文摘

背景。神经嵴间充质干细胞(msc)人类口腔组织具有免疫调节和再生能力,逐渐成为一个潜在的治疗工具来治疗不同的疾病,如多发性硬化、心肌梗死和结缔组织赔偿。除了细胞表面抗原,牙科msc表达胚胎干细胞标记神经嵴细胞起源于外胚层层。体外段落可能最终修改这些胚胎具备干细胞标记表达式和其他属性,包括扩散。在目前的研究中,我们调查了蛋白质的表达参与了细胞增殖/衰老和胚胎干细胞标记在早期(通道2)和晚期的段落(15)通过msc来自人类的齿龈,牙周和牙髓组织。方法。细胞增殖测定β牛乳糖染色、免疫细胞化学和实时PCR技术应用。结果。细胞增殖试验显示早期和晚期的段落之间没有差异而衰老标记p16和p21大大增加。胚胎干细胞标记包括斯基尔,MEIS1 JARID2调制P2和P15细胞之间有差异。讨论。我们的研究结果表明,胚胎和增殖标记的存在即使在后期通过可能支持的应用较为dental-derived msc在干细胞的临床试验。

1。介绍

间充质干细胞(msc) nonhaematopoietic基质细胞。他们self-renewable能够分化成不同的细胞类型,包括间质血统(软骨细胞、成纤维细胞、成骨细胞、脂肪细胞和肌腱)和星质/内胚层的血统(肺细胞、神经细胞、肝细胞、肝细胞、胰岛细胞、心肌细胞、内皮细胞(1- - - - - -3]。多功能属性,免疫调节特性和能力直接迁移到受伤组织和发起组织修复,使得再生医学(msc不可避免4,5]。人类可以从骨髓中分离msc,脂肪,牙科,脐带,沃顿商学院的果冻,胎盘组织。特别是,从牙科组织获得更大的利益获得的msc由于微创实践收集口腔组织,自体或同种异体干细胞治疗方案,并能分化成各种细胞类型在体外(6,7]。描述了六种不同类型的人类牙齿msc:(1)牙科卵泡前体细胞(hDFPCs),(2)牙髓干细胞(hDPSCs),(3)从人类脱落乳牙牙髓干细胞(棚),(4)干细胞从顶端的乳头(hSCAP),(5)牙周韧带干细胞(hPDLSCs)和(6)gingiva-derived干细胞(hGMSCs) [8- - - - - -10]。治疗作用的牙科msc已经证明在临床前和临床研究11- - - - - -13]。

许多组织颅面地区,包括牙髓和牙周韧带,都起源于外胚层的神经嵴在胚胎发生(14]。因此,msc源于这些成人牙科组织表达胚胎干细胞标记,如NANOG SSEA4, SOX2, Oct4 [15),以及细胞表面抗原。胚胎干细胞标记物的表达在牙科msc较为可能有助于干细胞的临床试验;然而,剩余数量的干细胞需要完成任何临床试验。因此,多个亚文化从最初的细胞需要获得最佳的移植的细胞数量。然而,重要的是要提到,长期的文化这些牙齿和其他成人msc可以调节具备干细胞的特性,包括增殖和分化,随着时间的推移,(16- - - - - -18]。

在目前的研究中,我们调查了蛋白质的表达参与了细胞增殖/衰老和胚胎干细胞标记,包括NANOG SOX2, Oct4、hPDLSCs, hDPSCs, hGMSCs早期通道(通道2,P2)和晚期通道(通道15,P15)。

2。材料和方法

2.1。道德的声明

这项研究是在医学院伦理委员会批准,“G。邓南遮“大学、基、意大利(266号/ 4月17日,2014)。所有受试者中研究组织收集之前签署的同意书。

2.2。细胞培养建立

hPDLSCs孤立于牙周组织和牙髓的hDPSCs noncarious第三臼齿提取矫正目的,如前所述[19]。牙龈组织收集手术期间对提取多余的牙齿或牙龈切除术矫正原因。hGMSCs是从组织样本分离后自发移民据Soundara Rajan et al。20.]。所有捐助者是在良好的健康状况和免除口服和系统性疾病。细胞培养使用MSCGM-CD介质(间充质干细胞生长介质化学定义)(Lonza、巴塞尔、瑞士)和保持在一个孵化器37°C在湿润的气氛中5%的有限公司₂在空气中。细胞直到P2和P15亚文化。所有实验进行了一式三份。细胞从每个捐赠者被单独使用。

2.3。Cytofluorimetric评价

样本染色表面或胞内抗原(补充表在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/5651287),如前所述Diomede et al . 201621]。数据分析使用FlowJo™软件(美国TreeStar、亚什兰或)。计算平均荧光强度比(MFI比率)除以积极事件的MFI MFI的负面事件(22]。

2.4。细胞生存能力分析

hPDLSCs的可行性、hDPSCs hGMSCs P2和P15测定使用3 - (4 5-dimethylthiazolyl-2) 2, 5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT)方法。2×10³细胞/被放置在一个96 -组织培养板和孵化在37°C 24、48、72 h, 1周。在每个时间点,MTT方法(20μl) (Promega、米兰、意大利)被添加到每个检测细胞的代谢活动。所有的盘子都在黑暗中培养3 h在37°C。上层清液在650 nm波长使用微型板块阅读读者(Synergy HT, BioTek乐器,Winooski VT,美国)。台盼蓝收获细胞的倍增时间在24日,48岁,72 h, 1周的文化和计算通过使用一种算法在线(http://www.doubling-time.com)。

2.5。Mesengenic诱导分化

人类PDLSCs hDPSCs, hGMSCs P2和P15诱导mesengenic分化据Trubiani et al。23]。短暂,细胞与茜素红S和adipo油红染色方案评估成骨的和脂肪形成的分化,分别观察通过光学显微镜,徕卡DMIL(徕卡微系统、米兰、意大利)24]。

2.6。β-Galactosidase染色

细胞被固定使用0.5毫升的固定剂的解决方案(提供Abcam衰老检测设备(Ab65351 Abcam,剑桥,英国))在室温下10 - 15分钟。随后,细胞染色0.5毫升的染色方法(半乳糖苷20毫克/毫升)一夜之间在37°C。比例的积极染色细胞(蓝色)与总细胞数通过随机选择10×10目标放大光学显微镜下微观领域徕卡DMIL(徕卡微系统)。

2.7。免疫组织化学分析

hPDLSCs、hDPSCs hGMSCs处理Trubiani et al . 2016[之前报道的23]。反人类的p16(1:200年,兔子)(圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,CA,美国)p21(1:50,兔子)(圣克鲁斯生物技术)被用作主要的单克隆抗体。随后,细胞被孵化的1 h在37°C Alexa萤石568红色荧光共轭(1:200年,山羊antirabbit)(分子探针,表达载体,尤金,或者美国),二级抗体。

染色细胞骨架肌动蛋白和核,细胞治疗与Alexa萤石488 phalloidin绿色荧光共轭(1:200年,分子探针)和TOPRO(1: 200年,分子探针),分别。

蔡司LSM510META共焦系统(蔡司,耶拿,德国)是用于分析染色细胞,使用计划Neofluar油浸物镜(63×)。显微图得到使用氩激光激发线在488 nm和543和665海里的氦氖激光器的来源。

2.8。免疫印迹分析

免疫印迹过程执行如前所述Rajan et al . 2016 (25]。p16(美国TX Bethyl实验室Inc .,蒙哥马利;1:4000)和p21(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国;1:500)被用作主要的抗体。β肌动蛋白(圣克鲁斯生物技术;1:750)是用来评估统一蛋白质加载。乐队被发射极耦合逻辑分析方法使用联盟2.7 (UVItec有限,剑桥,英国)。

2.9。RNA提取和TaqMan定量实时PCR

从hPDLSCs总RNA提取,hDPSCs, hGMSCs P2和P15使用RNeasy迷你包(Quiagen、希尔登,德国)。2μg从每个样本反向转录的RNA使用高容量RNA-to-cDNA工具包(应用生物系统公司、福斯特、英国)。分析mesengenic分化,RUNX-2,高山,PPARγ,FABP4标记评估据Cianci et al。26]。此外,定量实时PCR进行一个96 - TaqMan®数组人类转录调控网络在胚胎干细胞制造商的指示和运行在7900年Abi ht测序检测系统(应用生物系统公司)。每个板包含42个化验相关干细胞多能性包括Oct4等一系列转录因子(octamer-binding转录4)SOX2 (SRY性别决定地区(Y)方框2),和NANOG (NANOG同源框)和4看家基因。在转录活性基因co-occupied Oct4、SOX2 NANOG,基因为分化为胚胎外的指定重要的转录因子,内胚层、中胚层和外胚层的血统(例如,ESX1L(精子形成,胚胎外的Homeobox-1同族体(鼠标),HOXB1 (Homeobox-B1) HAND1(心脏和神经嵴衍生品Expressed-1) MEIS1说Homeobox-1), PAX6(成对box 6) LHX5 (LIM Homeobox-5) MYF5(肌原性的把5),和ONECUT1(一个削减Homeobox-1))。放大周期是10分钟95°C紧随其后40周期在95°C和1分钟15秒60°C。三个独立的实验运行为每个条件共有18个盘子。每个样本作为重复运行在同一个盘子里。实时数据分析DataAssist软件(应用生物系统公司)。使用全球标准化分析,GAPDH, 18岁,HPRT1被选为选定的内部控制。只有基因没有离群值复制和最大值= 35是包括在分析中。当显示一个基因被认为是差异表达值< 0.05;值调整使用Benjamini-Hochberg罗斯福修正。创新路径分析(IPA)软件(美国智慧系统,雷德伍德城,CA)来推断生物功能的选择基因数据集。IPA预测功能描述基于已知的基因功能的交互和排名的重要性评分(27]。

p16和p21基因表达分析中存在使用相同的cDNA用于表达阵列。特定的引物和探针集采用买来ThermoFisher科学(美国沃尔瑟姆,MA):p16Hs00923894_m1和p21Hs01040810_m1。执行中存在的总量30μl包含KAPA探针快速Abi棱镜qPCR工具包(KAPA生物系统公司),25 ng cDNA, 1μl primer-probe混合物(20 x)在7900年Abi ht测序检测系统。所选对GAPDH基因相对表达是纠正(Hs02758991)作为内生控制(美国马ThermoFisher科学、沃尔瑟姆)。实时放大条件如下:10分钟95°C紧随其后40 15秒的周期在95°C, 1分钟和60°C。每个样品一式三份。ΔΔCt方法被用来比较样本之间的相对褶皱的变化和控制。t以及用于评估价值,考虑数据显著。

2.10。统计分析

数据分析使用GraphPad Prism 6.0(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)与单向方差分析测试,随后Bonferroni事后测试多个比较。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。Cytofluorimetric评价

hPDLSCs短期和长期的段落,hDPSCs, hGMSCs干细胞标记物的表达特点。特别是,他们表现出积极性CD13、CD29、CD44, CD73, CD90、CD105, CD166 HLA-ABC, NANOG, OCT4、SSEA4, SOX2。相反,所有的细胞都为阴性以下标记:CD14、CD31、CD34、CD45、CD117, CD133 CD326和HLA-DR(表1,2,3)。

3.2。扩散分析

hPDLSC hDPSC,那时hGMSC与商用MTT测定增殖试验设备(图1)。增殖率为检测到24、48、72 h, 1周的文化。短期和长期passage-cultured细胞之间的差异没有统计学意义在hPDLSCs, hDPSCs和hGMSCs(数字1(一),1(c)1(e)、职责)。

MTT数据被台盼蓝排斥试验染色证实。结果从hPDLSCs锥虫蓝染色,hDPSCs, hGMSCs P2和P15显示对数增长文化时间(数据1(b),1(d)1(f),职责)。

3.3。Mesengenic分化

评估成骨分化,细胞在P2和P15染色茜素红S的解决方案。钙沉淀均检测到相同的P2和P15 hPDLSCs, hPDSCs和hGMSCs(数字2(a1),2(a2),2(b1),2(b2),2(c1)2(c2))。确认细胞分化能力维持在P2和P15 RUNX-2和高山分析中存在(数字2(a3),2(b3),2(c3),职责)。此外,评估脂肪形成的谱系分化,细胞被沾油红O解决突出脂滴堆积在细胞质水平(数字2(d1),2(d2),2(e1),2(e2),2(f1),2(f2))。PPARγ,FABP4 adipogenic-related标记是表示没有显著差异在P2和P15细胞(数字2(d3),2(e3),2(f3))。两个mesengenic分化组间无显著差异。

3.4。衰老标记评估

我们检查hPDLSCs、hDPSCs hGMSCs P2和P15衰老标记β牛乳糖。P2,一些数量的积极半乳糖苷solution-stained细胞检测(数字3(一),3(c)3(e))。有趣的是,β只在hPDLSCs牛乳糖染色显示更积极,hDPSCs, hGMSCs P15(数字3(b),3(d)3(f),职责)。高放大照片放在特定的积极证据颗粒在胞质染色水平(数字3(b),3(d)3(f))。图3(g)显示的百分比β在P2和P15 -gal-positive细胞评估,验证在光学显微镜获得的结果。

标签的p16衰老标记显示出轻微的积极性在P15 hPDLSCs(图B2)和hDPSCs(图B2),而基底染色是注意到在P2 hPDLSCs(图A2)和hDPSCs(图A2)。最小的染色p16观察P2和P15在hGMSCs(数字年代A2和S3B2,职责)。另一个衰老标记,p21显示,微不足道的染色在P2和较低的阳性染色P15在hPDLSCs(数据C2和S1D2职责)。相同的结果在P2和P15 hDPSCs(数据C2和S2D2 resp。)和hGMSCs(数据C2和S3D2职责)。

3.5。p16和p21分析

p16和p21显示相比略有增加表达模式在P15 P2在所有三个主要文化()(数据4(一),4(b)4(c))。rt - pcr结果显示,免疫印迹显示hPDLSCs upregulation的衰老标记检查,hDPSCs, hGMSCs P15。特别是,一个低表达p16和p21是注意到在所有主要的文化(P2数据吗4(d),4(e)4(f))。光密度分析特定的乐队确认p16和p21表达式在hPDLSCs hDPSCs和hGMSCs ()(数据4(g),4(h)和4(我),职责)。β肌动蛋白被用作加载控制蛋白质。

3.6。基因表达

为了验证功能的干细胞系和维持增殖和分化能力长期体外培养后,我们分析了基因表达的转录调控网络的签名在hGMSCs胚胎干细胞,hPDLSCs,和hDPSCs P15在文化条件下,相对于P2。人类PDLSCs明显表达了22个基因,hDPSCs 21基因,显示重要的调制和hGMSCs显示重要的21个基因的表达在通路通过15(数字5(一个),5 (b),5 (c))。此外,所有的细胞都在P15显示强烈的表达减少POU5F1和SOX2 NANOG是表达下调约50%的hPDLSCs hDPSCs;然而,NANOG表达式在hGMSCs不变。hGMSCs通路基因表达调制相似,hPDLSCs显示记录的超表达,如FOXC1 MEIS1, STAT3和ZFHX3而hDPSCs揭示了一个独特的基因超表达的签名只有三个成绩单(GBX2 JARID2,和斯基尔)。异丙醇三个基因的功能分析数据显示,这些基因主要参与细胞、胚胎、组织发展和在基因表达调控(图6)。异丙醇分析显示,hGMSCs和hPDLSCs增加在分化过程中,特别是外胚层的分化而hDPSCs显示转录活动的减少和低分化模式,尽管overexpressing JARID2和斯基尔参与骨的,muscular-differentiation模式(数据未显示)。

IPA-inferred基因网络分析的三个基因数据集的差别表明P15在对这些SOX2和POU5F1触发器的调制分析记录三个条件以不同的方式(数字7,8,9)。事实上,细胞内途径不同的监管,显示的具体激活HESX1, MEIS1,和TCF7L1 hPDLSCs;CDYL的激活,GATA6 SALL1,是hGMSCs;,JARID2 GBX2的激活和hDPSCs斯基尔。IPA调制基因差异表达功能分析表明,这是由于这些细胞分化的能力,在特定的血统。

4所示。讨论

近年来研究证实,牙科组织作为替代来源msc和再生牙msc的应用已经证明不仅在牙齿再生,还在其他疾病(28]。一起干细胞相关细胞表面标记物,由于他们的神经嵴来源,牙科msc表达胚胎也具备干细胞标记(29日),这可能会影响他们在体外分化成不同的细胞谱系。

msc从口腔组织可以被认为是一个有趣的访问自体的干细胞平台,为再生医学提供一个替代来源。特别是,牙髓和牙周韧带表达蛋白类似bmsc,可以向成骨诱导,脂肪形成的,chondrogenic,神经源性分化26,30.]。

大规模扩张的msc与低等级的衰老非常干细胞移植的关键。然而,成人msc更长一段连续的段落可能影响胚胎具备干细胞特性,包括增殖和分化标记(17,18]。

在目前的研究中,我们调查了胚胎标记的表达和蛋白质参与扩散/ hPDLSCs衰老,hDPSCs,并在两个不同的段落:hGMSCs P2和P15。所有口头主要文化表达表面抗原标记与msc、CD13、CD29、CD44, CD73, CD90、CD105, CD166 HLA-ABC, NANOG, OCT4、SSEA4, SOX2。此外,我们注意到细胞增殖的程度在P2和P15 hPDLSCs之间保持不变,hDPSCs, hGMSCs。这些结果表明,牙科msc高度增殖甚至在P15。细胞增殖的效果hPDLSCs hDPSCs,牙齿根尖周的卵泡msc研究之前,有报道称hDPSCs显示足够的11 - 14之间的扩散通道(31日)和根尖周的卵泡msc显示细胞增殖比hDPSCs和hPDLSCs32]。然而,在我们的研究中,我们没有发现任何不同的细胞增殖率hPDLSCs, hDPSCs, hGMSCs P2和P15。

然后我们在hPDLSCs衰老标记物的表达,分析hDPSCs, hGMSCs。连续的段落可能可能在msc诱导衰老,细胞衰老导致衰老和衰老相关疾病(33),具有危险long-term-cultured msc移植干细胞疗法。Senescence-associatedβ在只有P15牛乳糖染色显示更少的积极性,而没有注意到染色在P2所有牙科msc。另一方面,衰老标记p16表情略增加在hPDLSCs 15通道和hDPSCs hGMSCs。与此同时,p21另一个衰老标记保持不变在hPDLSCs P2和P15 hDPSCs, hGMSCs。额外的实验更多的文章需要执行研究衰老现象在这些牙齿msc。

最后,我们研究了选择性的表达具备干细胞胚胎在早期和晚期的段落标记。rt - pcr技术显示,胚胎标记OCT4、SSEA4 SOX2, hPDLSCs NANOG出席P2, hDPSCs, hGMSCs。其他胚胎标记SALL1 OTX1缺席P15 hPDLSCs。NANOG表达减少在P15 hPDLSCs和hDPSCs hGMSCs虽然仍然没有改变。此外,我们注意到异构CDYL等胚胎标记的表达,FOXC1, HESX1, JARID2, MEIS1,和MYST3 P15在hPDLSCs hDPSCs, hGMSCs。不同胚胎具备干细胞标记物的表达在人类骨髓msc经,脂肪组织,心,真皮在早期段落之前已经报道(34]。虽然来源于神经嵴组织,结果从我们的数据表明,msc不同的牙科组织可能获得不同的变化具备干细胞标记与属性在长期的文化扩张。

神经性NEUROG1等标记,休息,和ZFHX3 hPDLSCs中不同调制,hDPSCs,和在P15 hGMSCs假设连续亚文化的牙科msc可能最好是频道它们分化成神经祖细胞。考虑到神经嵴来源的牙科msc、必须执行额外的实验调查潜在的牙科tissue-derived msc在自主神经发生分化。标记的表达参与调节细胞生长、增殖,和DNA修复机制如RIF1和表达下调,而斯基尔表达调节在hPDLSCs P15 hDPSCs, hGMSCs。其他细胞增殖标记是,TCFL1 TRIM24 P15不同调制。这些结果证实了我们的细胞增殖数据,显示明显的扩散在hPDLSCs P15 hDPSCs, hGMSCs。

5。结论

总之,我们的结果表明hPDLSCs, hDPSCs, hGMSCs增殖在P2和P15以相似的速度。衰老标记p16只是稍微修改一段末,p21保持不变。胚胎具备干细胞标记在P15不同调制。我们得出这样的结论:表达胚胎和增殖标记在段末轻度监管的衰老可能建议使用oral-derived msc在干细胞疗法。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

弗朗西斯卡Diomede和Thangavelu Soundara Rajan的贡献同样这项工作。Emanuela Mazzon和奥丽埃纳Trubiani贡献同样高级作家这个工作。

确认

这项工作是支持的前60%的基金。

补充材料