文摘

细胞发展是受mRNA-encoded蛋白质和小分子核糖核酸的复杂网络,所有输送到调制的自我更新和分化的基因。基因内小分子核糖核酸和宿主基因转录coregulated及其功能关系控制的神经干细胞(nsc)知之甚少。我们在这里提出基因内mir - 326及其宿主基因β-arrestin1小说球员具备干细胞的表观遗传沉默保持在正常小脑干细胞。这样的监管是由岛屿CpG甲基化的共同发起人。表观遗传的脱抑制β-arrestin1 / mir - 326具备干细胞分化信号或脱甲基代理会导致抑制特性和细胞生长,促进细胞分化。β-Arrestin1抑制细胞增殖,提高核细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27的表达。因此,我们提出一个新的小脑nsc的控制机制,协调精细调节表观遗传机制β-arrestin1 / mir - 326表达,因此nsc具备干细胞和细胞生长。

1。介绍

神经干细胞(nsc)被认为培养层次发展程序自我更新和pluri / multipotency负责的扩张和/或维护一个未提交的细胞群池。nsc准备接受血统限制和随后的级联终端分化的作用下监管地貌成因的线索(1]。早期产后小鼠小脑包含多功能nsc,可以分离和体外扩大。nsc保持未分化表型在促有丝分裂的信号,并能分化成神经元的不同(2]。

最近的证据强调了至关重要的作用的小分子核糖核酸(microrna)赋予神经细胞在神经感应身份,神经元分化,和亚型规范(3]。microrna普遍存在在整个基因组,在那里他们可以找到基因间或者基因内(特别是intronic)地区(4]。转录基因间和基因内的microrna可能受自己的推动者,一些基因内microrna是否赞同他们的宿主基因启动子,生成pre-miRNA mRNA,都起源于相同的记录(5,6]。随之而来的时空coexpression意味着功能基因内microrna及其宿主基因之间的关系。

我们发现mir - 326作为所需microrna的区分小脑颗粒细胞祖细胞(gcp)成熟的颗粒细胞(7]。这是嵌入第一个内含子的micrornaβ-arrestin1 (βarr-1)基因和宿主基因相同的调节序列(8,9]。由于干细胞对gcp的承诺是一个重要的事件在小脑发展(2,10我们提出的问题在小脑NSC mir - 326表达和调控。我们报告,mir - 326表达进一步下调NSC祖承诺之前,其宿主基因的差别以及对这些。因此,我们调查了表达式、函数和监管mir - 326 /βarr-1在nsc转录单位。

2。材料和方法

除非另有指示,媒体和补充剂是从Gibco-Invitrogen购买(CA)卡尔斯巴德,化学品买来Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州),和商业产品根据制造商的指示/协议。

2.1。细胞培养
2.1.1。神经干细胞培养

从产后小鼠小脑得到4-day-old野生型小鼠BL6 (Charles River)批准的机构审查委员会(8,9]。简单、组织收集与0.5%葡萄糖和penicillin-streptomycin hbs补充,严重磨碎与血清学吸管和DNAse对待我的最终浓度为0.04% 20分钟。减少孔大小的细胞机械分离使用吸量管获得单细胞悬液。神经干细胞(nsc)派生而来,通过选择性培养基富集(SM): DMEM / F12补充葡萄糖0.6%,25毫克/毫升胰岛素,N-acetyl-L-cysteine 60毫克/毫升、肝素2毫克/毫升,20 ng / mL EGF, 20 ng / mL bFGF (Peprotech落基山,新泽西),penicillin-streptomycin, B27补充维生素a在克隆镀clonogenicity测定细胞密度(1 - 2细胞/毫米2)到96孔板。诱导分化,nsc被镀到D-poly-lysine-coated菜肴在分化培养基(DFM: DMEM / F12和N2补充2毫克/毫升肝素钠,0.6%葡萄糖,和60毫克/毫升N-acetyl-L-cysteine,含1%小牛血清PDGF 10 ng / mL(σ,P3076)或RA 2毫米(σ,R2625), 48小时)。

2.1.2。超表达研究

Amaxa nucleofector (Lonza)被用来使转染质粒根据制造商的过程。pcDNA3β-arrestin1 HA的礼物是罗伯特·莱夫科维茨(Addgene质粒# 14693):[11];mir - 326矢量及其负控制从GeneCopoeia购买(MmiR3333-MR01)。

2.1.3。可拆卸的实验

沉默的β-arrestin1执行使用ON-TARGETplus SMARTpool (l40976 - 00 - 005)与热科学、测试每一个核池后,单独或结合的特异性,避免脱靶效应。

2.1.4。细胞增殖

细胞增殖是由BrdU评估公司如前所述[2]。更多的细节,与BrdU 24小时脉冲后,nsc镀在poly-lysine-coated Lab-Tek室幻灯片(盖玻片)和允许坚持3个小时。细胞用4%多聚甲醛固定,permeabilized Triton x - 100, 0.1%和BrdU检测(罗氏)执行。核与赫斯特复染色试剂。细胞数在一式三份和BrdU-positive原子核是带注释的数量。

NSC增长以MTT试验(Promega)根据制造商的指示。每个样品测量至少一式三份,重复三次。

甲基化分析,nsc处理10μM 5-azacytidine (5-AZA)四天。

2.2。RNA分离和基因表达分析

总RNA纯化和反向转录如前所述12]。定量rt - pcr(存在)使用7900年ABI棱镜ht序列分析检测系统(热科学),使用最佳覆盖TaqMan基因表达分析,具体为每个mRNA分析。每个放大进行了一式三份和三个阈值的平均周期是用来计算的成绩单(热科学)。信使rna量化表达,在任意单位,如前所述13]。信使rna量化表达,在任意单位,样本数量的比值校准器或控制样本的平均值。所有值都是归一化三个内生控制,β肌动蛋白,β2-microglobulin,产生Hprt。microrna的表达水平进行评估在RNA样本使用特定实现retrotranscription茎环引物(热科学),紧随其后的是一个定量rt - pcr使用miRNA-specific TaqMan探针(热科学)7900年ABI棱镜ht序列检测系统(热科学)。microrna的表达水平正常化RNAU6B (14]。

2.3。免疫印迹分析

细胞细胞溶解使用缓冲区里帕(Tris-HCl pH值7.6 50 mM,脱氧胆酸钠盐0.5%,氯化钠140毫米,NP40 1% EDTA 5毫米,氟化钠100毫米,焦磷酸钠2毫米,和蛋白酶抑制剂)。溶菌产物8%丙烯酰胺凝胶分离和免疫印迹使用标准程序。以下使用抗体:反β-arrestin1 K-16 (sc - 8182;圣克鲁斯生物技术,CA), anti-mouse Nanog (Cosmo生物有限公司、日本),anti-mouseβIII-tubulin (MAB 1637微孔),anti-actin I-19 (sc - 1616;圣克鲁斯生物技术,CA)、anti-GAPDH (ab8245;Abcam), anti-Sp1 1 c6 (sc - 420 x;圣克鲁斯生物技术,CA), anti-p27 (f8) (sc - 1641;圣克鲁斯生物技术)、anti-Sox2 (MAB4343微孔Billerica, MA), anti-Oct4 (ab19857;Abcam), anti-mouseβ三世微管蛋白(1637微孔Billerica马伯,MA), anti-GFAP MAB360(微孔Billerica, MA)和anti-PARP p85片段(G7342 Promega) (anti-parp-C)。HRP-conjugated二级抗体(圣克鲁斯生物技术,CA)被用于结合增强化学发光(ECL Amersham, Amersham,英国)。核/胞质分离、细胞细胞溶解在冰与含有20毫米玫瑰的缓冲区,pH值7.4,20%的甘油,50 mM氯化钾,1毫米EDTA, NP 40 5%,蛋白酶抑制剂。离心后收集细胞质分数(上层清液)。颗粒状核分数与缓冲区包含20毫米熟知的细胞溶解,pH值7.4,25%的甘油,400毫米氯化钠,EDTA 1毫米,1毫米EGTA,蛋白酶抑制剂。

2.4。原位杂交和免疫荧光测定

使用的所有试剂探针杂交之前准备DEPC-treated水(焦碳酸二乙酯,σD5758)防止核糖核酸酶污染。

细胞被固定为4% PFA在室温下10分钟。与PBS 3洗后,细胞培养2分钟10μg / mL蛋白酶K(σP2308) 37°C。

乙酰化作用增强信号背景比执行,使用1.2%三乙醇胺(σ90279),盐酸0.0018 N, 0.25%乙酸酐(σA6404)在室温下不断搅拌10分钟。细胞被洗3次与PBS和prehybridization执行使用50%甲酰胺(σF9037), 5 xssc缓冲区(丙烯酰胺的猫。S6639-1L), 0, 1% Tween-20 9 2毫米柠檬酸(σC1909), 50μg / mL肝素(σH4784),和500年μg / mL酵母RNA(σR6750) 3小时在62°C。杂交探针(双DIG-labeled Exiqon)在杂交缓冲的最终浓度稀释25 nM,变性在85°C 5分钟,在冰上冷却,然后孵化在62°C细胞上16个小时。

样本孵化为0.1 x SSC缓冲3小时在67°C和洗3次,0.1米Tris-HCl pH值75和0.15 M氯化钠。非特异性抗体绑定执行阻塞试剂(罗氏11096176001),0.5% 5%绵羊血清(σS3772),在50 mM Tris-HCl pH值7.5,5毫米EDTA在室温下2小时加湿室。荧光素共轭anti-DIG是孵化的稀释1:200年阻止缓冲区在4°C为16小时。抗体孵育后,样本洗3次,0.1米Tris-HCl pH值75和0.15 M氯化钠和盖玻片安装使用荧光安装(DAKO S3023)。

如前所述(执行免疫荧光13]。更多细节,nsc在Lab-Tek室培养幻灯片固定在4%多聚甲醛在室温下20分钟,permeabilized 0.1% Triton x - 100细胞,阻断缓冲区中孵化(PBS 1% BSA) 30分钟,然后用anti-HA圣克鲁兹(sc - 7392)在一夜之间在屏蔽解决方案在4°C。488 -共轭anti-rabbit二级抗体购自分子探针(表达载体)。核与赫斯特复染色(H6024σ)。至少300核数一式三份。荧光是可视化和图像获得与卡尔蔡司显微镜(Axio观察者Z1)使用ApoTome技术和AxioVision数字图像处理软件。

2.5。岛屿CpG甲基化分析

mir - 326 /βarr-1监管区域被Rulai检索数据库(http://rulai.cshl.edu/TRED/)。

CpG岛被发现在监管的区域mir - 326 /βarr-1通过使用数据库的CpG岛(DBCAT)软件和分析工具。

甲基化特异性PCR引物的设计通过使用甲基底漆表达软件v1.0,热费希尔科学。引物第一次测试和验证使用鼠标通用DNA甲基化鼠标标准(Zymo研究)。

2.5.1。亚硫酸氢盐处理和PCR扩增

使用Qiamp DNA提取了DNA迷你包(试剂盒)。获得的DNA量化使用Nanodrop分光光度计(热科学)和亚硫酸氢EpiTect处理工具包(试剂盒)。转换后的DNA被用来PCR-amplifyβarr-1监管区域以下引物:MeFw: TTTTTATTTTTTGGGCGCGTATACMeRw: GTCCAAACTAAAAAATCCCCGACUnFw: TTTTTATTTTTTGGGTGTGTATATGTUnRw: CATCCAAACTAAAAAATCCCCAAC

积极控制我们使用鼠标通用DNA甲基化鼠标标准(Zymo研究)。

2.6。统计分析

统计分析使用StatView 4.1软件执行的细胞实验一式三份(Abacus概念,伯克利,CA)。Mann-Whitney统计差异进行了分析 测试和非参数值 值≤0.05被认为是显著的。结果表示为均值±SD从至少三个实验。

3所示。结果

3.1。mir - 326和βarr-1表达与具备干细胞负相关

首先我们评估mir - 326的表达水平和其宿主基因βarr-1在国家安全委员会(数据1(一)- - - - - -1 (d))。nsc显示,相比大部分preneurosphere细胞群(T0)非常低水平的成熟和前体mir - 326和形式βarr-1(数据1(一)- - - - - -1 (d)),加上一个增强的表达Nanog具备干细胞标记(图1 (d))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图1
mir - 326和βarr-1下调在小脑nsc相比大部分小脑人口。(一)mRNA表达水平的主要(pri - mir - 326)和前体(pre - mir - 326)相比,nsc mir - 326的大部分细胞(T0)。(b)成熟mir - 326年的水平相比,nsc大部分细胞(T0)。(c)βnsc arr-1 mRNA水平相比,大部分细胞(T0)。(d)对内源性免疫印迹(WB)分析βarr-1 Nanog在nsc相比,大部分细胞(T0)。肌动蛋白作为加载控制(LC)。(一)——(d)数据意味着±SD从3独立实验。 。

这些结果表明,mir - 326 /损失βarr-1轨迹表达式是“干细胞表型。”这个概念进一步支持的观察,mir - 326的表达βarr-1增加nsc暴露于分化刺激,例如,维甲酸(RA)或血小板源生长因子(PDGF)(数据2(一个)- - - - - -2 (d))。在这些条件下nsc能够分化成不同的血统的增加表达的神经元分化标记,βIII-tubulin (βIII-tub)和NeuN和星形分化标记Gfap和S100(数字2 (c)和2 (d))和downmodulated具备干细胞的表达相关标记Nanog Oct4、Sox2(数字2 (c)和2 (d))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图2
mir - 326和βarr-1在分化nsc调节。(a) mir - 326水平评估NSC暴露于分化刺激(DFM)与维甲酸(RA)或血小板源生长因子(PDGF) 48小时。数据意味着±SD从3独立实验。 。(b)荧光原位杂交(ISH)染色mir - 326的nsc具备干细胞生长在条件(SM)和后RA-induced分化(DFM) 48小时。核与赫斯特复染色。比例尺:10μ从4米。代表伊什图像独立实验。(c) mRNA的表达水平βarr-1具备干细胞和分化的标志NSC在SM和分化(DFM)。(d)对内源性免疫印迹(WB)分析βarr-1和具备干细胞的标记(Nanog、Sox2 Oct4)和微分(βIII-tub和Gfap) nsc在SM和分化(DFM)。Gapdh加载控制(LC)。((c)和(d))数据意味着±SD从3独立实验。 。
3.2。表观遗传失活的mir - 326 /βarr-1轨迹

接下来,我们负责mir - 326 /调查机制β在nsc arr-1轨迹失活。有越来越多的证据表明,表观遗传调控干细胞,包括“CpG岛”甲基化,是至关重要的保护具备干细胞通过控制特定的发育基因的转录开关开/关(15]。

实际上,几个CpG岛在该地区的存在从第一外显子第一内含子(图的一部分3(一个)和补充图1:看到补充图1在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/5274171)提出了一个DNA methylation-dependent控制。治疗的nsc 5′-azacytidine (5-AZA)脱甲基剂诱导mir - 326的显著增加,其前兆记录,βarr-1水平(图3 (b)具备干细胞)和受损的功能虽然增加了细胞分化(数字3 (c)和3 (d))。使用甲基化特定PCR我们评估选定的CpG岛的甲基化状态。我们发现这些岛屿CpG甲基化在nsc但不是大部分人口(T0)(图开始3 (e))。此外,摘要5-AZA处理时,分析了CpG岛失去了甲基化状态(图3 (f)),强烈建议upregulationβarr-1和mir - 326是由于脱甲基的启动子区域(图3 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
图3
CpG岛mir - 326 /甲基化βarr-1调控序列控制βarr-1和mir - 326的表达。(a)的示意图表示鼠标mir - 326 /βarr-1监管区域,突出CpG岛地区岛屿(浅蓝色)和中央人民政府网站(蓝色)源自DBCAT软件。(b) mRNA的表达水平βarr-1和前体形式的mir - 326和mir - 326表达水平在nsc 5-azacytidine 4天后(5-AZA)治疗。数据意味着±SD从3独立实验。 。((c) - (d)) mRNA表达水平(c)和内源性免疫印迹分析(d)βarr-1,具备干细胞标记(Nanog, Oct4、Sox2)和分化标记(βIII-tub和Gfap)经过4天的5-azacytidine nsc (5-AZA)治疗。肌动蛋白是信用证。数据意味着±SD从3独立实验。 。(e)的甲基化特异性PCR筛选地区nsc相比大部分人口(T0)开始。(f)甲基化特异性PCR筛选地区在nsc 5-AZA治疗。((e)和(f))图像数据代表三个独立的实验。

这些发现强调的甲基化状态βarr-1 / mir - 326CpG岛是一个机制来沉默小脑nsc的表达式。

3.3。β通过增加p27 arr-1负调节nsc自我更新核表达水平

上述数据表明一个角色mir - 326和βarr-1建立“分化表型。“众所周知,mir - 326控制一些具备干细胞维持的地貌成因的信号,如Hedgehog途径和Notch通路(7,16),我们发现它能够调节Gli2和Smo的表达也在nsc(数据没有显示)。事实上,mir - 326超表达在nsc(图2补充)显著降低clonogenicity(图补充2 b)和细胞生存能力(图补充2 c)。

另一方面,以前的研究已经表明βarr-1函数作为核穿梭蛋白质与p300 / CBP的转录激活细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂Cdkn1b / p27kip (p27),退出细胞周期的主要决定因素(16]。来洞察βarr- - - - - -1功能具备干细胞在神经细胞和分化,我们过表达βarr-1(数据4(一)和4 (b)),发现一个强大的障碍的表达水平具备干细胞标记Nanog Oct4、Sox2(数字4 (b)和4 (c)),受损clonogenicity增殖率下降和细胞生存能力(数据4 (d)和4 (e)),增加细胞凋亡(图4 (f)),这表明βarr-1可能有一个角色在具备干细胞特性的调节和细胞周期的调控。事实上,我们发现,当转移到分化培养基,nsc增加βarr-1水平平行p27转录的激活和增加p27蛋白在细胞核中观察到核/便细胞质分离实验(图5)。因此,p27信使rna和蛋白质核细胞分数水平增加了体内表达βarr-1(数据6(一)和6 (b))和减少siRNA-mediated废除βarr-1表达式(数据6 (c)和6 (d))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
图4
βarr-1过度损害nsc clonogenicity和扩散。(一)代表图像nsc的免疫荧光染色后超表达HA -βarr-1。核与赫斯特复染色。比例尺:5μm。(b)世行分析内源性nsc在超表达HA -具备干细胞标记βarr-1。加载控制:肌动蛋白。代表免疫印迹图像从3独立实验。(c) mRNA表达水平具备干细胞标记在nsc超表达HA -βarr-1。(d) Oncosphere成形试验(许多殖民地,左面板)和溴脱氧尿苷(BrdU)吸收(右面板)在nsc的异位表达HA -βarr-1。(e)细胞生存能力(MTT试验)在NSC的异位表达HA -βarr-1。(f)世行分析裂解Parp (Parp-c)在nsc超表达HA -βarr-1。加载控制:Gapdh。代表免疫印迹图像从3独立实验。((c)、(d)和(e))数据意味着±SD从3独立实验。 。
(一)
(一)
(b)
(b)
图5
β通过p27表达arr-1控制nsc增殖。(一)p27 mRNA表达水平评估中存在的nsc种植条件具备干细胞分化后(SM)和(DFM) 48小时。数据意味着±SD从3独立实验。 (vlsi和SM)。(b)免疫印迹显示出内生的亚细胞定位βarr-1和p27在SM或DFM NSC培养48小时。βarr-1和p27蛋白在胞质水平评估(阶段)和核(Nuc)分数。Gapdh和Sp1蛋白质含量作为纯洁的加载控制和标记阶段和Nuc分数,分别。代表免疫印迹图像从3独立实验。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图6
β通过p27表达arr-1控制nsc增殖。(一)βnsc arr-1和p27信使rna表达水平与HA -转染βarr-1质粒48小时。(b)的亚细胞定位β在nsc arr-1和p27蛋白转染与HA -βarr-1质粒,转染后分析了48小时。蛋白质是胞质中所示(阶段)和核(Nuc)分数。Sp1:核加载控制;Gapdh:细胞质加载控制。代表免疫印迹图像从3独立实验。(c)βarr-1和p27信使rna表达水平在nsc转染和小干扰rna (siCtr)或控制β小干扰rna (si arr-1β在DFM arr-1)培养24小时。(d)免疫印迹显示内生βnsc arr-1和p27蛋白水平与小干扰rna (siCtr)或控制转染β小干扰rna (si arr-1β在DFM arr-1)培养24小时。代表免疫印迹图像从3独立实验。((a)和(c))数据意味着±SD从3独立实验。 。

这些结果表明,完全βarr-1通过激活p27的表达抑制细胞周期从而阻断细胞nsc具备干细胞特性。

4所示。讨论

在本研究中我们提出一个模型中,表观遗传沉默基因内mir - 326及其宿主基因,βarr-1,保持生理神经具备干细胞。而mir - 326和βarr-1高度表达在细胞分化诱导生长被捕,在nsc他们通过CpG甲基化保持在低水平。的表达的连贯,调制βarr-1通过过度监管小脑nsc的分化和增长率。的活化位点mir - 326 /βarr-1提高了细胞周期抑制剂p27而抑制增殖信号(例如,Hh或切口mir - 326),从而导致干细胞分化和生长被捕(图7)。


图7
mir - 326和β-arrestin1 epigenetically沉默和控制在小脑nsc具备干细胞特性。我们提出一个模型中,表观遗传沉默基因内mir - 326及其宿主基因,β具备干细胞-arrestin1,保持生理神经。在小脑nsc mir - 326和β-arrestin1 epigenetically沉默通过CpG岛的常见的启动子甲基化,导致分子的表达环境受纳prostemness proproliferative线索。分化或脱甲基治疗后,启动子的轨迹mir - 326 /β-arrestin1脱甲基,因此mir - 326的表达水平β-arrestin1调节。虽然mir - 326目标分子属于Hedgehog途径和Notch通路,从而阻碍具备干细胞特性,β-arrestin1作为辅因子的转录激活p27,导致细胞周期阻滞。

这些发现表明一个新的mir - 326 /组成的电路βArr-1、地貌成因的分子和细胞周期修饰符控制具备干细胞神经状态。

特别是,我们确定βarr-1作为一个新球员在小脑nsc的协调控制。βarr-1第一次被确定为一个基因编码一个脚手架蛋白调节G-protein-coupled受体(GPCR),通过与细胞质蛋白质交互链接GPCRs胞内信号通路(17,18]。我们的观察的作用βarr-1在nsc符合gcp中观察到的逮捕βarr-1直接影响基因表达,把进入细胞核,它与目标基因启动子的转录辅因子p27 [19]。

,先前的研究调查的角色CDK-inhibitor开车时在抑制自我更新和增殖分化的国家安全委员会(17,18,20.,21)和小脑祖细胞(22,23]。进一步联系p27和干细胞/祖细胞分化是由p27-destabilizing效应引起的休息,神经分化的抑制因子,导致维护细胞增殖和神经元分化的封锁24]。这样,p27保持高营业额的损失自我更新的细胞,通过耦合控制细胞周期和未分化状态的能力。值得注意的是,βarr-1过度也细胞生存能力和增加细胞凋亡影响的nsc表明这样的脚手架适配器蛋白质可能有其他可能的函数在控制不同的机制除了细胞生长被捕。

我们的研究结果强调协调表观遗传机制,精心调节mir - 326 /βarr-1表达和神经干细胞的细胞生长。实际上,相同的启动子驱动的表达βarr-1和mir - 326通过小脑NSC的表观遗传控制。

mir - 326 /的能力βarr-1epigenetically监管也链接这成绩单过程具备干细胞保存状态。事实上,越来越多的证据支持干细胞的表观遗传调控的关键作用,包括国家安全委员会(25]。这样的监管包括机制负责维护专制染色质状态在特定位点,组成的岛屿CpG甲基化(26]。

因此,在我们的研究中mir - 326和βarr-1沉默基因的nsc的监管有利于平衡细胞生长和分化的反对力量。事实上,mir - 326 /βarr-1启动子特征是通过甲基化或脱甲基CpG岛在NSC或分化细胞,分别。

有趣的是,符合这一点,mir - 326和βarr-1描述了多发性硬化的关键分子发病机理,对CD4 + T细胞是至关重要的生存和分化。事实上βarr-1增强的表达protooncogene Bcl2通过乙酰化组蛋白H4在Bcl2启动子(27]虽然mir - 326提升白介素17 (IL-17)生产辅助T细胞(th 17)针对Ets-1分化,th17细胞分化调控的负面(28]。值得注意的CD4 + T细胞从多发性硬化症患者更高Arrb1表达式(27)和mir - 326表达与多发性硬化患者的疾病严重程度高度相关(28]。

即使没有具体的研究βarr-1 / mir - 326 coregulation一直在多发性硬化进行我们的研究结果与上述观察允许推测βarr-1 / mir - 326转录单位监管其他干细胞或祖细胞在分化过程中,参与细胞命运的控制,发展,和疾病。

5。结论

我们描述在目前工作的作用和调控位点mir - 326 /βarr-1。mir - 326及其宿主基因βarr-1代表小说microrna /蛋白质网络控制小脑nsc通过地貌成因的信号的调制和细胞周期修饰符,都具备干细胞调节并建议参与维护nsc的自我更新特征。

总之,我们的研究结果描述一个二价的信号(microrna和托管蛋白质编码基因)融合的协同抑制正常干细胞功能。

信息披露

Federica Begalli中心目前的地址是细胞信号和炎症(测评中心),医学系,伦敦帝国理工学院。伊丽莎白Ferretti和埃维莉娜德国美诺公司co-last作者。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持由大学和研究、罗马和意大利航天局Sapienza大学(ASI)。

补充材料

补充图1:详细报告β-arrestin1监管序列:PCR分析CpG甲基化具体体现在浅蓝色。第一外显子是用蓝色表示。补充图2:(a) mir - 326水平在NSC mir - 326的异位表达。*P< 0.05。(b) Oncosphere成形试验(数量的殖民地,左面板)在NSC mir - 326的异位表达。*P< 0.05。(c)细胞生存能力(MTT试验)在NSC mir - 326的异位表达。*P< 0.05

  1. 补充材料