文摘
无法治愈的neuroretinal变性疾病引起严重的视力丧失和全球数以百万计的患者的失明。在先前的研究中,我们表明,移植人类骨髓基质细胞(hBMSCs)血管外的空间脉络(EVSC)的皇家外科学院的大鼠视网膜变性改善5个月。评估的安全hBMSC治疗和移植生存在一个大动物临床试验开始之前是一个关键的一步。在这里,我们将hBMSCs移植到新西兰白兔的EVSC舱。没有使用免疫抑制剂。移植细胞分布在EVSC覆盖超过80%的视网膜下表面。未发现细胞在巩膜。细胞被保留在EVSC隔间移植后10周。光谱域光学相干断层扫描(SD-OCT)和组织病理学分析证明没有脉络膜出血,视网膜脱离,炎症,或任何弯曲的病理反应移植的眼睛或控制noninjected侧的眼睛。没有减少视网膜功能是由网膜电图记录移植后10周。 This study demonstrates the feasibility and safety of transplanting hBMSCs in the EVSC compartment in a large eye model of rabbits.
1。介绍
年龄相关性黄斑变性(AMD)是致盲的主要原因和严重的视力损害在工业国家,影响超过3000万人,主要集中在老年人(1]。与慢性氧化应激和炎症相关的疾病,最终导致蛋白质损伤,聚合和变性的视网膜色素上皮(RPE)细胞和伴随的感光细胞的退化。积累RPE之间的细胞外矿床(点)和他们的潜在的基底膜(布鲁赫膜)进一步加速RPE细胞死亡导致光感受器变性(“干燥”AMD)。10到百分之十五的AMD患者发展新生血管性(“湿”)AMD脉络膜新生血管形成,入侵异常血管,和液体泄漏到视网膜(2]。视网膜色素变性(RP)的最常见原因是遗传导致的无法治愈的neuroretinal变性。这是一个高度遗传异质性疾病,一个初始杆光感受器丧失紧随其后的是视锥细胞和其他视网膜神经元的变性以及RPE [3]。虽然有“湿”AMD的治疗方法,减少新血管形成和改善视力4),黄斑视网膜变性继续进步和没有有效的治疗可以阻止或减缓视网膜细胞的进行性神经退行性变的干AMD和RP。
骨髓基质细胞(bmsc),描述了20多年前,都进行了广泛的研究和细胞治疗被认为是优秀的候选人neuroretinal变性疾病。这些细胞通过分泌神经营养和survival-promoting起到旁分泌作用生长因子和细胞因子,以及保护和修缮的微型和纳米脂质微泡(5,6]。伴着低水平的表达主要组织相容性复合体(MHC)类我没有分子和分子MHC II级(7]表明同种异体移植的可能性。此外,免疫抑制,抑制促炎细胞因子的释放8- - - - - -11]。这些性质使bmsc neuroretinal变性疾病的细胞疗法的优秀候选人。
在眼科干细胞疗法的一个主要挑战是很难安全地交付有效剂量的细胞接近整个地区受影响的组织,视网膜。目前眼部细胞交付方法不足且充满了相当大的风险。因此,安全问题和blood-retina障碍限制系统应用程序的使用。Intravitreal注射目前应用于临床交付某些药物(如抗血管新生治疗)。然而,我们和其他人表明intravitreal注射更有效的干细胞作为细胞分散差通过玻璃体凝胶(12]。取得了更好的结果使用视网膜下注入的干细胞。视网膜下hBMSCs被证明改善视网膜功能的移植大鼠和小鼠模型的AMD和RP (13- - - - - -16]。在这些研究中,通过transscleral-transchoroidal细胞移植的方法,创建一个局部视网膜下“水泡”。有限数量的细胞可以被注入,感光营救被限制在注射部位附近的地区。因此,这种方法可能不是有效的治疗AMD或RP,大面积视网膜受损。视网膜下移植涉及3端子术后玻璃体切除术和局部视网膜脱离的治疗领域,需要多个站点的注入在每只眼睛提供充足的治疗剂量每视网膜面积(17,18]。此外,手术视网膜下提出了一个重要的安全问题,如视网膜结构在整个AMD和RP患者的视网膜手术是脆弱的,可以产生机械损伤,反应性胶质增生,损失函数(19- - - - - -22]。这些过程的影响是在最近的基因治疗试验中记录的患者接受视网膜下注入视网膜中央凹下区域失去了视网膜厚度和视力23),这表明视网膜下手术在治疗视网膜中央凹可能存在风险,这是AMD的靶组织。
克服上述表示的局限性视网膜下细胞移植,我们已经开发出一种新方法的细胞移植到血管外的空间脉络(EVSC)潜在的视网膜。在先前的研究中,我们表明,移植的hBMSCs EVSC AMD和RP的老鼠模型导致的视网膜感光救援沿着最显著增强视网膜功能细胞移植后5个月。无视网膜脱离、出血或观察炎症的迹象,尽管老鼠与人类细胞,移植和免疫抑制药物有(12]。本研究建立了合理的移植hBMSCs EVSC舱作为一个可能的治疗AMD和RP。在后续研究中,我们展示了高效交付hBMSCs兔子使用一种新型喷油器的EVSC [24,25]。
评估的长期安全性和有效性的细胞移植到EVSC舱在大型动物模型是至关重要的一步的临床试验。在目前的研究中,我们调查了短期和长期的安全移植人类细胞EVSC隔间的兔子。我们专注于移植细胞的本地化的眼睛,保留移植细胞,倔强的病理学的证据。
2。方法
2.1。动物
十四新西兰白(NZW)兔子从哈伦实验室购买以色列Rehovot保持直到手术示巴医学中心动物设施。所有动物与批准程序和实验和动物保健机构委员会的监督下示巴医学中心,Tel Hashomer,符合研究协会的建议在视觉和眼科学声明中使用动物在眼科和视觉研究。
2.2。干细胞的制备
新鲜的人类骨髓来自3健康志愿者(年龄35 -年)。骨髓样本收集在手术室在无菌条件下,机构审查委员会批准下示巴医学中心,Tel Hashomer(没有研究。0816 - 13 - smc)。骨髓单核细胞分离的聚蔗糖梯度(1.077 g / dl)根据制造商的指示和被播种在组织培养瓶培养基含有低杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)补充15% FCS, 100 U /毫升青霉素,100μ谷酰胺g / ml链霉素,2毫米。组织培养48 h后改变了媒体,然后每周两次直到融合了70 - 80%。细胞表面抗原表现型进行所有通道在细胞3捐助者通过流式细胞术(FACSCalibur becton dickinson)使用抗体针对CD14、CD34、CD45、CD73, CD90、CD105, HLA-DR [12]。细胞3捐赠者表达间充质细胞表面标记CD73 CD90、CD105和负了造血标记CD14和CD34的表达,地表人类白细胞抗原DR (HLA-DR)和内皮细胞CD31标志。高细胞生存能力被证明缺乏整合7 aad肽。增殖指数测试在第一个72小时后播种,XTT试剂按照制造商的指示(生物产业、拜特Haemek、以色列)。3捐赠者的细胞用于移植。
2.3。细胞标记与1,1′-Dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐
hBMSC被标记移植前迪勒(1,1′-dioctadecyl-3, 3、3′, 3′-tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐)通过孵化细胞悬液的浓度1×10670年cell /毫升μl PBS包含0.27毫米迪勒。
15分钟后孵化在37°C,细胞被广泛用PBS和resuspended 10%人血清白蛋白溶液(Zenalb®20日Kamada) 1×10的最终浓度6细胞移植/毫升。
2.4。细胞移植
一千五百万hBMSCs被移植到一只眼睛的EVSC舱NZW兔子。兔子在氯胺酮(35毫克/公斤)和甲苯噻嗪(5毫克/公斤)肌肉注射麻醉。手术显微镜下进行细胞移植(野生M690徕卡;鲱鱼、瑞士)。在颞象限peritomy之后,一个3.0毫米线性切向切口的4毫米后的异色边缘使用AK钻石刀(Accutome Inc .莫尔文,PA)。生成一个3毫米巩膜的隧道使用钻石角膜刀刀(莫尔文Accutome Inc . PA) 20°角向脉络。喷油器的针(26)是扩展和插入到隧道巩膜的扩展它,和0.3毫升注射细胞悬液的解决方案。这个过程需要3 - 5分钟。兔子安乐死与戊巴比妥钠(140毫克/公斤),和眼睛被进行组织学分析。兔子,保持后续收到Dipyrone饮用水中(1 gr / L)注射后12小时。
2.5。光谱域光学相干断层扫描(SD-OCT)
兔子被麻醉的肌内注射氯胺酮(35毫克/公斤)和甲苯噻嗪(5毫克/公斤),和他们的学生被局部扩张管理1下降0.5% tropicamide眼药水(费舍尔药品实验室,(又称除酵节),以色列)在图像采集。眼角膜保持湿润和2.5%羟丙甲纤维素(费舍尔制药实验室(又称除酵节),以色列)。10月的眼睛受到成像与Spectralis®多色SD-OCT(海德堡工程、海德堡、德国)。兔子放在一个平台与视觉条纹(3毫米腹视神经头,“)位于中心的形象。我们进行了矩形扫描每快768 a,共有25快每帧。使用ImageJ SD-OCT扫描进行分析(版本1.5 d;美国国立卫生研究院,马里兰州贝塞斯达),注册7 B-scans /图像使用Stackreg插件[27]。下面的层厚度测量:神经节细胞层(GCL)、内网状层(IPL),内部核层(INL),外网状层(OPL),外核层(筒),RPE,脉络,巩膜。过程持续时间大约是15分钟/眼睛。
2.6。网膜电图(ERG)记录
兔子麻醉与肌内注射氯胺酮和甲苯噻嗪tropicamide学生与局部扩张1%,和2.5%羟丙甲纤维素眼角膜保持湿润。尔格记录从双眼同时使用角膜接触镜片ERG-jet电极(微组件,《Pastique,瑞士)。氯化银参比电极放置颞眼角附近皮下注射。地线是放在耳朵上。反应在10000获得0.1 -1000 Hz,放大过滤去除60 Hz的噪音,和数字化速度10 kHz。ERG的黑暗,兔子被保存在完全黑暗的环境测试和之前2 h反应和刺激间隔平均外墙面年代取决于刺激的亮度水平。light-adapted ERG的兔子light-adapted 10分钟前测试和反应平均1 s的刺激间隔。闪光强度分别为0.023,0.25,2.4,4.4和23.5 cd-s / m2。
2.7。免疫荧光
眼睛是无核的,沉浸在4%多聚甲醛(PFA) 48 h和渗透的解决方案包含2% PFA和5%蔗糖1 h。然后,眼睛是孵化在蔗糖溶液(5%、10%、12.5%、15%蔗糖)30分钟,其次是孵化在20%蔗糖16 h。眼睛嵌在20%蔗糖最佳切削温度(超频T,樱花Finetek Inc .托兰斯、钙、美国)。Ten-micrometer cryosections沿垂直经线眼睛的低温恒温器通过视神经被削减。检测移植细胞,部分被封锁在PBS含有5%正常山羊血清,1% BSA, 0.3% triton - x - 100在室温下30分钟。部分与反核抗体孵化,克隆3 e1.3(美国EMD微孔,泰梅库拉,CA) 20小时在4°C,其次是Alexa-fluor568-labeled山羊anti-mouse二级抗体(杰克逊ImmunoResearch西树林,PA)。检测脉络膜血管,部分是孵化单克隆鼠标anti-smooth肌肉肌动蛋白(克隆1 a4, Sigma-Aldrich Inc .圣路易斯,密苏里州,美国)在室温下1 h紧随其后的是二次抗体Alexa萤石488 -共轭山羊anti-mouse抗体(杰克逊ImmunoResearch西树林,PA)。部分与DAPI复染色(4′,6-diamidino-2-phenylindole, Sigma-Aldrich Inc .圣路易斯,密苏里州,美国)3分钟,用PBS洗净,由荧光显微镜检查(BX51,奥林巴斯)或莱卡SP5共焦显微镜。
2.8。组织病理学
Cryosections如上详细准备,与苏木精和伊红染色。光学显微镜评估变化的眼睛。
2.9。统计分析
MANOVA分析使用SPSS为windows 20.0版。我们进行了6周(时间)×5(振幅)×2(移植与控制)MANOVA时间周和刺激振幅定义为受试因素,移植和控制作为一个主题之间的因素,和a - b-wave录音作为因变量。如果认为重要差异。
3所示。结果
3.1。移植hBMSCs维护EVSC隔间的兔子眼睛10周
在先前的研究中,我们证明了Dil-labeled人类干细胞的移植在EVSC隔间。移植细胞在一层薄薄的同系物本地化,覆盖87±3%(平均±SE) subretina表面的移植后2小时(24,25]。
检查保留移植细胞的眼睛,nonlabeled hBMSCs EVSCs和视网膜移植的部分是沾了反核的抗体。如数据所示1- - - - - -3,移植的人类细胞中演示了EVSC舱高达10周后移植。兔眼的马赛克组织学部分切除后的两周内移植nonlabeled hBMSCs反抗体标识移植细胞在沾ECSV占地80±2%(平均±SE)的表面(图2)。在10周的时间点,细胞被发现在几个孤立的位置(图3 (f))。没有积极的人类细胞染色巩膜移植的眼睛或侧noninjected控制眼睛的兔子(数字1- - - - - -3和数据未显示)。
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3.2。脉络膜血管之间的移植hBMSCs所在
确定移植的人类骨髓基质细胞的确切定位EVSC隔间内,我们移植Dil-labeled hBMSCs和检查了他们的本地化EVSC通过染色的部分抗体针对平滑肌肌动蛋白是专门表达的平滑肌细胞中模的脉络膜血管以及面向没有血管的平滑肌细胞的纵向沿血管壁的外表面(28]。图4和补充图证明人类bmsc移植Dil-labeled的本地化(红色)EVSC血管周围细胞移植后4天。没有发现细胞在血管检查的任何部分。
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3.3。组织病理学分析与hBMSCs眼睛移植
组织病理学检查眼睛移植hBMSCs并没有发现视网膜病变,脉络膜或巩膜移植的眼睛移植后(图在任何时间点5)或控制侧nontransplanted眼睛(数据未显示)。重要的是,没有炎症浸润淋巴细胞或其他迹象显示观察注射或侧的眼睛。
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3.4。评价细胞移植安全SD-OCT成像
细胞移植的安全性被SD-OCT成像评估。如图6,没有了视网膜脱离或脉络膜出血1小时后移植(图6 (b))。唯一的不规则性明显的细胞移植后拍摄的图像是脉络的“拉伸”(突出显示星号和垂直的白线,图6 (b))。脉络膜的厚度明显高于移植后1小时(92.7±8.7μm和236.8±16.5μ米,意味着±SE,t以及值= 0.006)。在移植后10周,脉络膜的厚度没有明显不同于基线(104.9±13.2μ米,)和明显薄与移植后1小时()。没有明显差异在视网膜厚度或内视网膜厚度层(所有不同时间点之间、表1)。
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3.5。评价细胞移植后视网膜功能
ERG分析措施的大规模电响应视网膜光刺激和广泛用于客观测定视网膜的功能状态和客观安全结果不同的眼部疗法。在RCS大鼠在我们之前的研究中,我们展示了一种瞬态减少ERG hBMSC移植后第一周。以后点,ERG移植的眼睛证明改善视网膜功能移植眼睛和nontransplanted眼睛像预期的那样接受视网膜变性的视网膜变性的老鼠模型(12]。此外,在临床试验旨在确定安全封装细胞植入睫状神经营养因子,减少暗的振幅b-wave 4的7参与者由于植入29日]。检查hBMSC移植视网膜功能的影响在兔子,nonlabeled细胞被移植到右眼的3只兔子和ERG分析双眼同时细胞移植后,每2周之前。具体地说,我们测量产生的振幅的b-wave内视网膜双极细胞,是最常用的参数在临床研究和动物研究和生成的一波外锥和棒的感光层(30.- - - - - -32]。锥和棒的反应时可以独立执行测试光或暗适应下,分别为(32,33]。没有观察到显著差异之间的注入和控制,noninjected侧眼睛在任何的时间点(数据进行测试7和8)。
4所示。讨论
移植hBMSCs是一个有前途的潜在治疗neuroretinal变性。当前外科移植方法受限于高度侵袭性注射过程和少量的细胞,可以注入需要多次注射预防视网膜脱离(17,18]。
本研究中使用的新注入系统使微创、安全交付同一位置的细胞疗法用于intravitreal直接注射到组织目标(sub-RPE和脉络膜血管外的空间)。大量(300μl, 15×106细胞)可以被注入不插入任何外科手术工具中央视网膜附近渗透视网膜或脉络膜。新方法不需要三端口术后玻璃体切除术,视网膜下气泡的形成,或多个注射正在临床试验中用于交付视网膜色素上皮干细胞细胞靠近RPE [17,18]。在我们之前的研究中,我们表明,细胞分布在大多数兔子视网膜的后段表面的(87%),包括中央视网膜细胞注射后1小时(24,25]。在这里,我们表明,移植细胞保留在EVSC覆盖80%的后表面两周后移植。在移植后10周,一些细胞保留在EVSC几个孤立的位置。RCS大鼠在我们之前的研究中,移植hBMSCs保留在EVSCs仅为2周,但光感受器变性改善移植后22周。因此,我们的研究结果中保留的hBMSCs兔子的大眼睛模型较长的时间,非常有前途的未来临床病人使用。使用迪勒标签和抗体染色,我们没有发现任何人类细胞在巩膜。
细胞移植后,观察脉络膜厚度的增加使用SD-OCT细胞移植后1小时。有趣的是,注射后一个类似的染料和narrow-size氧化铁纳米粒子的EVSC兔子眼睛,脉络膜的厚度没有明显变化(26]。这些发现可能表明,注入溶液的粘度可能影响脉络膜的厚度后注入。未来实验将旨在测试这种可能性,包括注射的细胞在一个不同的解决方案和不同的细胞载体浓度以及其他注射参数(如注入量、注入体积)。然而,功能成像和组织病理学分析并没有透露任何缺血性或出血性的发现。
一些移植人类细胞保留在EVSC兔子的眼睛移植后10周,不需要免疫抑制与没有任何出血或发炎的迹象。在先前的研究中,我们证明IONP-delivery FGF2可以增强hBMSC体外生长和分化的影响[34]。在未来的研究中,我们将检查的可能性,延长移植物存活在EVSC coinjection IONPs含有生长因子,促进hBMSC生存。
这个长期10周随访证明没有任何病变视网膜结构和功能在兔子的眼睛与hBMSC异种移植,通过成像(SD-OCT),组织病理学分析,ERG功能分析。此外,正如眼睛是immune-privileged既然hBMSCs是免疫抑制和现在的低水平的抗原呈递MHCI MHCII,我们当前和以前的12)的研究表明,这些细胞的同种异体移植中使用我们的方法EVSC舱预计不需要免疫抑制患者是安全的。此外,作为异种移植的治疗效果的人类bmsc移植大鼠保持5个月(12),同种异体移植hBMSCs有可能促进感光抢救患者几个月。
5。结论
在这项研究中,我们演示了移植的长期安全hBMSCs EVSC室的大眼睛的动物模型,使用微创和简单的外科手术作为关键步骤之前进入临床试验。这种方法可以提高其他干细胞疗法的疗效和安全性,基因疗法,可能其他治疗后段。
缩写
| AMD公司: | 年龄相关性黄斑变性 |
| DAPI: | 4′,6-Diamidino-2-phenylindole |
| 迪勒: | 1,1′-Dioctadecyl-3 3 3′, 3′-tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐 |
| ERG: | 网膜电图 |
| EVSC: | 没有血管的空间脉络 |
| hBMSCs: | 人类骨髓基质细胞 |
| IONP: | 氧化铁纳米颗粒 |
| PFA: | 多聚甲醛 |
| 总机: | 色素性视网膜炎 |
| RPE: | 视网膜色素上皮 |
| SD-OCT: | 光谱域光学相干断层扫描。 |
附加分
这项工作进行了部分实现萨丕尔理科硕士学位要求的e·卡利什在萨克医学院,以色列特拉维夫大学。
信息披露
支持组织没有参与这项研究的设计或行为。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。示巴医学中心申请了专利的主题。
作者的贡献
Adi Tzameret和萨丕尔e·卡利什同样这项工作。
确认
本研究是克莱尔和赠款支持Amedee Maratier研究所盲症和视力障碍的研究,萨克医学院,以色列特拉维夫大学,贸易和工业部·Yeda程序(Ygal Rotenstreich)。
补充材料
补充图1。识别的hBMSCs EVSC移植后2周。冰冻切片的兔子眼睛移除在移植后2周hBMSCs只与DAPI染色(没有抗体,电池板a - c)或孵化与二次抗体只(D-F)。所有的部分都与DAPI counter-stained(蓝色)。缺乏核染色EVSC展示了特定的反人类细胞核染色抗体如图2所示。规模100µm酒吧。Ab -抗体。补充图2。移植hBMSCs位于血管EVSC之间的隔间。冻结部分眼睛被移植后4天DiI-labeled hBMSCs(红色,B & D)沾抗体针对平滑肌肌动蛋白(SMA、绿色、C和D)和使用荧光显微镜拍照。 Sections were counter-stained with DAPI (blue, A &D). Scale bar 100 µm. Supplementary Figure 3. Representative fluorescent images of a non-transplanted rabbit eye demonstrating the tissue autofluorescence. Frozen sections of non-transplanted eyes were stained with DAPI and photographed with a fluorescent microscope using a similar exposure time (200 msec) used for photographing the anti-human nuclei antibody staining of transplanted eyes. ONL – outer nuclear layer; OS – outer segments; CH- choroid; SC-sclera. Scale bar 100 µm.