Optogenetic抑制纹状体神经元活动提高移植的神经干细胞和神经的生存结果在小鼠缺血性中风后

文摘

神经干细胞(NSC)移植是一种有前途的治疗方法来改善脑缺血后的复苏。然而,如何生存、增殖、迁移和分化的植入NSC受到内源性神经活动的影响尚不清楚。在这项工作中,我们使用optogenetic技术控制纹状体神经元的活动,调查他们的活动是如何影响nsc移植的存活和迁移和整个神经系统缺血性中风后的结果。nsc培养表达荧光蛋白转基因小鼠的移植到peri-infarct短暂性大脑中动脉闭塞后的纹状体区域(tMCAO)手术。纹状体神经元兴奋或抑制15分钟每天通过植入tMCAO后光纤。结果显示,老鼠接受NSC移植和optogenetic抑制较小的脑梗死体积,增加NSC迁移相比NSC单独或PBS组( )。相比之下,老鼠接受NSC移植和optogenetic激发显示没有区别梗死体积和神经行为改善PBS对照组相比。体外实验进一步表明,条件媒体兴奋gaba ergic神经元减少NSC可行性通过旁分泌机制。结论。Optogenetic抑制纹状体神经元活动进一步提高神经复苏NSC移植后亚急性脑缺血后阶段。

1。介绍

缺血性中风是脑血管疾病,会导致电机、感知、认知障碍甚至死亡。发展有效的治疗和康复策略目前缺血性中风仍然是一个挑战性的任务(1]。近年来,动物模型的研究表明,神经干细胞(NSC)移植的前景治疗中风(2- - - - - -5]。在脑缺血后的早期阶段,nsc移植可以激活内源性修复途径,参与免疫调节(6,7),血管生成(7- - - - - -9,神经发生9,10),和神经可塑性(11,12),主要通过旁分泌机制。在慢性阶段的中风,nsc移植可以替代丢失的神经元和集成到主机电路通过亲身体验与周围的宿主细胞,这可能导致长期的复苏(13- - - - - -15]。然而,干细胞的治疗效果是有限的,穷人的生存移植细胞(16]。先前的研究已经公布了各种外在的生存因素的影响包括生长因子,形态因子、蛋白聚糖、细胞因子、激素在卒中后的利基17在胚胎和成年nsc的生存和增殖。成人nsc也显示响应等多种神经递质谷氨酸、多巴胺、组胺,GABA, D-Serine,不,和5 -17]。动作电位可导致神经递质分泌,表明内在周围神经元的活动会影响生存,nsc移植的增殖和分化。然而,非常有限的数据可用关于内在神经活动如何影响的行为和命运nsc移植脑缺血后的病理条件下。

在这项研究中,我们使用optogenetic技术规范纹状体神经元活动后短暂性大脑中动脉闭塞(tMCAO)其次是NSC移植小鼠的调查是否令人兴奋或抑制纹状体神经元活动peri-infarct地区可以提高NSC移植的存活和迁移。

2。方法和材料

2.1。动物实验设计

动物实验程序制度动物保健和使用委员会批准的上海交通大学,上海,中国。成年雄性ICR小鼠被安置在specific-pathogen-free房间被保持在12小时在室温下光/暗周期大约25°C。腹腔内氯胺酮和甲苯噻嗪(100毫克/每公斤10毫克,σ,圣路易,密苏里州)是用于麻醉。本研究的动物实验设计是图所示1(一)。六十四只老鼠收到病毒注入,32老鼠用于兴奋性刺激实验,和其他人被用于抑制刺激实验。兴奋性或抑制性刺激实验,动物被随机分为四组,用来接收(1)PBS (PBS组);(2)PBS其次是激光刺激(PBS-E对于激发或抑制PBS-I组,分别地);(3)NSC移植(NSC组);和(4)NSC移植随后激光刺激(NSC-E或NSC-I组,分别地。)后60分钟tMCAO手术。PBS或NSC管理tMCAO手术后4天。光纤是植入在天6。激光刺激进行了从13天7天,每天15分钟。行为测试执行之前,tMCAO 3和tMCAO后14天。 Animals were sacrificed at day 14.

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

图1

实验设计和技术设置。(一)计划的动物实验研究。(b)代表ChR2-mCherry视蛋白的表达在纹状体神经元CaMKII启动子。(c)的示意图表示光纤化学传感实验室的结构。(d)的硬件系统同步激光刺激和电生理记录。(e)培养NSC-GFP球体的表征与NSC标记SOX2和巢蛋白免疫组织化学染色。酒吧= 100μm。

2.2。病毒转染

小鼠麻醉后,0.5微升腺相关病毒(AAV) (Obio技术,上海)携带ChR2-mCherry或ArchT-eGFP基因CaMKII启动子的控制下注入左侧纹状体(美联社= 0毫米,毫升=−2.5毫米,相对于前囱DV = 3毫米)使用一个微型真空泵(WPI,萨拉索塔,FL) 50问/分钟的速度。本研究中使用的效价AAV 4×10¹²你/毫升。完成注射后,针是保持大脑中的额外5分钟之前撤回。

2.3。短暂性大脑中动脉闭塞手术

两周后病毒注入,老鼠接受了60分钟tMCAO手术。tMCAO手术的协议描述了在前面的研究(18]。短暂,大脑中动脉(MCA)被一个6 - 0阻挡缝合(Covidien,曼斯菲尔德,MA)涂硅圆小费。在手术期间,小鼠体温维持在37±0.5°C使用加热垫(RWD生命科学)反馈控制。MCA的血流量是衡量激光多普勒监测(沼泽仪器,英国德文郡)MCAO之前,初闭塞和再灌注后1分钟。动物的MCA血流不减少10% ~ 20%的基线在闭塞或没有恢复到40% ~ 60%的基线再灌注后排除在本研究之外。

2.4。NSC文化、表征和移植

nsc的皮质隔绝E14灯头转基因小鼠(动物研究中心的南京大学、南京、中国)表达绿色荧光蛋白(GFP) beta-actin启动子的控制下或红色荧光蛋白(RFP) Tie2启动子的控制下,如前所述[19)和由DMEM / F-12介质(美国Gibco,卡尔斯巴德,CA) B27补充(Gibco)和生长因子(20 ng / ml表皮生长因子,20 ng / ml纤维母细胞生长因子2)(Gibco) 37°C下5%的股份有限公司₂的气氛。培养基被新的取代中每2天。NSC球体是每隔一周的通道。nsc用于实验获得文化接受3 - 5段。以培养nsc的特征,这些细胞被种植在poly-L-ornithine氢溴酸盐(σ,圣路易斯,密苏里州)和层粘连蛋白(σ)涂层玻璃盖玻片和应用巢蛋白(美国微孔,Billerica的)和SOX2 (Abcam、剑桥、马)。

NSC移植手术在tMCAO后4天。在移植之前,NSC球体与accutase孵化(Gibco) 20分钟分散成单个NSC。总共3×10⁵nsc溶解在10μl PBS注入左侧纹状体(美联社= 0毫米,毫升=−2.5毫米,相对于前囱DV = 3毫米)使用一个微型泵在1μl / min。完成注射后,针是保持大脑中的额外5分钟之前撤回。

2.5。光纤化学传感准备和在活的有机体内电生理学

光纤化学传感准备和植入进行如前所述[20.]。自制的光纤化学传感的结构如图1 (c)。组成的光纤化学传感是光纤,200μ0.22米直径和数值孔径(Thorlabs,牛顿,新泽西),8包围铂铱合金微电极与35μ米直径(Plexon,达拉斯,德克萨斯)。光纤化学传感是植入鼠标的左纹状体(美联社=−0.02毫米,毫升=−2.5毫米,相对于前囱DV = 2毫米)在3天后tMCAO在活的有机体内电生理学记录。光纤化学传感植入和在活的有机体内电生理学进行每组3只老鼠表达ChR2或ArchT纹状体,分别。电生理记录的数据同步电生理仪(Plexon,达拉斯,德克萨斯)纹状体神经元受到刺激时激光(图1 (d))。单一和复合的活动记录在30千赫和带通采样过滤在250赫兹到3000赫兹。不同激光功率条件下范围从0.001 mW 0.1 mW的波长473纳米的激光脉冲从0.1 mW ChR2组和2 mW 530海里常数激光ArchT组进行测试。在每个记录的开始,五分钟的基线记录,以确保稳定的电生理信号。所有记录都与动物进行麻醉。

2.6。光纤注入和激光刺激

所有的动物除了6小鼠体内电生理学进行了光纤tMCAO植入在6天后,后在前面描述的协议研究[20.]。激光刺激执行一次tMCAO后每天从7 - 13天。每个刺激会话持续了15分钟。激光的参数是由波形发生器控制(美国泰克、上海、中国)。ChR2组,每5秒钟刺激周期由秒刺激阶段,4秒休息阶段。在刺激阶段,与5 ms 473 nm激光脉冲脉宽管理在20 Hz。ArchT集团波长530纳米的激光是管理持续15分钟。激光的权力也是0.05 mW波长473纳米的激光脉冲和1兆瓦530 nm激光,由一个光功率计测量(Thorlabs)。

2.7。神经行为测试和脑梗塞的评估

修改神经严重程度评分(NSS)比例从0到14 (21)是用于评估损伤引起的缺血性侮辱和NSC移植后经济复苏和激光刺激。此外,梁行走测试是用来评估神经功能恢复。tMCAO手术前,动物被训练连续3天每天两次通过梁的长度1米建立基线。NSS和梁测试的评估进行了三点,tMCAO后14天。数据收集了三个独立的实验,平均时间是用于统计分析。

动物被tMCAO牺牲在14天后。与生理盐水灌注小鼠transcardially第一,然后刚做好的4%多聚甲醛在PBS深与10%水合氯醛麻醉(350毫克/公斤)。大脑被很快删除成异戊烷在−80°C,然后冷冻分为20μ片。对于每一个大脑,五冠部分相距2毫米用于量化梗塞体积。的部分沾0.1%甲酚紫(σ)在室温下10分钟紧随其后的是温柔的用水冲洗1小时。染色后的部分使用数码相机成像,并使用NIH ImageJ梗塞体积计算软件(如前所述)(22]。卷被评估为下面的公式:

的公式,h代表两个相邻区域之间的距离和Sn和Sn + 1是两个相邻的梗塞区域部分。梗塞率等于同侧大脑梗塞体积除以体积相同的冠状平面。

2.8。荧光免疫组织化学染色和量化

大脑部分或细胞生长在玻璃盖玻片为10分钟,用4%多聚甲醛Triton-PBS 30分钟0.3%,和5%正常驴血清60分钟,其次是孵化与抗体在一夜之间4°C。NSC表征细胞培养后,巢蛋白和SOX2抗体被用于double-staining,无论是稀释1:200。血管密度测量、CD31抗体(研发系统、明尼阿波利斯、MN)是用于稀释1:200。与PBS彻底冲洗后,样本孵化与二次抗体(表达载体,卡尔斯巴德,CA)的稀释1:500 60分钟和DAPI(英杰公司)在室温下5分钟。显微照片拍摄用共焦显微镜(徕卡,德国索姆)40 x物镜。ImageJ荧光信号计算软件。二进制转换后的显微照片,像素的亮度超过阈值被数的比例来计算每个显微照片上荧光信号。数据规范化的对照组。测量nsc的生存和迁移、图片三针通道周围地区的大脑切片/动物收集和量化产量平均荧光区域。评估当地的血管密度,peri-infarct区域周围的三个字段选择从每个大脑切片,和四个大脑切片从每个鼠标被量化产量平均血管密度为每一个动物。

2.9。细胞凋亡的评估

细胞凋亡在peri-infarct地区,NSC移植,被TUNEL-DAB检测方法使用ApopTag过氧化物酶原位细胞凋亡检测设备(微孔,贝德福德,MA)。TUNEL-DAB染色后,部分与苏木精复染色(Biyuntian公司中国上海)。周围的区域在纹状体注射跟踪成像在20 x物镜。DAB-positive细胞每个显微照片数和平均6每个动物的大脑部分。

2.10。主要神经文化

初级皮层的神经元文化准备GAD2-ChR2-tdTomato转基因小鼠在胚胎15天。皮质很快被隔离在冰冷的钙和magnesium-free汉克斯平衡盐溶液(hbs)后用0.05%胰蛋白酶消化(Gibco) 10分钟。3 PBS漂洗后,细胞数和镀上poly-d-lysine-coated 6-well板块在3×10⁶每在神经基础培养基(Gibco)补充2% B27 (Gibco), 0.3毫米谷酰胺(σ),和1%的青霉素链霉素。在细胞镀后4天,15μg / ml 5-fluoro-2脱氧尿苷(σ)和35μ克/毫升尿苷(σ)被添加到文化抑制nonneuronal细胞增殖。一半的介质取代新鲜培养基每4天。神经元用于激光刺激的实验在8到10天的培养。

2.11。条件培养基生成和NSC可行性评估

之前optogenetically刺激神经元,媒介被暂时被用于NSC文化所取代。刺激使用波长473纳米的激光在20赫兹脉冲与脉冲宽度为5 ms和0.05兆瓦的电力,5分钟。媒介刺激后立即被收集。标准培养NSC球体被分散成单个细胞使用镀accutase和新井和孵化条件培养基从神经元兴奋gaba ergic 2天。培养介质取代每天新鲜条件培养基。

NSC体外的生存能力是由CCK-8工具包(Donjindo、熊本、日本)。nsc,培养条件媒体光刺激或nonstimulated gaba ergic神经元,镀在96孔板1×10⁶细胞/毫升。10微升CCK-8的解决方案是添加到每个好,孵化2或12小时37°C。吸收数据获得使用标(Synergy2 BioTek, Winooski, VT)在450海里。

2.12。实时聚合酶链反应(PCR)分析

总RNA从NSC或神经元是由RNA-TRIZOL提取(Gibco,宏伟的岛,纽约)。RNA浓度是由光谱方法(nd - 3300, NanoDrop技术,美国)。反转录的RNA通过一个通用的互补脱氧核糖核酸进行互补脱氧核糖核酸合成装备(EXIQON、Vedbaek、丹麦)。放大是由一个快速实时PCR系统(7900 HT, ABI,促进城市,CA)使用SYBR绿色主人混合(EXQION)。引物的序列β肌动蛋白、神经生长因子和GDNF从PrimerBank获得。循环条件是95°C 10分钟紧随其后40 95°C的周期为1分钟10秒和60°C。神经生长因子的相对表达水平和GDNF是标准化的β肌动蛋白控制使用2 -一式三份,并计算Δct方法。

2.13。统计分析

所有的结果意味着±SD。数据分析了双向(行为只测试)或单向(其他分析)方差分析后跟Bonferroni事后比较使用GraphPad Prism 3.05版本(GraphPad软件公司,拉霍亚,CA)。被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。验证Optogenetic纹状体神经元活动的控制

CaMKII子已经被证明能够驱动基因表达在大多数纹状体神经元(20.]。先前的研究结果一致,在这项研究中,AAV-carrying视蛋白基因CaMKII启动子的控制下成功转染大多数纹状体神经元在14天后病毒注入(图1 (b))。

体内电生理学数据显示optogenetic激发或抑制的效率取决于激光的力量。0.05 mW波长473纳米的激光脉冲足以稳定触发动作电位在纹状体神经元表达ChR2(图2(一个))。纹状体神经元表达ArchT,管理530 nm常数激光功率大于1 mW消除大多数的自发动作电位(图2 (b))。自发动作电位立即重新出现在波长530纳米的激光刺激(图的结论2 (c))。这些结果证明了成功的光纹状体神经元活动的控制。

(一)

(b)

(c)

图2

激光刺激的验证效率和激光功率的优化基于电生理记录在小鼠纹状体注射病毒后21天。(一)兴奋性刺激与波长473纳米的激光脉冲在纹状体区表达ChR2。(b)抑制刺激与530 nm常数表达式ArchT激光在纹状体区域。(c)不间断刺激1 mW波长530纳米的激光15分钟并不影响当地的自发动作电位刺激后完成。

3.2。纹状体神经元活动的抑制移植后NSC tMCAO后进一步降低脑梗塞体积

每组脑梗死体积的比率在14天后tMCAO衡量甲酚紫染色(数字3(一个),3 (c),4(一),4 (c))图像量化紧随其后。在抑制实验的设置,NSC组和NSC-I组显示脑梗死体积的比率明显较小,相比PBS控制(NSC = 6.3±0.8%和PBS = 8.6±1.4%, ;NSC-I = 4.5±0.7%和PBS = 8.6±1.4%, , )。NSC-I组显示小得多的脑梗死体积相比NSC集团(NSC-I = 4.5±0.7% NSC = 6.3±0.8%, , ),但是PBS-I集团与PBS组无统计学差异(PBS-I = 8.1±1.6%和PBS = 8.6±1.4%, , )。NSC集团的设置激发实验显示脑梗死体积的比率明显较小,PBS控制相比,PBS-E集团和NSC-E集团(NSC = 5.4±1.1%和PBS = 7.9±1.8%, ;NSC = 5.4±1.1% PBS-E = 8.3±2.1%, ;和NSC = 5.4±1.1% NSC-E = 7.8±1.4%, , )。NSC-E组显示与PBS组无统计学差异。这些结果表明,抑制纹状体神经元活动可以进一步加强NSC移植的有益作用,而激发的纹状体神经元活动取消NSC的有益作用在降低脑梗塞。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

图3

纹状体神经元活动的抑制增强NSC移植的存活和迁移,进一步减少了脑梗塞体积。(一)甲苯基紫染色脑梗死的tMCAO后14天。在纹状体(b)的荧光NSC-RFP tMCAO在14天后,酒吧= 100μm。(c)梗塞体积对侧半球体积的比值(PBS = 8.6±1.4%, PBS-I = 8.1±1.6%, NSC = 6.3±0.8%,和NSC-I = 4.5±0.7%,)。(d)荧光信号的量化NSC移植(NSC = 1.00±0.17, NSC-I = 1.29±0.18,)。(e)行为结果评价NSS方法在3天(PBS = 5.9±0.6, PBS-I = 5.7±0.4, NSC = 6.1±0.4,和NSC-I = 5.9±0.5,)和14天(PBS = 5.5±0.9, PBS-I = 5.1±0.8, NSC = 4.0±0.9,和NSC-I = 3.3±1.0,tMCAO后)。代表。

(一)

(b)

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(e)

图4

纹状体神经元的激发NSC移植后逆转NSC在减少脑梗死的有利影响。(一)脑梗死tMCAO后14天。在纹状体(b)的荧光NSC-GFP tMCAO在14天后,酒吧= 100μm。(c)梗塞体积对侧半球体积的比值(PBS = 7.9±1.8%, PBS-E = 8.3±2.1%, NSC = 5.4±1.1%,和NSC-E = 7.8±1.4%,)。(d)荧光信号的量化NSC移植(NSC = 1.00±0.23, NSC-E = 0.64±0.16,由NSS) (e)行为结果评价方法在3天(PBS = 5.7±0.6, PBS-E = 5.7±0.4, NSC = 5.6±0.5,和NSC-E = 5.6±0.6,)和14天(PBS = 4.8±0.8, PBS-E = 5.1±0.8, NSC = 3.4±1.0,和NSC-E = 4.9±0.7,tMCAO后)。代表。

3.3。纹状体神经元活动的激发逆转的有益作用NSC移植tMCAO后在促进神经功能恢复

神经功能评估使用神经严重程度评分在3和之前报道tMCAO后14天(数字3 (e)和4 (e))。在tMCAO后3天,任意两组之间没有统计学差异。tMCAO在14天后,在抑制实验的设置,NSC组和NSC-I组显示显著降低NSS评分相比PBS控制(NSC = 4.0±0.9和PBS = 5.5±0.9, ;NSC-I = 3.3±1.0和PBS = 5.5±0.9, , )。NSC-I组显示NSC组无统计学差异。NSC集团的设置激发实验显示显著降低严重程度得分PBS控制相比,PBS-E集团和NSC-E集团(NSC = 3.4±1.0和PBS = 4.8±0.8, ;NSC = 3.4±1.0与PBS-E = 5.1±0.8, ;NSC = 3.4±1.0和NSC-E = 4.9±0.7, , )。NSC-E组显示与PBS组无统计学差异。梁行走测试的数据在14天后tMCAO表明NSC-I集团是快15.1%平均通过梁相比,NSC集团(NSC-I = 4.8±0.9, NSC = 5.9±1.4),但NSC-E集团花了更多的时间平均20.1%完成任务相比,NSC集团(NSC-E = 7.2±1.7, NSC = 5.9±1.4)(补充图1网上https://doi.org/10.1155/2017/4364302)。这些结果表明,纹状体神经元活动的激发逆转的有益作用NSC移植tMCAO后在促进神经功能恢复。

3.4。纹状体神经元活动减少了细胞凋亡的抑制和增强NSC移植的迁移

nsc移植也来源于GFP转基因小鼠和RFP的染色标记巢蛋白和SOX2移植前(图1 (e))。迁移的NSC移植laser-stimulated组和nonstimulated组之间的比较,确定fluorescence-positive大脑细胞的扩散部分(数据3 (b),3 (d),4 (b),4 (d))。NSC-I集团设定的抑制实验显示明显增大荧光区域相比,NSC集团(NSC-I = 1.29±0.18与NSC = 1.00±0.17, , )。相比之下,在激发实验的设置,NSC-E集团相比小得多的荧光区域NSC集团(NSC-E = 0.64±0.16与NSC = 1.00±0.23, , )。凋亡细胞的数量在针之间的路径比较laser-stimulated组和nonstimulated组后TUNEL-DAB染色(图5)。NSC-I组TUNEL-positive细胞/字段显示显著低于NSC-E集团和NSC集团(NSC-I = 27.7±5.1与NSC-E = 38.5±6.2, ;NSC-I = 27.7±5.1与NSC = 40.5±6.6, , )。这些结果表明,抑制而不是激励的纹状体神经元活动可以减少细胞凋亡,增强移植NSC迁移。

图5

纹状体神经元活动的影响细胞凋亡在移植网站。(一)DAB-TUNEL和苏木精染色。高细胞密度在纹状体的区域是NSC移植网站。红色矩形显示字段选择量化凋亡细胞数量。(b)的量化结果在每组凋亡细胞数(NSC = 40.5±6.6, NSC-E = 38.5±6.2,和NSC-I = 27.7±5.1,)。(c)凋亡细胞NSC移植网站。棕色的信号由红色箭头表示是凋亡细胞。酒吧= 20μm。代表。

3.5。纹状体神经元活动的抑制,进一步增加了在半影NSC移植后血管密度

检查是否改善生存和移植NSC迁移导致了更好的结果后tMCAO通过阻止血管损伤或促进血管修复,我们检查了大脑部分的血管密度CD31染色(图6)。三个显微照片拍摄在半影区在每个大脑切片血管密度的量化。NSC组和NSC-I组显示血管密度明显高于PBS组相比(NSC = 1.67±0.28和PBS = 1.00±0.21, ;NSC-I = 2.10±0.26和PBS = 1.00±0.21, , )。此外,血管密度的半影区NSC-I组高于NSC组(NSC-I = 2.10±0.26与NSC = 1.67±0.28, , )。相比之下,NSC-E组表现出减少血管密度相比,NSC集团(NSC-I = 2.10±0.26与NSC = 1.67±0.28, , )。NSC-E集团相比PBS组显示平均血管密度稍高,但两组之间的差异不显著(NSC-E = 1.27±0.22和PBS = 1.00±0.21, , )。这个结果显示相关性增强NSC移植生存/迁移和血管密度增加NSC-I组和暗示带来的更好的结果在tMCAO抑制纹状体神经元活动NSC移植后与更高的血管密度有关。

(一)

(b)

(c)

图6

纹状体神经元活动的影响在半影NSC移植后血管密度。(a)在半影检查血管密度和CD31染色,酒吧= 50μm。(b)选定字段成像评估(红色矩形)。浅色区域代表脑梗塞。(c)的定量结果血管密度(PBS = 1.00±0.21, NSC = 1.67±0.28, NSC-E = 1.27±0.22,和NSC-I = 2.10±0.26,)。代表。代表。

3.6。gaba ergic神经元活动的激励减少NSC可行性通过旁分泌机制在细胞培养

探讨纹状体神经元活动是否会影响移植的生存安全委员会通过旁分泌机制,我们从GAD2-ChR2-tdTomato转基因小鼠神经元培养,通过波长473纳米的激光脉冲刺激神经元,收集条件培养基,利用介质孵化培养出谋划策在体外(图7)。对照组中从如果神经元用于NSC文化。NSC被CCK-8检查方法的可行性。NSC被laser-activated-neuron-conditioned介质表现出更少的生存能力在2小时(敌人= 0.94±0.02与反对= 1.00±0.03, , )和12小时(敌人= 0.88±0.02与反对= 1.00±0.01, , 孵化后)相比,控制(敌人= 0.94±0.02与反对= 1.00±0.03, , )。为了进一步确定NSC的地位,NSC孵化laser-activated-neuron-conditioned介质或unstimulated-neuron-conditioned中被用于神经生长因子和GDNF mRNA量化。这两个因素可能导致NSC的生存。数据显示NSC被laser-activated-neuron-conditioned媒介表达显著降低神经生长因子(敌人= 0.37±0.06与反对= 1.00±0.15, , )和GDNF(敌人= 0.54±0.10与反对= 1.00±0.07, , )的mRNA水平。这些结果表明,激的gaba ergic neuorns可以诱导分泌的物质,在体外抑制NSC可行性,并暗示纹状体神经元活动可能会影响通过旁分泌机制NSC移植的生存。

(一)

(b)

(c)

(d)

图7

激发的gaba ergic神经元释放的因素可以减少NSC可行性在体外。(一)的示意图表示在体外实验。蓝色箭头表示波长473纳米的激光脉冲的刺激。(b)的可行性NSC,由CCK-8试验2小时(Con = 1.00±0.03,机枪兵= 0.94±0.02,)和12小时(Con = 1.00±0.01,机枪兵= 0.88±0.02,后孵化条件培养基。(c)的相对mRNA表达神经生长因子(Con = 1.00±0.15,机枪兵= 0.37±0.06,)。(d)的相对mRNA表达GDNF (Con = 1.00±0.07,机枪兵= 0.54±0.10,)。代表。代表。

4所示。讨论

据报道,nsc移植,单独或结合其他祖/干细胞,可以改善缺血性中风后功能恢复(9,23,24]。然而,如何生存、增殖、迁移和分化的植入NSC受到内源性神经活动的影响尚不清楚。在这项研究中,我们使用optogenetic技术探讨纹状体神经元的活动之间的关系和缺血性中风后移植nsc的生存。虽然CaMKII是传统上认为是一个特定的启动子在大脑皮层兴奋性神经元,它已被证明,CaMKII可以作为forebrain-neuron-specific在纹状体启动子驱动抑制性神经元的基因表达25]。这项工作的结果表明,抑制纹状体神经元活动改善了nsc移植的存活和迁移,进一步减少了脑梗塞体积在短暂性脑缺血中风后14天。相比之下,激活纹状体神经元活动逆转nsc移植的有益作用在降低脑梗塞体积,促进功能恢复。研究神经元的活动如何影响nsc移植的可行性,我们培养的初级神经元从GAD2-ChR2-tdTomato转基因小鼠和治疗nsc laser-activated-neuron-conditioned或unstimulated-neuron-conditioned媒介(CM)。结果表明,CM激活神经元减少神经生长因子的表达和GDNF在nsc。报告显示,神经生长因子和GDNF扮演重要角色在支持的亚种群的神经元(26- - - - - -29日]。这可能是一个潜在的原因激活纹状体神经元可以减少nsc移植的生存。使用的初级神经元在体外本研究的实验是培养的皮层由大约20% gaba ergic神经元(30.]。opsin-specific刺激的激光会因此激活神经元的文化的约20%。然而,我们观察到laser-excited组和对照组之间的差异。更显著的差异可能与纯gaba ergic观察神经元的文化。

研究表明,外源性干细胞可以促进缺血性中风后功能恢复和其他神经系统疾病(24,31日- - - - - -34]。然而,一个不争的事实是,大部分的外源性干细胞移植会死细胞移植后在很短的时间内(16]。我们的研究表明,抑制纹状体神经元可以促进nsc移植缺血后的生存提供一个新的视野进一步增强nsc的有益作用。

5。结论

NSC移植改善缺血性脑损伤后的神经恢复。内在神经活动影响nsc移植的迁移和生存。Optogenetic抑制纹状体脑缺血后神经元活动在亚急性阶段进一步增强NSC移植的有利影响,同时激活纹状体神经元的废除NSC治疗的好处。

的利益冲突

作者声明没有潜在的利益冲突的研究,本文的作者,和/或出版。

作者的贡献

江一帆Lu和陆的概念和设计,提供研究材料,收集和/或装配的数据,数据分析和解释,手稿写作。瞿Meijie Wanlu Li)耶歌,本期他,市志张并提供学习材料和数据的收集和装配。Yongting王、杨Guo-Yuan概念和设计,金融支持,行政支持,提供研究材料,数据分析和解释,手稿写作。江一帆Lu和陆的贡献同样这项工作。所有作者修正和批准了手稿。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金委项目81371305 (Yongting王),81522015 (Yongting王),81471178(杨Guo-Yuan), 81501014(本期他)。

补充材料

补充图1。所花费的时间鼠标通过梁在梁行走测试。没有观察到显著差异在四组前3天tMCAO (PBS⁼2.9±0。7,NSC⁼2.9±0。3,NSC-E⁼2.8±0.2, NSC-I⁼3.0±0。4, $n ⁼ 6$ ),3天后tMCAO (PBS⁼9.6±2.3, NSC⁼10.4±2.1, NSC-E⁼9.2±1.9, NSC-I⁼9.8±1.7, $n ⁼ 6$ )。在14天,NSC-I集团通过了梁显著高于PBS对照组(NSC-I⁼4.8±0。9和PBS⁼7.7±1.8, $n ⁼ 6$ )。虽然不显著,NSC-Igroupspend15.1%更少的时间比NSC集团(NSC-I⁼4.8±0。9日,NSC⁼5.9±1.4, $n ⁼ 6$ ),NSC-E集团花20.1%时间超过NSC集团(NSC-E⁼7.2±1.7, NSC⁼5.9±1.4, $n ⁼ 6$ )。 $^{*}$ 代表 $p < 0.05$ 。

补充材料

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干细胞国际

脑损伤和干细胞替换

Optogenetic抑制纹状体神经元活动提高移植的神经干细胞和神经的生存结果在小鼠缺血性中风后

文摘

1。介绍

2。方法和材料

2.1。动物实验设计

2.2。病毒转染

2.3。短暂性大脑中动脉闭塞手术

2.4。NSC文化、表征和移植

2.5。光纤化学传感准备和在活的有机体内电生理学

2.6。光纤注入和激光刺激

2.7。神经行为测试和脑梗塞的评估

2.8。荧光免疫组织化学染色和量化

2.9。细胞凋亡的评估

2.10。主要神经文化

2.11。条件培养基生成和NSC可行性评估

2.12。实时聚合酶链反应(PCR)分析

2.13。统计分析

3所示。结果

3.1。验证Optogenetic纹状体神经元活动的控制

3.2。纹状体神经元活动的抑制移植后NSC tMCAO后进一步降低脑梗塞体积

3.3。纹状体神经元活动的激发逆转的有益作用NSC移植tMCAO后在促进神经功能恢复

3.4。纹状体神经元活动减少了细胞凋亡的抑制和增强NSC移植的迁移

3.5。纹状体神经元活动的抑制,进一步增加了在半影NSC移植后血管密度

3.6。gaba ergic神经元活动的激励减少NSC可行性通过旁分泌机制在细胞培养

4所示。讨论

5。结论

的利益冲突

作者的贡献

确认

补充材料

引用

版权

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