文摘

间充质干细胞(msc)是孤立和特点从产后牛子宫内膜与亚临床的动物( )和临床子宫内膜炎( )和健康的产后女性( )。细胞分离msc的形态特征,并进行了成骨,显示chondrogenic,去感应(健康和亚临床)。细胞从奶牛临床子宫内膜炎没有经历去。所有的细胞都表达了对选定的MSC标记的mrna。子宫内膜msc与铂族元素挑战体外₂在浓度为0,1,3,10μM,其全球转录组剖面进行了研究。总的来说,1127个基因表达有差异与铂族元素挑战细胞间和细胞治疗₂浓度(763——364年下调,褶皱变化> 2,和 )。最的铂族元素影响的途径₂挑战是免疫反应、血管生成和细胞增殖。总之,我们表明,健康牛子宫内膜含有msc和产后子宫内膜炎修改和限制这些细胞的一些功能特性,如继续脂肪形成的分化的能力。同时,铂族元素₂,子宫内膜炎的炎症介质,修改转录组子宫内膜msc。类似的情况可能发生在炎症与子宫内膜炎有关,因此影响子宫内膜msc的主要属性。

1。介绍

在女性生殖寿命,牛子宫内膜周期性地进行形态学和功能的修改(1]。这些是伴随着基因表达模式的差异参与子宫内膜重建,血管生成的监管,监管的侵入性增长,细胞粘附和胚胎喂养2]。高和连续细胞再生的子宫内膜已归因于居民祖/干细胞的存在子宫,维持细胞生产和迅速恢复必要的组织内稳态支持妊娠(3]。建议这些细胞也可能促进子宫内膜的再生,分娩后立即发生(4]。产后的一个主要时期的改造,维修,子宫和子宫内膜再生,导致快速退化从8天43产后在牛5]。这种退化可能影响子宫的博览会中的多个经常观察到的细菌病原体产后,可以产生巨大破坏子宫内膜组织(6]。

致病菌影响90年奶牛分娩后的100%。他们是相对迅速消除在大多数情况下(约70%);然而,持续的炎症反应发生在剩下的30% (7,8]。子宫内膜炎是子宫内膜的炎症和归类为亚临床和临床,经常导致不育由于组织损伤和破坏卵巢周期性活动(9]。

产后子宫包括免疫和炎症局部的炎症反应包括分子数;不恰当的职业和抗炎细胞因子之间的平衡决定了连续性、持续时间、和炎性疾病的发病7]。前列腺素E2(铂族元素₂)中起关键作用的各个方面炎症反应通过调节生产各种白细胞介素(ILs)和肿瘤坏死因子-α(TNF -α),引发了强有力的抗免疫特性,导致急性炎症的决议,组织再生,恢复体内平衡10]。从奶牛子宫内膜细胞临床子宫内膜炎已经发现分泌显著较高的铂族元素₂相比健康的子宫内膜和亚临床子宫内膜炎组;与亚临床奶牛子宫内膜炎、说水平更高的组织诊断为> 18%的变形核细胞(中性粒细胞)比组> 5%的中性粒细胞(11]。建议铂族元素₂子宫液的浓度与子宫内膜炎和子宫内毒素浓度程度,诱导和激活这个分子通过COX2的具体生产(12]。类似于许多其他介质的细胞反应,铂族元素₂是多功能的,并可能发挥作用在提高自导,生存和增殖的间充质干细胞(msc) [13]。

msc存在子宫内膜的几个物种,包括人类,老鼠、猪、和反刍动物14- - - - - -18]。我们组能够隔离并描述这些牛子宫内膜细胞第一次发情周期的所有阶段健康牛子宫内膜(19,20.]。考虑到铂族元素的至关重要的作用₂在MSC endometritis-mediated炎症以及救援如前所述,MSC的存在在健康奶牛的子宫内膜,我们假设的假设子宫病理炎症如子宫内膜炎会影响子宫内膜MSC的存在和功能。本研究旨在探讨msc在产后牛子宫内膜,在健康奶牛和亚临床和临床子宫内膜炎,以及评估他们的基本内在生物属性。我们假设铂族元素₂可能发挥关键作用的激活和招聘的MSC在这些奶牛的子宫内膜和/或健康的奶牛。评估这个问题,我们首先研究和特征公认的msc在健康endometritis-ill奶牛产后子宫内膜。在第二组实验中,牛子宫内膜msc先前孤立和与不同的铂族元素建立了实验室的挑战₂浓度。随后,他们的转录组变化进行了研究,以分析实际的铂族元素的作用₂在子宫内膜MSC生物学在牛的动物模型。

2。材料和方法

所有实验过程涉及动物处理和/或抽样大学生物伦理学委员会批准的康塞普西翁,智利,批准文号ce - 6 - 2010,按照规定进行了动物福利的兽医学相同的大学的教员。

2.1。实验1:隔离和表征的假定的msc产后牛子宫内膜

所有未指明的试剂都是来自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。

2.1.1。子宫样品

子宫内膜活检收集20至60天从荷斯坦奶牛产后生产群和产后健康的子宫内膜炎(PPHE, ),亚临床(PPSE )和临床(PPCE 子宫内膜炎。牛是3至6岁。样本的分类是基于一个兽医临床检查子宫内膜和细胞学分析确定中性粒细胞的百分比,勒布朗的标准等。21和谢耳朵等。22]。

2.1.2。细胞隔离

组织样本与无菌1毫克/毫升胶原酶消化I型磷酸盐(PBS)解决方案2 h在37°C和在550 g离心10分钟。细胞被播种在0.5×10⁵细胞/毫升密度标准媒介DMEM-F12 10%胎牛血清(FCS)补充1% antibiotic-antimycotic (AAM)解决方案,1毫米丙酮酸钠,2毫米谷酰胺,并培养公司5%₂39°C,湿度100%。区分上皮细胞和基质细胞,上层被大约18人力资源第一次播种后然后以同样的方式。媒介是改变每2 - 3天,直到细胞达到融合。

2.1.3。集落形成

细胞被播种在60毫米板30细胞/厘米²密度在同一环境和介质条件的主要细胞培养,改变介质每15天。实验进行了一式三份的细胞系。板块在显微镜下检查,确保每一个殖民地起源于单个细胞。1个月后,殖民地和2%多聚甲醛固定(PFA)和染色和染色允许克隆可视化。殖民地包含20多细胞数。评估细胞的能力,形成殖民地或克隆效率(CE),使用下面的公式:(克隆细胞的数量/接种细胞的数量)×100%3]。殖民地与碱性磷酸酶染色(美联社)根据协议(向量®红底物;美国向量实验室,伯林盖姆,CA)与一个积极的AP染色,以一个红色的颜色和数字倒置显微镜观察到荧光evo FL(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)。

2.1.4。细胞增殖

细胞被播种在60毫米板一式三份2000细胞/厘米²密度和相同的环境和介质条件下培养的主要细胞培养。细胞倍增时间(CDT)使用以下公式计算:CD = ln (Nf / Ni) / ln 2 Nf是最后和倪最初的细胞的数量和DT = CT / CD, DT是CDT和CD细胞数量翻倍,CT是细胞培养时间(23]。

2.1.5节讨论。在体外分化为中胚层衍生品

细胞通过3被播种在4×10⁴细胞/ /在six-well菜一式三份,直到他们达到90%汇合,然后改为分化培养基(DM)。分化媒体是基于DMEM低葡萄糖10% FCS和补充诱导分化成chondrogenic血统(CL)、100 nM地塞米松(敏捷),35μ1 g / ml维生素C、x胰岛素硒转铁蛋白(它的),和成骨的行数(OL)为50.9μM敏捷,10毫米β甘油磷酸盐、0.1毫米维生素C和脂肪形成的行数(AL) 1μ敏捷,22μ克/毫升1 x, 0.25毫米3-isobutyl-1methylxanthine (3-IBM),和100毫米indometacin。控制time-mated细胞在DMEM培养低葡萄糖+ 10% FCS,没有诱导物完全相同的时间段的实验小组。在所有情况下,媒体改变了每3天。天0、7、14日,细胞被固定为2% PFA和阿尔新蓝染色CL,茜素红的OL,红色和石油基地检测粘多糖的表达,钙沉积,分别或脂质空泡。

2.1.6。定量实时聚合酶链反应(RT-qPCR)

在上述时间点,使用Tri-reagent从细胞中提取的总RNA提取根据制造商的指示。RNA的数量测量使用一个时代分光光度计系统(Biotek,坏Friedrichshall,德国)。互补脱氧核糖核酸从200个转录μ克的总RNA根据制造商的指示商业M-MLV逆转录酶(RT)(表达载体)。基因表达的分析是由实时PCR通过标准曲线方法的使用SYBR绿色MX3000P实时PCR设备上(美国安捷伦,圣克拉拉,CA)。在所有qPCRs, beta-actin (ACTB)作为内部控制。

只有PCR实验效率90 - 110%的范围内,至少0.97的相关系数被用于基因表达分析。样本运行在一式三份。qPCR执行与引物序列显示在表中1。

2.1.7。数据分析

统计分析定量实时pcr、克隆细胞和扩散进行了分析使用一个非参数检验(Kruskal沃利斯)和数据表示为±错误。所有统计分析检测 。

2.2。实验2:基因表达与铂族元素牛子宫内膜假定的msc的挑战₂

所有试剂否则来自热费希尔表示,智利圣地亚哥,智利。

2.2.1。细胞系

假定的msc的主要文化从健康循环使用牛在黄体期后期(LLP1 LLP4;(19])。细胞被播种在40000 /厘米²在12-well文化菜肴和维护和培养标准中、在同等条件下在第一个实验中。细胞被允许达到90% confluency并进一步用于启动实验。

2.2.2。启动与铂族元素₂

媒介从井中删除,这些细胞被洗了三次在温暖的PBS,和2毫升的媒体包含三种不同浓度的铂族元素₂添加每一式三份。的铂族元素₂(开曼化学,安阿伯市密歇根,美国)在DMSO溶液稀释(pH值6.8避免铂族元素₂退化),和最终的浓度是1,3,10μm .消极的控制,从同源细胞使用一式三份同样的文化条件下但不与铂族元素₂。28小时后,上层的收集和冷冻−80°C,以供将来使用,细胞被取消和受到RNA提取进行进一步处理。

2.2.3。互补的RNA的RNA提取和合成

总RNA是孤立和量化(如前所述)(实验1)。RNA数量完整性(RIN)确定使用TapeStation 2200系统(安捷伦科技©,圣克拉拉,CA,美国)。只有样品RIN > 8.5选择进行分析。RNA激增工具包(安捷伦科技©,圣克拉拉,CA,美国)作为外部控制。峰值与cyanine-3混合用于标签的样品(影射和次级细胞),和斯派克B混合cyanine-5用于标签(牛纤维母细胞RNA)的引用。安捷伦低输入快速Amp标签工具包(安捷伦科技©,圣克拉拉,CA,美国)是用于生成互补的RNA (cRNA)示例输入100 ng总RNA。cRNAs被纯化使用EZNA总RNA装备我根据制造商的指示和量化使用时代分光光度计系统(Biotek©,坏Friedrichshall,德国)。cRNA,池的三个复制的每个三个剂量和次级细胞。

2.2.4。微阵列杂交、清洗和扫描

牛(V2)基因表达微阵列4×44(美国安捷伦科技)是用于差异基因表达分析。杂交混合物准备使用Hi-RPM基因表达杂交工具包(美国安捷伦科技)。根据安捷伦协议,4×44 K芯片,825使用的每个cRNAs ng。Cy-3和Cy-5-labeled cRNA样本喜忧参半,杂化,添加到阵列幻灯片。幻灯片室是组装和放置在一个烤肉店杂交炉和旋转10转65°C 17小时。数组幻灯片使用基因表达洗清洗缓冲设备。洗后,幻灯片进行扫描使用安捷伦SureScan芯片扫描仪的设置建议4×44 K数组格式。后获得的图像扫描分析了使用安捷伦v.10.5.1.1特征提取软件。

2.2.5。微阵列数据分析

获得的数据进行了分析使用GeneSpring 12.5提取软件(美国安捷伦科技),以确定哪些基因实验组之间差异表达与控制次级细胞。决心是差异表达基因是否有大于2倍。差别upregulation或对这些变化统计分析进行了使用一个未配对t以及,褶皱变化的截止值大于2值0.05被认为是表示一个统计上的显著差异。

2.2.6款。基因本体论(去)和交互网络差异表达基因的分析

基因本体论和途径进行了分析使用豹软件11.1(美国南加州大学)。同时分析基于差异表达基因列表与褶皱变化大于2.0。去分析,纠正截止使用值为0.58(最小值来检测计算)。路径分析是基于WikiPathways数据库。豹软件能够检测潜在的选择的基因之间的联系和对他们进行分类价值观和匹配的实体的数量每通道。总数量的显著差异表达基因与褶皱变化大于或等于2.0,GeneMania预测的基因相互作用网络创建服务器(24]。

2.2.7。微阵列中存在分析验证

验证微阵列数据,选定的基因的表达谱分析了使用中存在。为此,13个基因选择,十间差异表达两组(四个调节(UQCRB、ADA、F3, BPGM), 6个表达下调(流化床、SLC35A5 SCRN1, IGFBP3, LOC781494,和TFPI2]),和三个同样表达了(BAX2, COX2和il - 1)。1 U的纯化rna治疗RNAse-free DNase我基因组DNA消化(美国Carlsbead表达载体,CA) 10μl反应30分钟37°C。酶是热灭活(10分钟65°C)的25毫米EDTA (1μl),信使rna是转化为互补DNA并保持冻结在20°C到使用PCR实验。是由基因表达分析中存在使用∆∆Ct方法。存在,样本加载重复(技术复制)。使用的引物,为每个基因PCR条件被添加在表中1。在所有的存在,B-actin用作看家基因。

2.2.8。统计分析中存在的

这是使用Wilcoxon执行非参数测试。微阵列进行了验证和关联中存在运用皮尔逊相关的测试,与log2比率的意思。在所有情况下,显著差异被认为是如果值小于0.05。InfoStat布宜诺斯艾利斯(阿根廷)软件使用。

3所示。结果

3.1。实验1:隔离和表征的假定的msc产后牛子宫内膜

3.1.1。殖民地和增殖能力

所有孤立的细胞显示呈形态学和坚持塑料,播种时融合低,扩散和殖民地产生积极的AP染色(图1)。殖民地的数量明显高于HPPE细胞比CPPE(5.42±0.7和0.83±0.8每道菜克隆,职责),以及克隆效率(CE 0.64±0.1%和0.08±0.1)。与此同时,平均细胞倍增时间(CDT)显著低于比CPPE HPPE,价值30±0.4小时和41.97±1.4(表2)。HPPE细胞充满了文化在5到7天,菜而SPPE或CPPE取得了圆满confluency在8到10天,10到12个,分别。

3.1.2。Multilineage在体外分化

在诱导分化细胞对刺激chondrogenic,成骨、脂肪形成的血统。视觉上,染色强度在固定的时间点(7天或14感应)相似的细胞系,我们没有试图量化染色。然而,脂肪形成的油红染色检测只有在奶牛健康奶牛或亚临床子宫内膜炎。没有观察到染色noninduced彩色控制(图2)。

3.1.3。基因的表达和蛋白质标记

从牛子宫内膜组织切片和细胞分离和培养在体外表示OCT4 SOX2、CD44和c - kit但不是NANOG。OCT4和SOX2表示更高的组织或细胞健康的动物,一般来说,所有基因的表达比细胞在组织文化来源于组织(图表示3)。多能性标记OCT4和SOX2在组织证实了免疫印迹,在大多数组织样本牛子宫内膜的病理条件(图4)。

3.2。实验2:基因表达与铂族元素牛子宫内膜假定的msc的挑战₂

3.2.1之上。差异基因表达的转录组分析

使用安捷伦的牛4×44 K芯片,我们发现在微阵列共有17114支安打。其中,1127人对照组(铂族元素之间的差异表达₂浓度= 0),和其他被认为是在一个使用的剂量0.05和2 x倍变化的价值。作为一个总体趋势,有更多的基因表达下调(763年和529年 和 、职责)比调节(364年和86年,分别地)。罗斯福是0.05%。由于小数量的差异比较时解除基因在不同剂量(数据未显示),进一步详细分析了只有在次级细胞(剂量0)和主要的细胞(剂量1、2和3)。因此,前40名最放松管制的基因被选中(表3),并进行生物信息学分析基因本体和网络交互。猫须的情节分析,两个细胞系和三种不同剂量被认为是。显然,没有效果的细胞系情节(图的结果5)。

3.2.2。基因本体论和网络交互

去分析,受影响最严重的生物过程是细胞组件组织或生物起源和细胞和代谢过程。其他代表过程发现的是生物调控、发展、增长,免疫系统。最代表分子功能绑定,催化,受体、运输、和结构分子活动。所代表的途径达到调节基因中有血管生成,B和t细胞活化,血液凝固,内皮素信号,促性腺激素释放激素受体,heterotrimeric蛋白受体,通过趋化因子和细胞因子介导的炎症信号,PDGF和Wnt信号。表达下调的基因,通路与最热门的血管生成,钙粘着蛋白信号,促性腺激素释放激素受体,亨廷顿疾病,炎症通过趋化因子和细胞因子介导的信号,信号转导,Wnt和鉴定及信号(图6)。

GeneMania预测服务器用于确定潜在的前40名最差异表达基因之间的交互。从所有的基因分析,只有两个(LOC781494和SNHG3)识别的程序和38 40查询基因联系。主要作用是coexpression(70.5%)(图7)。对于一个更详细的挖掘分析,我们全球网络分为三个部分:(1)集中和(2)周边地基因( 和 、职责)和(3)基因无论是中央还是次要地坐落但强相互作用( ),旨在检查一个给定的实际作用解除基因网络的交互。第一部分集中位于基因,是更广泛和更强的交互网络,从而表明这些基因的一个关键的角色对铂族元素复杂反应₂挑战。五个基因调节和五在这一类表达下调。主要有两种途径影响出现在这群相互作用的基因;的一个是upregulation COX7总科及其相关通路如AMPK酶复杂的通路和呼吸电子传递,ATP合成的化学渗透耦合,通过解偶联蛋白和热生产;去注释相关基因包括电子载体活动和细胞色素c氧化酶活动;另一个的差别是对这些胰岛素样生长因子结合蛋白及其相关通路包括子宫肌层的放松和收缩igf - 1受体信号途径和发展;去注释相关基因包括纤连蛋白绑定和胰岛素样生长因子I绑定。

为了验证芯片结果,qPCR 13日执行选定的基因,有绝对的微阵列之间的巧合和qPCR数据,平均价值 (图8)。

4所示。讨论

在产、后,有一个高风险的子宫被病原体感染,主要是细菌;这些感染可以适当侵犯子宫退化和回国后的重新和旋回性(25]。假定,这种重新由居民或迁移msc (3]。在这项研究中,我们成功地分离和细胞特征与msc的特点从奶牛的子宫内膜在产后健康的奶牛,以及从奶牛亚临床和临床子宫内膜炎。这项工作中所使用的细胞不能严格被称为纯msc。没有特定的MSC标记允许纯MSC的识别;事实上,最有可能的是,他们是异类,nonclonal文化间充质基质细胞含有干细胞具有不同的分组人口multipotential属性,承诺祖细胞和分化细胞(26]。然而,这项研究的细胞的独特属性,包括他们multilineage分化潜力,他们准备好了可用性和广泛的体外扩张能力确实表明msc混合人口的存在。正如上面提到的,没有明确的成体干细胞的标志。只有在人类,这种标记已设置的最低标准,而不是其他物种包括牛(27]。然而,表面表型,结合其他功能标准,最好标识MSC。然而,这些标准仅适用于人类的MSC。对于其他物种,特别是对农场动物,表面抗原的表达不是普遍特征和推荐的标记可能不适用于非人类系统。

以前,我们小组报告了类似的细胞循环牛(19,20.];因此,这不是意外识别等效在产后健康的子宫内膜细胞群。类似的程度上,细胞显示相同的属性被确定在本研究在奶牛亚临床子宫内膜炎、CE和CDT没有不同于健康的奶牛。这里所有的原代细胞培养派生显示呈形态与塑料的依从性。此外,当这些细胞被播种在低密度,所有主要的文化产生了殖民地;然而,克隆效率更高的细胞中分离出健康的牛,就像细胞倍增时间。在临床病牛,情况是不同的;单独使用效率为0.08±0.1%和CDT 41.97±1.4小时被发现。类似的单独值效率低(0.02%)已报告在人类子宫内膜基质细胞(28,29日]。此外,在猪子宫内膜msc、值高达0.035%的记录(16]。虽然有一个单独使用效率低的细胞来源于牛临床子宫内膜炎,这是证明所有细胞能够形成牛产后期间的殖民地。这个发现支持的存在公认的利基市场msc在子宫内膜的3]。此外,倍增时间更长比观察到在这项研究中被描述为人类基蜕膜干细胞值为2.21±0.21天(30.]。

看来,子宫内膜炎细胞生长缓慢和克隆效率较低;所有这些可能暗示的减少细胞生存能力或衰老。虽然不包括在结果部分,我们发现细胞来自endometritis-ill动物一般来说,尤其是来自临床子宫内膜炎,往往脱离文化容器和文化就更难了在体外。这可能与炎症有关,因为没有污染细菌、真菌、酵母曾经发现在这些或其他细胞。炎症改变细胞膜的物理性质造成严重的组织损伤和/或细胞坏死,从而影响组织的再生能力在产后(31日]。相信炎症可以直接影响祖干细胞在细胞分裂的总数和导致更多的过早老化,证明经济增长放缓和影响细胞分化的结果32]。

我们进一步发现,在感应trilineage分化,只有孤立的从奶牛子宫内膜细胞临床子宫内膜炎没有区分脂肪形成的血统。健康奶牛的子宫内膜细胞的去骑自行车一直在报道之前我们和其他研究小组(18- - - - - -20.,33]。健康的子宫内膜细胞和亚临床在产后子宫内膜子宫内膜炎的典型功能特征描述msc、如呈形态与塑料的依从性、高增殖能力、克隆形成,并能分化成chondrogenic,成骨、脂肪形成的血统在体外(34]。似乎并没有这种情况与临床细胞来源于牛子宫内膜炎。这可能反映了细胞的分化状态或者,不同的和更坚定的祖细胞。类似的现象被发现子宫内膜细胞的健康循环期间奶牛早期黄体期(19]。几个子集的干细胞的存在与更成熟的后代组织限制了细胞自我更新和改变的能力分化潜能(35,36]。提出了在文献中,感染和炎症可以抑制创伤子宫内膜的再生效应分子,对居民产生损害细胞负责组织修复和再生37]。

这不能排除来自动物的细胞与子宫内膜炎在我们的研究进入衰老或者至少显示衰老细胞的一些特性,尽管我们没有研究这些标记在我们的研究中。传播的主要细胞体外常受到衰老实验模型;这似乎是对msc。在大鼠msc、衰老相关基因的差别和对这些干细胞维护和DNA损伤修复基因,以及减少在分化的潜力,特别是脂肪形成的潜在的(38]。在这些实验中,衰老细胞显著调节基因在细胞外基质的重塑或调停局部炎症。Rett综合症患者,使用msc显示,早熟的衰老的迹象与健康病人的msc相比对照组(39]。作者等几种具备干细胞基因的差别也发现对这些OCT4 NANOG,并发的upregulation lineage-specific基因,如参与骨生成。

没有定义的基因标记比人类子宫内膜msc的牛或其他物种(27]。在这项研究中,我们发现两个表面标记的表达msc、CD44、CD117。前者可能存在污染成熟纤维母细胞的数量(40),后者在这种细胞尚未报道。牛,CD117表达在子宫肌层的和子宫内膜上皮细胞和间质细胞培养;这表明是一个祖先的骨髓前体,这可能迁移到子宫在整个动物的生命,无论其发生年龄或卵巢激素状态(33]。我们也发现这个基因表达牛子宫内膜msc不管发情周期的阶段,我们提出它的表面标记牛子宫内膜msc (19,20.]。发现CD44在子宫内膜msc的农场动物如猪、绵羊的,牛16,17,19,41)和母马(自己et al .,未发表)。

核多能性标记OCT4 SOX2,但不是NANOG,也发现在基因和蛋白质样品,与我们之前一致的发现在牛19,20.)和其他人的发现在健康和患病的妇女的子宫42- - - - - -44),以及在奶牛的子宫16和猪子宫内膜基质细胞培养的45]。具备干细胞标记物的表达减少培养细胞在子宫切片相比,它们的存在。建议塑料和附着力在体外文化产生的损失特性和细胞标记,这一直在观察脂肪细胞附着基质细胞(46牛子宫内膜细胞)和来自发情周期的卵泡期(20.]。多能性标记的存在与分化标记可能表明子宫内膜干细胞可能来自残余胎儿各器官(干细胞保税47]或指向的存在几个牛子宫内膜干细胞的数量,不同的功能性质根据牛的炎症状态在产后子宫内膜。

信息之间的联系内在炎症和再生途径在子宫内膜炎是稀缺的。我们建议在子宫内膜炎的炎症触发铂族元素₂子宫内膜组织分泌,细胞变化以应对子宫内膜炎包括铂族元素₂介导的激活居民基质祖/干细胞。我们没有试图量化本地子宫铂族元素₂分泌,因为它已被证明麻烦和不准确的11,48)和血液测定铂族元素₂并不一定反映实际的子宫内膜的水平。以前,我们显示,子宫内膜msc在黄体期后期做应对铂族元素₂政府创建一个autocrine-paracrine-positive反馈导致更多的铂族元素₂分泌(未公开的数据)。这里所描述的那样使用一个启动方法的基本原理是减少偏见的截然不同的铂族元素₂表达水平可以存在于细胞来源于牛子宫内膜炎;因此,我们决定使用一个细胞模型,该模型已在实验室测试,有两个主要属性:(1)不分泌细胞基底的铂族元素水平₂和(2)响应在挑战。我们发现1127基因差异表达之间的剂量0和其余的剂量的铂族元素₂,我们发现当剂量的铂族元素的细微差别₂比较他们的自我。

基因相互作用网络的分析表明,有一个upregulation COX7大家庭的一员。这可能意味着转变生产前列腺素的终端产品参与COX2的花生四烯酸途径合成,最终在铂族元素₂释放和行动。极大地支持了铂族元素的文学₂移植自己的分泌物通过COX2和相关通路(49];因此,人们很容易认为具有挑战性的细胞与铂族元素₂导致正反馈调节的前兆。IGFBP的差别,对这些通路,因此igf - 1受体的信号可能与子宫内膜的增殖缓慢表型细胞在子宫内膜炎的情况下。可能这两个通路之间的合作行动导致了过度的铂族元素₂和细胞增长的放缓。这种情况可能发生在子宫的环境下子宫内膜炎高水平的铂族元素的地方₂是礼物。最后,我们找到了一个非常健壮的一套精确的相互作用在书中四种基因位于基因相互作用网络地图,但保持一个强大的、精确的交互。三种基因的互补因素家庭(CF家族基因B、D和H)和PPARD(过氧物酶体proliferator-activated受体δ)。前基因是参与免疫反应,补体诱导金黄色葡萄球菌感染。D缺乏Downregulation在这些基因构成补充因素,这是与人类患者复发性细菌性脑膜炎感染(50]。后者基因参与Wnt信号通路(WikiPathways)。

激活的铂族元素₂通路在子宫内膜可能导致转移的比例正常干细胞可能识别和孤立。据报道,铂族元素₂在卵泡期刺激通过Wnt /子宫内膜细胞的生长β连环蛋白通路,在猪子宫内膜的情况下控制的周期性细胞再生过程(51]。

上面所示的数据去信息和描述一般过程或函数,但是详细看是在特定的通路对基因的影响。从这个意义上讲,所代表的通路调节基因中最热门的血管生成,B和t细胞活化,血液凝固,内皮素信号,促性腺激素释放激素受体,heterotrimeric蛋白受体,介导炎症趋化因子和细胞因子信号和PDGF和Wnt信号。表达下调的基因,通路与更多的点击率是血管生成,钙粘着蛋白信号,促性腺激素释放激素受体,亨廷顿氏舞蹈症,炎症通过趋化因子和细胞因子介导的信号,信号转导,Wntβ连环蛋白,TGF -β信号。

总之,我们能够证明具有挑战性的子宫内膜msc与铂族元素₂导致大规模重组细胞的转录组剖面,我们所知的文献中未见报道。最引人注目的相关基因和通路影响免疫反应,血管生成和细胞增殖。铂族元素的加入₂子宫内膜细胞似乎表达下调细胞免疫反应。这与我们的研究结果是一致的脂肪马msc(未出版)。在文献中没有可用的数据与我们的研究结果的差别,对这些免疫反应在子宫内膜。这不过是有道理的,因为msc所示的文献和自己的未发表的研究与促炎许可immunoprivileged在刺激分子如正伽马(52]。

在我们的实验中,铂族元素₂子宫内膜细胞的差别导致了对这些Wnt -β连环蛋白和TGF -β信号,这是意想不到的。Bayne et al。53)表明,铂族元素₂调节体内生殖细胞功能在人类卵巢发育期间,作用于介质如苯丙酸诺龙等影响多能性标记的表达在人类卵巢妊娠前三个月胎儿,其中包括E2 E4受体和瓦萨号DAZL基因,但不是OCT4。Goessling et al。54)使用在体外和在活的有机体内小鼠和斑马鱼模型明确表明,铂族元素₂与Wnt通路直接交互的磷酸化β连环蛋白和担任主调节器的干细胞招聘,在脊椎动物器官再生。Wnt /β连环蛋白通路刺激了铂族元素₂是相同的规范干细胞招聘路径使用HSC细胞和胚胎干细胞(54]。最有可能的是,短暂暴露于铂族元素₂通过当地局部诱导组织再生干细胞招聘或从造血干细胞迁移,而长期博览会等可能导致慢性炎症持续的子宫内膜异位。尽管上面提到的研究没有目标子宫内膜干细胞再生,人们很容易推测,类似的过程可能在postmenstrual女性子宫内膜的重新循环再生的子宫内膜在反刍动物或铂族元素₂调节子宫内膜炎。我们的研究结果与这两个通路有关在体外模型使用一致的观察到的有限的可用性和功能的MSC与奶牛亚临床或临床研究子宫内膜炎。

正如上面所讨论的,我们也不能排除我们的细胞进入衰老的可能性。充分展示了在文献中,铂族元素₂可能引发衰老的发生。曝光在体外和在活的有机体内对铂族元素₂可能导致衰老表型(55,56]。当CD8 + T细胞暴露于铂族元素₂显示,细胞衰老的标志,如损失CD28的表达,减少了端粒酶活性与端粒缩短,和超表达p16, COX2和细胞内营55]。这些数据表明,铂族元素增加₂可能导致衰老的免疫细胞的发展。同样,铂族元素的描述₂行动在一个自分泌循环EP COX2受体诱导高水平和衰老在人类成纤维细胞通过一个独立的ROS和铂族元素的依赖₂/ EP intracrine通路(56]。

微阵列数据的研究,我们没有能够识别关键微分调节衰老标记,包括CD28、p16,端粒酶等上面所讨论的。感兴趣的,ρGTPase-activating蛋白27 (ARHGAP27)表达下调和p27、衰老细胞表达的标记,没有检测到。我们相信,至少在我们的实验条件,我们发现暴露的假定的msc在体外对铂族元素₂没有引起衰老,虽然慢性的接触在活的有机体内在子宫内膜炎铂族元素₂全身衰老的细胞来源于子宫内膜没有解决,不能排除。

5。结论

我们确认祖msc在牛的存在在产后子宫内膜。子宫内膜的病理炎症修改和限制msc的一些功能特性。这变得更加明显比亚临床临床子宫内膜炎,建议更分化的子代细胞的存在。可能是组织损伤产生的炎症可能直接影响细胞的利基和/或促进细胞增殖,为了恢复组织内稳态。曝光在体外msc的中介炎症如铂族元素₂修改他们的转录组,主要涉及生物过程,如细胞组件组织或生物起源和细胞代谢过程,如生物调控、发展、成长,和免疫系统。因此,铂族元素₂可能有潜在的作用,干细胞激活的命运,迁移,寻的病理过程,如子宫内膜炎、子宫炎症和健康的产后子宫内膜。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

伊夫林劳拉参与的概念并进行实验设计,采样的动物,RT-qPCR,细胞与数据分析工作,稿件写作,和批判性阅读,Alejandra委拉斯开兹微阵列分析执行,乔尔自己参与的概念想法和抽样动物和推导细胞系,音流里维拉期间协助的大部分实验和在校对和修订手稿,Paulina柏查表现西方印迹和贡献pcr费尔南多Saravia进行活组织检查,监督动物工作,并参与稿件写作,Lleretny Rodriguez-Alvarez参与微阵列,生物信息学,想法,和批判性阅读,和菲德尔·卡斯特罗Ovidio构思最初的想法,参加批判性阅读和手稿写作,指导博士生。所有作者同意的最后一篇文章。

确认

这项工作由政府研究资助FONDECYT普通1110642的智利。