文摘

危重肢体缺血(CLI)的结束阶段下肢周围性血管疾病(PVD)的严重阻塞血液流动导致缺血性疼痛,溃疡或坏疽,肢体的一个重要风险损失。这个非盲、单臂可行性研究评估自体骨髓细胞的安全性和治疗有效性(aBMC)集中在CLI患者的血管再生利用快速即时装置。17(17)别无选择CLI休息缺血性疼痛患者参加了这项研究。单剂量aBMC,准备利用一种术中即时装置,该Res-Q™60 BMC系统,肌内注入受苦肢体和定期随访12个月。显著改善踝臂指数(ABI),经皮的氧气压力(TcPO₂),意味着其他疼痛,间歇性跛行疼痛分数,伤口/溃疡愈合,6分钟步行距离aBMC治疗后观察。主要amputation-free生存(加)率和amputation-free利率(误判率)12个月分别为70.6%和82.3%,分别。总之,aBMC注射耐受性良好改善组织灌注,确认安全,可行性,初步在CLI aBMC治疗患者的有效性。

1。介绍

危重肢体缺血(CLI)是一种虚弱的心血管疾病,其特征是严重血流动力学障碍,慢性缺血性疼痛,缺血性溃疡或坏疽,和组织的损失。危重肢体缺血的发生率估计大约有500到1000例新病例,每百万人每年在西方国家和人口老龄化,预计将增加风险(近一倍)由于持续的烟草使用,增加2型糖尿病、肥胖和久坐不动的生活方式1,2]。同时,心血管事件的发生率大大增加在折磨病人。美国流行的CLI目前2.8 350万人,预计到2020年增长3.6至450万人(3]。

CLI动脉严重阻塞,导致下肢血流量显著减少。长期缺乏血液供应导致一连串的病理生理事件,最终导致严重的其他疼痛的脚或脚趾(4),因此进步愈合的溃疡和伤口的腿,脚,或者脚踝在稍后的阶段。随着CLI的发展有关的风险因素包括年龄,使用尼古丁,糖尿病,高血压,高胆固醇血症,和心血管疾病家族史5- - - - - -8),推动我们的社会需要找到新颖的临床干预措施可以恢复seminormal肢体功能或者至少稳定疾病进展。

当前主流的治疗选择这些病人手术和/或血管内手术,旨在向远端肢体血管再生和改善灌注(3]。尽管技术进步,超过30%的患者不符合血管再生的候选人,因为过度血管介入手术风险和/或不良(9]。缺血肢体的其他治疗方法包括药理方法使用脂质减少,抗血小板,和抗高血压治疗10]或非药物方法恢复灌注及局部伤口护理,其中包括压力卸载,感染控制,并根据需要细致的清创术11]。但是,没有药物治疗已被证明有效地降低截肢率CLI患者(12]。最后一个可用的选项为这些病人已经用尽了他们的手术选择截肢(13,14]。据估计,这些患者的死亡率都没有资格获得外科血管再生和血管内治疗,被指定为“别无选择”CLI的病人,在6个月内从诊断大约是20%,在1年的范围从10到40%,另有40%将经历重大截肢(1,15,16]。还预计,208000年下肢截肢与CLI执行在美国每年有超过65000被截肢。不幸的现实是,只有15%的截肢患者过上正常的生活与一个合适的假肢,而剩下的85%的截肢者无法有足够的移动再次照顾自己(17,18]。

因此,这是一个关键,尚未被满足的医疗需求,创新方法,以增加血管再生急需拯救生命和肢体和提高整体生活质量。细胞再生疗法针对新血管形成和改善肢体灌注治疗策略已经被提议作为小说。1997年,Asahara等人,施等人发现了一个类骨髓衍生的循环内皮祖细胞(epc)导致血管生成和/或血管生成在缺血性组织和改善组织灌注19,20.]。小第一次作用于人体的临床试验,由Tateishi-Yuyama et al .,显示安全性和承诺的影响自体骨髓(BM)——派生细胞疗法患者危重肢体缺血(21]。自那时以来,专注于使用自体的细胞疗法的研究已经显示有前景的结果,导致了一些临床研究在过去的十年,在自体骨髓细胞(aBMC)植入患者的CLI没有其他替代治疗方案显示这种疗法的安全性和有效性基于统计分析,为CLI提供了新的希望患者(12,14,22- - - - - -28]。这些研究也报道骨髓干细胞和祖细胞的能力,促进血管再生,从而提高肢体灌注充分解决疼痛静止和保肢。

骨髓细胞集中(BMC)功能通过不同的机制;然而,目前尚不清楚BMC的子集是最佳治疗CLI (28,29日]。骨髓细胞集中包含一个异构的内皮祖细胞,间充质干细胞和造血干细胞,刺激血管生成治疗疾病的组织灌注不足(30.]。血管发生在阶段通过内皮细胞发生迁移管的形成和改造新形成的血管三维网络不必要的微血管的回归(31日]。移植的骨髓细胞迁移到缺血性内皮表面,他们改善毛细血管的密度和微血管主要由分泌生长因子和细胞因子(如血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β(TGF -β),纤维母细胞生长因子(FGF)),该展览旁分泌作用,改善阻塞动脉。此外,分泌细胞因子调节微环境,从而缓解症状通过推行CD14 immune-suppressive字符⁺单核细胞(18,28]。虽然新血管形成的确切机制仍不明朗,越来越多的临床试验使用骨髓祖细胞衍生了临床效益,显示出灌注的客观和主观的措施改善,疼痛减少,增加总步行距离,降低截肢率(3,28]。所有的这些原因,细胞疗法的前景作为潜在的新治疗方法先进周围性血管疾病患者。

的目的非盲、非随机化,只有,可行性研究评估快速即时设备的安全性和可行性,Res-Q 60 BMC系统,成功地处理自体骨髓(BM)和BM的初步治疗有效性别无选择CLI患者的细胞治疗。

2。材料和方法

2.1。研究设计

关键肢体ischemia-Stem细胞疗法(CLI-STEM)研究是设计成一个非盲、前瞻性随访时间,只有,Ib /可行性研究阶段。共有17名患者参与的研究患有晚期CLI剩下缺血性疼痛和轻微组织损失(13(13)患者动脉粥样硬化垫和四(4)血栓闭塞性脉管炎患者)在他之前的所有治疗血管再生策略失败(“别无选择病人”)。此外,这些患者证明infrainguinal动脉粥样硬化狭窄(> 70%)或闭塞(100%)的一个主要的船,有踝臂指数(ABI)≤0.6 (TcPO和经皮的氧气压力₂)< 35毫米汞柱。肢体缺血的诊断证实了CT血管造影(CTA)和截肢是唯一可用的治疗方案确定和证实了血管外科医生和介入放射。所有登记患者接受单剂量肌内注射自体骨髓细胞(aBMC)集中与标准治疗(传统疗法)药物和医疗管理。

协议是通过“独立伦理委员会(TIEC)”(TIEC / 2010/30/04)和“制度委员会干细胞研究和治疗(IC-SCRT)”的参与机构和注册clinicaltrials.gov(标识符:NCT01472289)。这项研究是进行符合赫尔辛基宣言。书面知情同意参与是获得所有的病人。

2.2。入选标准

符合条件的患者18至65岁的男性和女性与动脉粥样硬化性脑缺血外周动脉疾病(PAD)或血栓闭塞性脉管炎(t) /血栓闭塞性脉管炎的下肢缺血性疼痛定义为静止和次要组织损失和缺血性溃疡或坏疽,这可能是干燥或潮湿,踝臂指数(ABI)≤0.6或脚踝≤60毫米汞柱或TcPO压力₂≤35毫米汞柱的脚,没有可接受的选项可用于血管再生。患者考虑近期截肢(脚踝以上)由于严重威胁生命的缺血被要求建立控制血糖水平(糖化血红蛋白< 8%),控制血压和抗高血压治疗是必要的,和控制hyperlipidaemia条目之前与他汀类药物和抗血小板治疗。

2.3。排除标准

主要排除标准是糖化血红蛋白> 8.0%;血清肌酐≥2.0 mg / dL和血清总胆红素≥2.0 mg / dL;已知的CLI侧血管再生过程失败或需要截肢患者近端transmetatarsal水平;中度到重度慢性阻塞性肺疾病(COPD)用金IIb分类或第三;不受控制的充血性心力衰竭(CHF)或左心室射血分数< 25%;在最后3个月中风或心肌梗塞;涉及严重感染和/或不稳定的肢体;记录终端疾病或癌症平均寿命不到1年;孕妇或哺乳期妇女或病人表现出传播(湿)坏疽;和之前登记在另一个临床实验的试验或完成一个在过去3个月。

2.4。治疗过程

治疗过程涉及愿望和处理骨髓和肌内注射自体骨髓细胞集中到研究肢体使用试验性设备SurgWerks-CLI工具包(美国Cesca疗法,Inc .)包含Res-Q 60 BMC系统(医疗点技术,许可# md - 826,中央药品标准控制组织,印度)。这医疗点工具包是包容的过程和所需的设备交付aBMC,专门协助处理的细胞(即。,快速净化/浓度)在病人的床上,一个坐在操作剧院。过程是在有意识的镇静和严格的无菌条件下进行。总容量120毫升的骨髓是吸气时从多个站点的髂后上嵴肝素化注射器在局部麻醉下使用一个11-gauge 5-side-hole卷针。小整除的吸气1毫升收集骨髓细胞计数和样本分析,不育性和可行性。

收获骨髓是处理和集中使用Res-Q 60 BMC系统(产热corp .)。这个医疗点系统是一个自动化的细胞处理医疗设备集中的骨髓密度梯度离心的方法。吸气骨髓转移无菌,同样到两个Res-Q 60 BMC设备使用血栓过滤器(包括在SurgWerks-CLI工具包)消除大颗粒物质,如血栓、脂肪和骨头芯片。处理是在手术室病人的床侧和24 mL(从每个设备12毫升)BMC丰富的祖细胞收集的设备。整除(4毫升)的aBMC收集加工样品,后来分析的细胞计数,不育,能力和生存能力。

其余20毫升自体骨髓集中在0.5毫升卷/肌内注射注射部位(共有40个网站,深度1.5厘米)的腓肠肌/小腿肌肉缺血肢体的厘米网格使用22码针。有伤口或溃疡,4 - 6注射0.25毫升(max 1.5毫升)管理在伤口边缘之后伤口清创术。

患者出院第一术后一天,安排后续在1、3、6、12个月后细胞疗法,和给定的标准治疗药物,包括阿司匹林、氯吡格雷、血管紧张素转换酶抑制剂,β-受体阻滞剂和他汀类药物,局部伤口疗法(全身抗生素治疗和手动清创术的坏死组织)。包括主观和客观评价措施的临床,血流动力学,和功能结果。临床结果包括截肢的地位,其他疼痛,间歇性跛行使用视觉模拟疼痛评分量表,6分钟步行距离,检查/伤口溃疡或坏疽。血流动力学变化结果进行评判,踝臂指数(ABI)和经皮的氧气压力(TcPO₂)。使用SF-36功能结果评估生活质量调查问卷。CT血管造影在基线和重复执行12个月的定性和定量评估程度的血管生成。血液学和血液化学实验室监测也执行。

2.5。端点

这个临床研究的主要终点是确定肌内的安全管理集中自体BMC收获、加工、和交付使用Res-Q 60 BMC系统(SurgWerks-CLI工具包),快速nonreconstructable CLI患者术中即时装置。,第二个端点被测量的变化来评估初步有效性血液灌注参数来衡量ABI和TcPO₂,其他疼痛,间歇性跛行疼痛评分的变化,6分钟步行距离,临床检查溃疡、坏疽、或伤口愈合,在12个月内amputation-free存活率,程度的血管生成两个定量和定性测量使用CT血管造影术。

2.6。统计分析

所有数据使用的统计分析软件SAS统计分析系统9.1.3版本。所有安全端点进行分析intent-to-treat (ITT)人口和所有主要和次要疗效端点按方案(PP)人口进行分析。进行了描述性的分析,提出了临床事件发生率在数量和百分比(%),和连续变量平均值±标准偏差。个体内的连续变量的比较在基线和随访进行配对t以及正态分布变量和魏克森讯号等级测试为非正态的分布式连续变量。所有报告的不良事件(AEs)被认为是严重不良事件(节约),总结了使用数量()和百分比(%)。所有统计测试是通过使用两面,0.05水平的意义。

3所示。结果

3.1。基线特征

研究注册图如图1,登记患者的基线临床特点总结表1。所有CLI患者筛选有潜在病因学由于动脉粥样硬化动脉闭塞性疾病(PAD)或血栓闭塞性脉管炎(t) /血栓闭塞性脉管炎。17个病人筛选的22名患者中,达到合格标准,并参加了这项研究。所有患者的缺血性四肢肌内注射自体BMC。研究患者的平均年龄年。15(88.2%)的男性和2(11.8%)女性患者。9个(52.9%)患者接受治疗左肢,而8(47.1%)接受了治疗对肢体。17接受aBMC治疗的患者中,16例(94.1%)病人访问在1和3个月,治疗后的随访和15例(88.2%)患者的后续访问6和12个月。所有患者接受抗血小板,ACE(血管紧张素转换酶)抑制剂和β-受体阻滞药药物在整个研究期间。

3.2。安全性和可行性

骨髓愿望、处理和注射在手术室完成在一个坐在局部麻醉下不到60分钟。患者能耐受手术,瞬变光滑镇静用于促进骨髓愿望和注射过程。没有出血,感染,或手术相关的并发症,包括局部注射部位肿胀在所有受试者在治疗后aBMC管理。平均总有核细胞计数(TNCC)和单核细胞计数(MNCC) 20毫升aBMC产品注入受苦肢体8.04×10⁸(±3.66)和2.16×10⁸(分别为±1.02)。意思是可行的CD34⁺细胞4.06×10⁶(±3.82)和平均总集落形成单位101.10×10⁴(±113.61)。平均细胞生存能力被发现超过88.94%。表2概述了意味着细胞产品描述为骨髓样品预处理和后处理。细胞计数不与年龄、并发症或结果。

所有端点安全研究中分析了ITT人口。17个病人的治疗,7例(41.2%)患者的不良事件报告,三个(17.6%)患者接受了主要截肢(脚踝以上),两个(11.8%)患者接受了小截肢(数字/ s),和两个不相关的死亡报道(190年121天治疗后)。所有的不良事件报告被视为严重不良事件。

3.3。初步疗效端点

3.3.1。ABI和TcPO分析₂

按方案的疗效端点进行分析(PP)人口基础()和所有干预后病人显示改善他们的条件。ABI和TcPO₂作为非侵入性技术评估微血管血流和组织氧张力后浓缩自体骨髓肌内治疗。ABI是用来提供一个测量下肢的血液流动和有正常价值0.91 - -1.3 (32),而TcPO₂被用来评估氧的分压(张力)在下肢组织的毛细血管。TcPO₂值大于40毫米汞柱据说与好治愈的机会而≤40毫米汞柱被定义为低差的愈合的机会(32,33]。数据2(一个)和2 (b)显示ABI和TcPO的变化₂从基线到aBMC注入后12个月,分别。

分析可评价的患者表现出显著的改善意味着ABI post-BMC治疗从月()到6 ()随访期间基线相比,逐步减少从6个月到12个月的随访期间;然而它仍然高于基线水平。BMC治疗病人显示TcPO显著改善₂12个月的随访期间()与基线相比,说明改进的微血管血流和组织氧张力在干预后治疗肢体的毛细血管。缺失的数据进行分析的两个常用的归责方法:“0”法归责(缺失的数据值0)所取代,最后观察结转(LOCF)方法(失踪测量参与者被参与者的持续观测值)。结果表明,在ABI和TcPO没有统计上的显著差异₂这两个方法之间的观察测量。ABI使用均值的方法“0”污名和LOCF方法是0.696(±0.27)和0.71(±0.25)在12个月后治疗,表明有两个归责方法之间无显著差异。同样,意味着TcPO₂价值在12个月后治疗使用的方法“0”污名和LOCF方法是35.75毫米汞柱(±17)和30.12毫米汞柱(±17.12),分别,这不是一个统计上的显著差异。数据3(一个)和3 (b)显示的变化之间的比较阅读使用两个归责方法ABI和TcPO₂,分别。

TcPO₂也可以用来预测标记主要截肢和文学确认这种关联是相当强劲。让这个评估我们使用Cox比例风险模型来调查TcPO的效果₂时间事件(截肢和死亡)使用基于研究数据集点模型结果表明,该事件率降低约0.85倍(HR =风险;率=事件率比率)平均TcPO每增加1毫米汞柱₂。相同的值是0.85月TcPO使用基线或获得₂阅读。事件率平均降低约15% TcPO每增加1毫米汞柱₂统计学意义()。在此基础上,基于模型的TcPO之间的关系₂和事件风险分析和绘制在图4。在意味着TcPO₂15毫米汞柱,整个六个月事件风险是18%左右;然而如果意味着TcPO₂增加到25毫米汞柱,基于模型的六个月的事件风险小于4%,如果意味着TcPO₂是35毫米汞柱,基于模型的六个月的风险小于1%。从而提高TcPO₂与减少截肢/死亡事件,科目有一个基线值15毫米汞柱有更高的风险事件与患者基线值> 25毫米汞柱。数据表明,治疗可以改善TcPO₂它可以安全地预测截肢率将降低“事件”。

3.3.2。功能改进、伤口愈合、和其他疼痛

按方案的疗效端点进行分析(PP)人口基础(),所有患者显示改善的6分钟步行距离,其他疼痛,间歇性跛行疼痛分数和溃疡的愈合,伤口和BMC干预后坏疽。

6分钟步行试验。图5显示分布的6分钟步行试验从基线到12个月。在基线,14个病人的分析,2例(14.3%)患者能走6分钟平均距离为101.5米。BMC干预后,有一个显著的改善患者的数量能够行走,由他们在6分钟的距离。在个月随访8例(57.1%)患者能走6分钟平均距离为130.0米,在3个月的随访,9例(64.3%)患者能够走路和覆盖在6分钟的平均距离为190.0米。之后患者能够走的数量保持不变在6 - 12个月的治疗后的随访,但平均距离被增加到233.3米和210.0米,分别。总的来说,能够行走的患者数量的变化以及从基线走到12个月的平均距离是统计学意义()。

其他疼痛,间歇性跛行疼痛评分。数据6(一)和6 (b)显示其他疼痛,间歇性跛行疼痛评分的变化从基线到BMC治疗后12个月。休息疼痛定义为烧灼感感觉静止,通常在皮肤上的脚,并评估使用评分系统(0 - 3)中定义的协议,也就是说,没有痛苦= 0时剧痛= 3。间歇性跛行是一个痉挛腿部疼痛,发生在运动,尤其是走路,用视觉模拟量表(血管)(清廉,没有疼痛= 0和最差疼痛= 10)。平均疼痛评分基线休息疼痛,间歇性跛行是2.8(±0.80)和7.8(±0.97),分别。BMC治疗后,曾经有一段时间的依赖,显著减少其他疼痛和跛行疼痛分数从个月到12个月的随访期间。在1个月post-BMC治疗,其他疼痛,间歇性跛行疼痛评分显著减少到1.2 (±1.17)()和4.9 (±2.22)(),分别,年底前12个月的随访期间,BMC治疗患者没有痛苦在休息(),而间歇性跛行疼痛评分显著降低到0.2 (±0.58)()。

临床检查的溃疡、坏疽和伤口。图7显示了溃疡愈合时间的总结,坏疽,伤口。影响肢体的溃疡和坏疽患者评估的视觉临床检验由经过培训合格的医生在不同随访时间间隔。在基线,11(78.5%)的14受试者面对脚缺血性溃疡或坏疽。然而,BMC接受治疗后,观察到12个月的随访,所有患者报道溃疡、坏疽或伤口在基线有一个完整的溃疡愈合。大多数患者缺血性溃疡长在肉内肉芽组织的指示一个重要伤口/溃疡愈合过程。

3.4。截肢,截肢率

主要的截肢是6个月的平均时间在所有的BMC治疗病人。主要amputation-free生存率和总截肢率在ITT分析人口()。12的17例(70.6%)患者幸存下来没有任何重大截肢(加:主要amputation-free生存)和14的17名(82.3%)患者的四肢被从主要截肢(误判率:主要amputation-free率)。kaplan meier曲线为主要amputation-free生存和amputation-free率呈现在图8。截肢是相关的所有事件在性质和严重疾病的自然进程。

3.5。程度的血管生成

CT血管造影术诊断测试,利用x射线技术和三维成像血管和周围组织的肢体的影响,来确定执行动脉狭窄或堵塞的位置和严重程度,从基线测量血管生成的程度。下肢的CT血管造影(CTA)显示多个焦点狭窄与血流量降低抵押品的基线。CT血管造影进行筛查和在12个月的随访中。验证独特评分系统被用来量化根据侧枝血管大小(抵押船舶成绩0到4)和担保(抵押船舶类别0到3)数量在近端,中期,和远端地区受灾大腿和腿。评分系统的描述和总结在表3。CT血管造影分级和分类结果的形成和大小的络脉表进行了总结4。统计上显著的增加侧枝血管的数量在远端大腿()和近端腿()与基线相比,而络脉在统计学上的大小增加远端大腿(与基线相比)。结果表明,有轻微到中度增加毛细管抵押品,大小和毛细管数post-BMC治疗。图9显示病人的CTA图像在基线和12个月,描绘血管增生程度的定性分析。

4所示。讨论

关键肢体ischemia-Stem细胞疗法(CLI-STEM)可行性、非随机、非盲、单臂,只有研究旨在评估收集的安全性和初步有效性和肌内注射自体骨髓细胞集中nonreconstructable患者危重肢体缺血,每个病人都接受骨髓祖细胞收获和加工使用快速即时设备,Res-Q 60 BMC系统。本可行性研究的目的是提供一个快速即时处理安全性和交付设备,为关键的试验平台。研究的结果是显著的,这说明安全、可行性,合理的初步别无选择CLI患者细胞治疗的有效性。此外,我们的数据表明,骨髓衍生细胞产品的使用可能会增加肢体灌注,改善肢体缺血的跛行症状,作为我们的研究结果显示出显著增加ABI, TcPO₂水平,无痛行走距离。

缺血是一种强有力的刺激增加氧气交付通过一个侧枝血管网络和刺激血管生成(34,35在CLI),但这种自然功能受损患者(36,37]。刺激血管生长和/或改造已成为一种新的治疗选择患者的缺血性疾病。不同的治疗性血管生成策略,基于政府的重组生长因子等,肝细胞生长因子(HGF),细胞和诱导血管生成蛋白质(VEGF)和骨髓中,自体或同种异体,祖细胞混合物,已经提出,目前在人类研究调查。自体骨髓(BM)衍生干细胞和祖细胞已经被认定为一个潜在的新的治疗选择诱导血管生成治疗骨髓有核细胞产生的未分离混合物包括大量的分化的细胞被认为提供血管生成细胞因子以及干细胞成为纳入抵押船舶通过neoangiogenesis [38]。(aBMC)浓缩自体BM的细胞是来源于骨髓抽出物的密度梯度离心法,由()组成的一个非细胞分数自体血浆细胞因子和(b) (i)的细胞分数的祖细胞在几个级别的成熟和multipotency等(2)proangiogenic细胞来源的造血干细胞,间充质祖细胞和内皮祖细胞。生物组件及其合理的角色在组织修复和再生aBMC一个有吸引力的来源的细胞治疗缺血性疾病的治疗性血管生成(39]。

Compagna等人最近的一项评估显示,一些研究细胞疗法用于别无选择CLI病人,尽管有些失败由于失效因素的功能干细胞(即。,diabetes), the results obtained have confirmed the beneficial effects of cell therapy in reducing the major amputation rate, improving distal perfusion, reducing rest pain and claudication pain, improving ABI, TcPO₂,步行距离,整体改善CLI的缺血性症状病人和他们的生活质量40]。由王et al。此外,荟萃分析,在31日发表的随机对照试验(相关的)和non-RCTs,共有1214名患者,评估,有利报道自体骨髓细胞疗法的影响。在选定的研究中,大多数的严重不良事件(节约)与疾病过程相关并发症和住院相关不相关的细胞疗法。踝臂指数(ABI)和疼痛分数显示细胞疗法后的显著改善non-RCT和个随机对照试验组织。最重要的是,长期(> 1年)临床试验证明了amputation-free生存(AFS)率改善治疗后骨髓细胞(28]。Benoit等人评估相关的涉及骨髓衍生干细胞和祖细胞(),发现控制臂之间的截肢率和治疗手臂显著(分别为25.4%和14.8%)证明骨髓衍生细胞改善结果在CLI病人41]。在回顾57早期阶段的临床试验,自体骨髓细胞移植的安全性和可行性是在1667年报道的人体(42]。我们的结果与先前发表的研究合作,我们展示了潜在的安全性和可行性别无选择CLI患者自体骨髓细胞集中。

除了类型的细胞用于治疗、细胞疗法的给药途径也被争论的一个主要主题前临床试验(43]。两个主要路线的政府用于研究肌内(IM)和动脉内的交货(IA)的路线。肌内交付骨髓衍生的治疗性细胞的祖细胞允许直接销售到缺血组织新血管形成是必需的。然而,另一方面,动脉内的交货可能直接细胞可行peri-ischemic区,那里有足够的营养供应支持细胞增殖和分化12]。先前的研究显示肌内(IM)和动脉内的(IA)注射或两者的结合产生了有前景的结果在人类垫(44,45]。到目前为止,大多数的细胞疗法临床试验使用肌内注入治疗细胞,它似乎是一个安全有效的程序,确认我们的研究的发现,肌内交付自体骨髓细胞集中作为给药途径。我们建议,在肌内交付,等离子体存在于骨髓有助于血管生成细胞和细胞因子的分布集中在肌肉纤维,纤维蛋白原,在等离子体,创建一个净,有注射血小板在缺血性组织和细胞,激活的刺激炎症级联和收益对治疗(46]。

我们的研究的主要发现是,BMC疗法显著促进减少截肢在12个月的随访,主要展示别无选择CLI amputation-free存活率70.6%的病人。以前不受控制的研究使用肌内注射BMMNC或血液单核细胞报道6个月保肢率71%47)和59% (17]。因此自体BM-derived细胞疗法似乎是一个相对安全的和可行的治疗方案没有或最小的不利影响。进入CLI患者患有动脉粥样硬化垫或血栓闭塞性脉管炎(道),也称为血栓闭塞性脉管炎。CLI是动脉粥样硬化的最严重形式影响多数患者PVD垫,同时估计有20 - 40%的患者血栓闭塞性脉管炎是更常见的在年轻的人口尤其是那些烟原油和高集中形式的烟叶(17,48]。道是进步在中小动脉炎症和血栓性静脉炎,引起剧烈疼痛在其他肢体和可能导致坏疽。据报道在以前的研究中,血栓闭塞性脉管炎患者死亡率和患病率较低与动脉粥样硬化外周动脉疾病患者的病理生理学与心血管危险因素(没有联系26]。在我们的研究中,更好的临床结果和更低的死亡率血栓闭塞性脉管炎患者的观察。没有观察方式患者死亡率或发病率并没有接受任何截肢或大或小的()在12个月的随访期间。动脉粥样硬化垫amputation-free存活率和方式患者分别为46.5%和100%,分别表示一个重要的血栓闭塞性脉管炎患者的预后。我们的研究结果与以前公布的合作研究[26,49]。虽然没有明确的理由的作用机制对于优越导致血栓闭塞性脉管炎患者,然而负担的心血管风险因素大大减少,因此,减少功能障碍的祖细胞和暴力的系统环境中存在这个病人人口导致血栓闭塞性脉管炎患者更好的结果。此外,我们的研究有一个非常小的样本容量的方式肯定病人结束语句,因此,进一步的研究与更大的患者人群需要之间建立治疗疗效的差异血栓闭塞性脉管炎和动脉粥样硬化外周动脉疾病患者使用骨髓细胞疗法。在我们的研究中,三个主要的截肢报道在动脉粥样硬化患者人群,在4个月,6个月、12个月post-BMC植入,截肢被证实是一个正常的发展应对疾病的临床恶化或由于缺乏改善。研究结果非常有前途,相当数量的研究取得了保肢治疗患者post-BMC和我们的结果是类似于其他研究的结果在CLI患者治疗骨髓衍生单核细胞(3,15,16]。

相比之下,最近的一项荟萃分析。彼得斯Weem等人CLI患者的随机安慰剂对照试验显示在截肢率没有显著差异或amputation-free生存之间的细胞疗法治疗和安慰剂治疗的患者50]。进一步,JUVENTAS-trial,双盲,安慰剂对照研究160例,显示无显著差异之间的截肢率在6个月治疗骨髓(19%)和安慰剂治疗组(13%)(51]。同样,PROVASA研究治疗40 CLI患者BMMNC的动脉内的注射或安慰剂对照多中心,第二阶段,双盲,安慰剂对照试验显示无显著差异在保肢和amputation-free存活率之间的两组(52]。此外,一些试点研究小样本大小没有任何明显的不同细胞疗法治疗和安慰剂对照组CLI患者(53,54]。虽然,这些发表的研究与治疗骨髓细胞疗法的有效性降低截肢率相比安慰剂控制,它们与小样本量相对较小的试验主要用于安全分析,要求和更大的双盲,安慰剂对照研究证明细胞疗法的治疗效果。

此外,BMC治疗已经显示出有益的影响其他生理和解剖参数,包括溃疡愈合,ABI, TcPO₂,无痛步行距离,其余的疼痛分数。考虑到灌注分析,我们评估了改善肢体灌注减少缺血性疼痛(由血管评估),改善步行距离,伤口愈合的迹象,改进的ABI和TcPO₂测量。这些指标也更客观所使用的端点其他研究相比,麻木,寒冷的感觉,和痛苦27,55]。在我们的研究中,踝臂指数(ABI)显著增加BMC治疗后1个月,达到了一个峰值在6个月后治疗相比基线。此后,ABI逐渐减少,直到12个月随访;然而它没有达到基线水平。结果经皮的氧气压力(TcPO₂显示显著增加了一个月,在12个月的随访post-BMC植入术达到了顶峰。ABI和TcPO的变化₂与临床指标的改善包括溃疡愈合和减少疼痛。我们数据变化ABI后骨髓衍生细胞疗法是在赞同与先前发表的研究(14,21,29日,48,56- - - - - -59]。在上述矛盾的结果,很少有研究报道,BMC注入并未改变ABI但加速溃疡愈合和其他疼痛减少外周动脉疾病患者(52]。PROVASA试验使用ABI评估作为他们的研究的主要终点;然而他们的研究结果得出结论,选择ABI的变化作为主要终点是这项研究的主要缺点是ABI的变化值不与改善临床治疗最相关的治疗目标,也就是说,溃疡愈合和保肢52,60]。类似的冲突一直在观察临床端点和功能性端点之间CLI患者的治疗性血管生成的基因治疗试验(61年]。相比之下,我们的研究数据显示,改善TcPO之间很强的相关性₂降低截肢率的拟合,因此TcPO Cox比例风险模型₂可以安全地预测截肢事件。类似的相关性已被证明其他调查人员,经皮的氧张力的预测价值高出脚踝截肢的糖尿病患者危重肢体缺血了(26,62年]。

自体骨髓单核细胞衍生被证明能增加无痛步行距离明显严重的外周动脉疾病(PAD)患者和危重肢体缺血在12个月的随访63年]。如前所述在文献中我们观察到100%的为病人在其他研究显示改善疼痛,间歇性跛行疼痛改善在90%的病人。这些结果优于其他研究,Gabr等人报道改善其他55%的病人疼痛,钟和同事报道提高88.2%,剩下Tateishi-Yuyama等人报道50%回归的痛苦(21,27,55]。此外,与潜在的行走并且执行6分钟步行试验显著增加post-BMC输液,结果显示,65%的病人能够步行6分钟平均距离为210.0米,12个月随访相比14%的患者能够走在基线。很少有试验用步行时间或距离衡量标准化跑步机协议或6分钟步行试验作为主要终点,甚至次要疗效端点。6分钟步行试验的测试测量的最大距离走6分钟后,无论是否病人停止休息;因此,这个测试可以用来评估患者严重跛行,缺血性疼痛,休息或有限组织损失(64年]。像其他功能措施这个端点被认为是临床意义和实际有用的,因为它在基线特征病人的限制和对治疗的反应。

正常/健康条件下的响应逐渐进步肢体缺血涉及促进血管生成和arteriogenesis为了增加血液供应受影响的肢体。血管重塑、炎症和凋亡通路参与缺血性反应,这些在一定程度上可能导致组织损伤的决议。总之,肢体缺血后组织愈合过程可分为三个阶段:(i)血栓formation-induced缺氧,导致低灌注和代谢失调的受损细胞进行细胞凋亡和坏死;(2)炎性细胞,中性粒细胞,单核细胞,淋巴细胞,家庭为去除死细胞坏死组织;和(iii)改造和再生最终形成瘢痕组织(65年]。缺血性疾病患者的细胞和分子机制激活的血管生长和血管重塑明显受损的有害微环境特点是纤维化炎症和组织灌注不足。

一般来说,血管再生包括恢复正常血管功能和结构、血管衰老的逆转,和新血管的生长66年]。这包括一个广泛的过程,如血流量的分布通过新的担保网络的形成;新生成的反应血管血流动力学,体液,和当地组织因素;免疫反应的调节和循环细胞贩运;和营养物质和大分子通过微脉管系统的渗透,从而反过来有营养影响血液流动和止血42,67年]。新血管形成是一个过程,涉及抵押从先前存在的血管堵塞血管的形成迁移,增殖,分化的祖细胞和生长因子和细胞因子之间的相互作用。新血管形成的过程包括三个不同的现象:(i)血管生成,血管生成(ii),和(3)arteriogenesis68年]。新血管形成,局部组织缺血,发生不仅居民成熟内皮细胞的迁移和增殖,也涉及骨髓(BM),派生的内皮祖细胞(EPC) [69年]。为了应对缺氧,当地生产的趋化因子和生长因子,如基质细胞衍生因子- 1α(SDF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)是调节,导致这些物质的血液水平升高。这些因素在大英博物馆微环境诱导的释放和激活基质金属蛋白酶(MMPs)引起内皮祖细胞,SDF-1来说是积极的α受体CXCR4和VEGF受体2 (VEGFR-2 KDR),移动到循环(70年]。内皮祖细胞随后促进新血管形成,通过内皮细胞层物理并入或排泄的旁分泌刺激居民内皮细胞扩散的因素(69年[],后者可能是最重要的机制71年,72年]发生在演唱会与其他循环细胞如单核细胞(73年,74年]。

行动的确切机制在CLI病人注射BMC还不是很确定。目前还不清楚如果注射细胞直接参与血管生成过程或作为细胞因子工厂释放多个不同的生长因子,有旁分泌作用。几种推测机制活动的细胞疗法在CLI已经被先前的研究报道;这些包括增加组织多血管;(2)增加组织microperfusion毛细管水平;(3)改造的纤维组织,允许新的毛细管增长或增加孔隙流体流动;(四)改善mitochondriopathy;和(v)调制的炎症反应计划组织破坏伤口愈合。因为这些机制的组合的可能性提高缺血性条件可能协同,骨髓浓缩的复杂的混合物,包括造血干/祖细胞,间充质干细胞/祖细胞,内皮祖细胞,炎症细胞前体可能是重要的治疗作用。例如,CD14的存在⁺巨噬细胞可以促进细胞外基质的溶解在血管周围间隙空间,从而提高船舶发芽的内皮前体细胞(18,29日]。原则上增加血流量是通过增加血管的数量或络脉供血缺血性组织。植入自体骨髓细胞被证明是有效的和可行的技术诱导血管生成治疗的临床和实验研究。然而,细胞的血管生成能力可能有所差异分数的骨髓细胞,这些发挥关键作用尚不清楚27,55]。图10给的图解表示事件遵循在缺血性疾病和合理的注射骨髓祖细胞的作用机制增加多血管和保肢。

在我们的研究中,一个独立的核心实验室评估的定量和定性变化受苦肢体的CT血管造影在基线和12个月。CTA成像的大腿和小腿肌肉地区差异的形成可见的抵押品在大腿远端和近端腿aBMC治疗后12个月相比基线的血管发生的说明。络脉的量化分级显示显著差异意味着抵押品数量在大腿远端和近端腿地区12个月post-BMC治疗与基线相比,虽然相比之下意味着担保规模显著增加只有在远端大腿地区12个月post-BMC治疗。类似的结果显示了Yoon et al .,他们目睹了增加毛细血管和小动脉的血管密度当BMMNC管理在心肌梗死的实验模型(75年]。虽然没有多少文献可使用CTA的侧枝血管的定量评价和大多数发表的研究使用CTA确认改进的外围侧枝循环远端动脉闭塞(76年- - - - - -78年),从公布的数据也很明显,抵押船舶的可视化是更广泛的在数字减影血管造影(DSA)相比CTA (76年]。但是,由于有限的可用数据,这些断言可能不是真的。此外,Qenawy等人表现出显著差异在抵押船舶的可视化和量化多维CTA与DSA相比(77年]。CTA是一个成功的影像学方法证明外周动脉闭塞或狭窄。它也可以用于评估络脉的存在,有可能作为定性和定量预测的一个重要指标的治疗。

细胞注入剂量扮演一个关键的角色在细胞治疗的有效性。现阶段系统(SurgWerks-CLI工具包)在本研究中用于细胞准备了几个优点,因为它是一个快速,单坐过程可以减少时间,成本和人工干预进行处理和注射骨髓细胞集中在CLI患者的缺血性四肢和完整的过程在操作剧院在90分钟内完成。此外,该系统能够实现平均总有核细胞计数8.04×10⁸(±3.66)从120毫升的骨髓采集,其中意味着可行的CD34⁺细胞4.06×10⁶(±3.82)CD34和平均总集落形成单位⁺101.10×10⁴(±113.61)。这些数字相媲美通过手动基于聚蔗糖的协议,需要500毫升的骨髓送气音。小体积的骨髓导致骨髓收获时间短,减少麻醉风险,和贫血(79年]。

5。结论

管理自体骨髓单核细胞的注射是很容易的,便宜的,安全的,一个明确的改善对肢体缺血的影响。然而,目标细胞群的规范,给药途径、剂量升级需要更大的样本量和控制研究。阶段Ib /可行性研究表明SurgWerks-CLI工具包包括Res-Q 60 BMC系统是安全、可行的获取,处理,和肌内注射aBMC缺血性四肢和初步疗效结果表明aBMC治疗可能改善主要amputation-free存活率,6分钟步行距离,踝臂指数,TcPO₂其他疼痛,间歇性跛行别无选择CLI患者的疼痛评分。主要研究局限性单组研究(i)这是一个,(2)小样本大小为安全分析设计,和(3)这是一个只有学习。因此,基于这些有前景的结果,考虑到研究的局限性,我们已经启动了第三阶段/关键,多中心、随机对照双盲研究别无选择CLI患者更大的样本量。总之,细胞治疗耐受良好,为危重肢体缺血的患者提供了上升的希望。

相互竞争的利益

所有作者声明没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

马纳尔Ponemone和肯尼斯•李哈里斯促成了本文的概念和设计。Suhail布哈里Upendra Kaul Ashok赛斯和研究人员。马纳尔Ponemone和Saniya Gupta写了篇文章。理查德•j•鲍威尔Dalip Sethi,莫妮卡Sharma, Suthar资源和Suhail布哈里回顾了文章。共处生物科学进行了数据分析。马纳尔Ponemone Saniya Gupta, Manish Suthar导致了研究的分析和解释。Priyadarshini Arambam和Nungshi Jungla导致了数据收集。

确认

作者扩展他们的温暖感谢Ravi Bathina博士和他的团队在事实基础(独立核心实验室)评价CT血管造影图像研究的患者。其独特的分级系统提供了伟大的洞察力和专业知识,极大地协助研究和研究结果。