ncifcrf.gov/)[33),字符串网络工具是用于网络聚类分析(https://string-db.org/)[34]。
3所示。结果
3.1。隔离和文化C-Section-Derived AF-MSCs
在妊娠足月剖腹产,房颤使用注射器(图收集1(一))和转移到50毫升管。液体的红色表明红细胞的存在。房颤是洗两次与PBS(数字1 (b)和1 (c)),那么剩下的红细胞被resuspending细胞溶解细胞颗粒在氯化铵(图1 (d))。额外的洗涤后,颗粒有发白的颜色指示成功去除剩余的血液细胞(图1 (e))。显微分析纯化后直接显示不均匀混合物不同的细胞类型(图1 (f))。首先,连接细胞可见后4 - 7天。使他们通过两次后,异构形态的细胞(图1 (g))变得更加均匀的纺锤状呈形式(图1 (h))。细胞培养,直到他们都表现出均匀的MSC形态,然后用于进一步的实验。
(一)
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(g)
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3.2。在体外分化能力和细胞表面标记物的表达
调查他们的多能干细胞分化能力,AF-MSCs从三个独立准备分化成脂肪形成的挑战,chondrogenic,成骨方向采用不同的分化媒体3周。成功分化为脂肪细胞被染色观察新兴脂肪滴油红O解决方案(图2(一个)A1)。脂肪空泡包围了细胞核。在chondrogenic分化过程中,细胞聚集和阿尔新蓝染色显示出现蛋白聚糖的存在发展细胞集群内的软骨细胞(图2(一个)A2)和成骨的谱系分化茜素红S染色显示钙沉积(图发展2(一个)A3)。视觉化的细胞开始第一周后。细胞的控制井仍呈。细胞从所有准备显示更高的倾向分化成成骨的血统比到其他两个调查血统就是明证分化领域的细胞培养皿内约90%。
(一)
(b)
3.3。流仪分析细胞表面标记物的表达
分析AF-MSCs细胞表面标记的存在,人类的MSC表现型工具包(Miltenyi研究GmbH, Bergisch格拉德巴赫,德国)使用含有抗体MSC-related标记CD73 CD90、和分别CD105抗体CD14造血的标记,结合CD20, CD34、CD45鸡尾酒。染色后,细胞用流式细胞分析仪进行分析。在三个独立AF-MSC准备,CD73, CD90、CD105阳性细胞已经上升到90%。正如预期的那样,所有细胞的准备都没有血液标记CD14、CD20, CD34、CD45(图2 (b))。此外,AF-MSCs分析pluripotency-associated细胞表面标记物的表达。分组人口的大约33%的细胞呈阳性SSEA4而14%的细胞呈阳性TRA-1-60和8%呈阳性交易- 1 - 81(图3 (b)、B1、B2和B3)。
(一)
(b)
3.4。在AF-MSCs Immunofluorescent-Based干细胞标记物的分析表达式
AF-MSCs纺锤状形态,表达类型III中间丝波形蛋白(图3(一个)A1)由间充质细胞和表达广泛用作间充质指标(35]。同时,这些细胞为阴性上皮(图3(一个)A2)作为上皮细胞的标记。CD133的表达/ prominin-1(图3(一个)A3),多能祖细胞的标志包括msc (36,37),检测。我们孤立的种群没有表达OCT4或NANOG(图3(一个)、A5、A6)。然而,AF-MSCs表示c - kit, SSEA4 TRA-1-60,交易- 1 - 81(图3(一个)A4, A7、A8和A9)。细胞呈阳性的比例进行标记与仪数据流是相一致的。
3.5。Secretome分析
AF-MSCs分泌细胞因子的能力是运用一系列细胞因子调查。为了达到这个目标,从三个不同的细胞培养上清液AF-MSC准备使用细胞因子数组是汇集和分析。这显示趋化因子的存在(碳碳主题),配体2 (CCL2;MCP-1), C-X-C主题趋化因子1(处于受控;GROα),CXCL12 (SDF-1)集落刺激因子2 (CSF2;gm - csf)、细胞间粘附分子1 (ICAM1;CD54)、白细胞介素- 6 (il - 6)、引发IL-21,巨噬细胞移动抑制因子(MIF)和纤溶酶原激活物inhibitor-1 (PAI-1;SERPINE1)在不同的水平高于背景表达(数字4(一)和4 (b))。CCL2,处于受控,il - 6,引发最高的分泌细胞因子。平均水平的分泌CSF2被发现,ICAM1, MIF, SERPINE (PAI-1)而CXCL12和IL-21表示在最低的水平。分泌细胞因子的基因本体术语分析显示与免疫调节特性等相关条款“免疫反应,”“趋化性,”和“炎症反应”(图4 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.6。重叠,不同的基因表达,基因本体和通路有关
层次聚类(图5(一个)基于AF-MSCs的转录组的概要文件,fMSCs,多能干细胞(H1、H9、万能干细胞)显示一个更紧密的关系AF-MSC1和AF-MSC2原生fMSCs多能干细胞。热图来源于转录组数据(图5 (b))表明,细胞更接近fMSCs AF准备。热图由17个基因通常AF-MSCs之间,表达下调,fMSCs,多能细胞。基因的表达主要在AF-MSCs fMSCs波形蛋白(VIM),CD44,CD73,CD105,SERPINE1以及成骨的标记runt-related转录因子2 (RUNX2)和增长/分化因子5 (GDF5)。相比之下,AF-MSCs和fMSCs都没有钙粘蛋白和多能性标记OCT4,SOX2,NANOG。维恩图分析(图5 (c))透露,11148个基因在所有细胞类型的重叠。有趣的是,AF-MSCs共享更多的基因(489)与多能干细胞比fMSCs (442)。KEGG通路分析的基因之间共享多能干细胞和AF-MSCs磷脂酰肌醇通路的参与和Notch信号(补充图可以在网上https://doi.org/10.1155/2017/5932706)。然而,AF-MSCs明显表达了181个基因。
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(d)
皮尔森相关分析的转录组数据(图5 (d))显示高度相关(0.89和0.90)之间AF-MSC1和AF-MSC2 fMSCs但是相关性较低(0.78 - -0.81)多能细胞。重大KEGG途径以及相关的基因本体术语房颤之间共享基因样本和fMSCs与免疫功能有关,骨骼发展,TGFβ信号(图)。
3.7。AF-MSC-Specific基因表达分析
派生的热图是使用181 AF-MSC专属基因集(图6(一))。的一个子集,这些基因可以用来识别可能AF-MSC标记基因(图6 (b)),包括PSG5,C4orf26,C8orf4,EVR-3,EMX-2,C15orf37。此外,基因本体分析聚焦于生物过程(图6 (c))与骨骼系统开发和相关的基因的参与模式。组织基因分布分析(图6 (d))显示181个AF-MSC-specific基因之间的关系和不同的胚胎组织。最突出的组织是睾丸,肾脏和下丘脑。其余的基因分布在其他器官。AF-MSC-specific基因集(181个基因)进一步相比已经发表的转录组数据集报AFSCs [11)和维恩图解(图的可视化6 (e))。25个基因包括HOXB7,APBB1IP,HOXB8,PTHLH,ZPLD1被发现之间的共同表达这两种基因集。指相关基因本体术语中,这些基因主要是与胚胎骨骼系统形态发生,积极调节分支参与输尿管的花蕾形态发生,骨骼系统发展,监管中肾发展以及前/后模式规范。
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(c)
(d)
(e)
3.8。网络分析的181 AF-MSC专属基因
181年AF-MSC-specific基因的网络分析是使用字符串工具并预测4个不同集群(图7):集群1显示模式和胚胎发育等相关HOX基因的同源框B7 (HOXB7)、集群包含immunity-related基因2(例如,CSF2)和集群3包括细胞外基质(ECM)相关基因集(例如,层粘连蛋白亚基α3 (喇嘛3)而集群4显示WNT通路,包括signalling-related基因集WNT10A。网络分析也揭示了功能性生物过程(BP)浓缩的区域化,前/后模式规范,脊索动物的胚胎发育,胚胎器官发育,胚胎骨骼系统形态发生。
4所示。讨论
相比我们的结果,结果表明,来自骨髓msc附着在细胞培养皿镀后三天内而脐带和脂肪tissue-derived msc附加在第一个24小时(38]。的长期附件时间AF-MSCs可以解释环境的变化(羊膜与不同的化学物质的微环境),高异质性的细胞,干细胞的患病率较低在期限内羊水相比第一和中期妊娠羊水。除了纤维母细胞,其他细胞形态出现在房颤的准备,但随着时间的推移,这些稀释和增加通道数字(图1)。剩余的细胞间质形态和表达波形蛋白缺乏钙粘蛋白(图2(一个)A1和A2)。在衰老AFSCs Wolfrum等人报道epithelial-like形态11]。Hoehn等人同样认识到不同人群在中期妊娠房颤具有呈或者epithelial-like形态(39,40]。类似人口的增殖功能,纤维母细胞长期体外培养的激增30多个段落和epithelial-like形态也被观察到。然而,大多数的研究获得AFSCs羊膜穿刺术。这个过程已经限制访问流体与某种程度的风险胎儿和母亲(41]。房颤的收集足月妊娠或分娩期间在本研究可能是一个可能的选择健康的二倍体患病率较高的胎儿相比一线和second-trimester-derived房颤。
可能表现出multilineage分化为骨、脂肪、软骨细胞的C-section-derived AF-MSCs(图2(一个),A1, A2, A3)也是前所述AFSCs来自羊膜穿刺术。AF-MSCs来自羊膜穿刺术的chondrogenic分化潜力已经被报道(42],特别是成骨分化潜能,进一步用于骨缺损模型强调了这些细胞的力量建立成骨细胞(43),因此可以用于未来的骨相关的治疗方法。
期间获得的AF-MSCs剖腹产显示典型的MSC的细胞表面标记表达CD73, CD90、和CD105平行缺乏造血的标记CD14、CD20, CD34、CD45(图2 (b)ISCT[所描述的)24]。然而,正如在以前的研究中显示,不同的个人和msc的起源,分别会导致改变细胞表面制造商表达式(23]。
的转录因子OCT4协会和NANOG SOX2已被证明是多能性的关键驱动因素29日]。不过多数AFSC发表的研究到目前为止只有关注但不是函数表达式。
与其他研究描述OCT4和晚期妊娠NANOG表达AF-derived细胞,我们的分析显示这些标记为阴性caesarean-derived AF-MSCs [27,28,41]。在我们的例子中,我们确定了奇异细胞质OCT4 positive-expressing细胞在章节1 - 2,但更多的使后,这些细胞被稀释(数据没有显示)。这种变化可能是由于通道的数量,不同的协议,文化的方法和媒体使用。
之前显示的分组人口AFSCs第一和第二阶段表达了多能性标记OCT4、NANOG, SOX2,原癌基因,KLF4 [6,7,10]因此首先表明,预测AFSCs测定多功能和表达pluripotency-associated标记。虽然Prusa等人声称OCT4表达式由5个11独立AF-MSCs(没有通过数字表示)的实时PCR。此外,他们只显示一个细胞被积极OCT4房颤的准备。此外,这个OCT4积极性不是解决的功能(6]。
然而,对于妊娠前三个月c-Kit-positive AFSCs被转换为多能性状态通过补充丙戊酸在多能性支持媒体和矩阵。(10]。当丙戊酸能诱导多能性,这些细胞不同于为微阵列分析(即可见一斑9]。额外的结果(7进一步支持我们的观察,发展的潜力AFSCs随妊娠时间。还显示了在我们目前的研究中,转录组聚类分析显示清晰分离AFSCs和为其7]。因此,可以得出结论,早期词的亚种群AFSCs重组事件的更敏感但不多能。
在这项研究中,我们演示了SSEA4的表达,早期胚胎醣脂类抗原immunofluorescent和流量仪分析(数据3(一个)、A7和3 (b)B1)。这种蛋白质不发挥重要作用在维持多能性,也已被证明能够被表达在成人BM-MSCs [44,45]。此外,这些细胞被发现c - kit积极(图3(一个),A4),这是至关重要的维护和分化的造血干细胞,多能祖细胞(46]。据报道,c-Kit-expressing细胞显示分组人口的msc来源于脂肪组织具有较高的端粒酶表达和分化潜能(47]。此外,族群的AF-MSCs剖腹产也表达了TRA-1-60和交易——1 - 81所示immunofluorescent-based染色以及流仪分析(数据3(一个)、A8和A9,3 (b)B2和B3)。这与现有的研究孕期出现房颤的准备工作(48]。
趋化因子及其相应受体是重要的吸引和感染白细胞的归航,损伤或炎症网站(49]。msc表达这些受体,因此它已经表明,骨骨髓来源msc对趋化因子和生长因子的趋化作用[50]。由于他们的免疫调节特性,msc广泛应用于临床应用在移植物抗宿主病(51]。检查参与组成分泌腺,依照我们的数据(图3)揭示从AF-MSCs至少9个不同的细胞因子的释放,米拉贝拉等人分析了AFSC-conditioned媒体和识别已知proangiogenic和抗血管新生等因素的存在血管内皮生长因子(VEGF)、CXCL12,引发,CCL2,两种血管生成抑制剂干扰素(干扰素γ),和CXCL10 IP-10分泌蛋白(13]。除了血管生成,AFSCs还有助于骨直接或间接通过分泌不同的细胞因子(14]。
AF-MSCs及其分泌的治疗潜力的分子分析小鼠急性肝衰竭,和大量的促炎介质,调节细胞因子和生长因子在AF-MSC-conditioned媒体如il - 10, IL-27, IL-17E, IL-12p70, il - 1βIL-1ra,观察。一些组织修复的促进因素,即SERPINE1 MCP-1, SDF-1,也确定了52]。我们的结果同意前面的比较从msc源自骨髓细胞因子释放,脐带血和胎盘。先前的细胞因子调查过我们的工作是一样的。MIF、引发SERPINE1, GROαmsc, il - 6分泌的所有调查的来源。胎盘msc表示ICAM-1 (CD54), MCP-1 (CCL2)和骨髓msc分泌MCP-1 (CCL2)和SDF-1 (CXCL12)除了53]。其他的研究,调查了大量的细胞因子显示额外的咆哮的表达,正无穷γ,il - 1α,TGFβ、血管生成素和制瘤素M [54]。AF-MSCs公布的营养因素,将为未来的治疗具有十分重要的意义。
集群系统树图的分析清楚地表明,转录组的两个AF-MSC样本聚集一起fMSC样本而多能细胞则和ESCs (H1, H9)聚集在一个单独的组(图5(一个))。两个AF-MSC准备收购本地胎儿msc(数字的表达谱5 (b)和5 (d))。他们缺乏pluripotency-associated标记OCT4,NANOG,SOX2但表达MSC标记CD44,CD73,CD105,波形蛋白。
最近的研究调查AFSCs的基因表达模式在不同段落的illumina公司微阵列检测到1970个差异表达基因表达谱和分类成9不同的集群。包括基因表达逐渐增加和更高的段落CXCL12,CDH6,FOLR3。另一方面,重要的表达下调基因CCND2,美丽,IGF2,BNP-B,CRABPII(55]。分析数据集的维恩图在目前研究显示一组专门的基因表达的AF-MSC样品(图5 (c))。从181年的热图AF-MSC-specific基因(图6(一))被转录组分析,一群潜在AF-MSC标记基因提取。这组包含PSG5,C4orf26,C8orf4,EVR-3,EMX-2,C15orf37在别人(图6 (b)),其中一些等C8orf4尚未为特征。使用这些181个基因,基因本体进行了分析和大部分的条款在前10名生物过程的结果是骨和骨骼发展(图6 (c))。全球基因表达AFSCs相比AF-iPSCs和ESCs揭示基因与自我更新和多潜能(1299个基因,例如,POU5F1,SOX2,NANOG,microRNA-binding蛋白质LIN28)以及AFSC-specific基因(665个基因,例如,OXTR,HHAT,RGS5,NF2,CD59,TNFSF10,NT5E)中确定AFSCs [11]。AF-MSC-specific基因从我们的研究进一步研究使用字符串工具,建立了4种不同的集群(图7):模式和胚胎发展HOX基因,immunity-related基因,ECM-related基因,和一套WNT通路和signalling-related基因符合KEGG通路分析(图)。相比之前确定了665 AFSC-specific基因,我们可以显示一个重叠的25个基因(图6 (e)),包括HOXB7,APBB1IP,HOXB8,PTHLH,ZPLD1它也出现在最高表达基因在我们的样品(图6 (b))。这些基因主要参与骨骼发育(图6 (e)和表年代)。这个子集的基因是公认的标记基因AF-MSC将来选择程序。
5。结论
在这项研究中,我们已经证明,人类族群的AFSCs (AF-MSCs)隔绝AF剖腹产确实msc会议期间收集的公认的标准和定义(16]。此外,我们表明,转录组AF-MSCs更类似于BM-MSCs(皮尔森相关的0.9)比真正的多能干细胞(胚胎干细胞系H1和H9真皮fibroblast-derived iPSC线),尽管他们表达知名pluripotency-associated标记。我们终于证明了自己能够分泌大量的细胞因子和生长因子旁分泌信号的关键。总的来说,剖腹产section-derived羊水相比,从羊膜穿刺术获得对胎儿没有风险,包含AF-MSCs与临床应用潜力巨大。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
Lucas-Sebastian Spitzhorn和Md Shaifur拉赫曼的贡献同样这项工作。
确认
教授和博士教授詹姆斯•阿贾耶挚友Fehm承认医学院的支持,Heinrich-Heine-Universitat杜塞尔多夫。此外,教授承认詹姆斯•阿贾耶支持德国学术交流服务(德意志)(91607303)。