文摘

间充质干细胞(msc)的一个最有前途的成体干细胞在细胞疗法临床应用。大型低温贮藏技术的发展,如玻璃化,msc是临床治疗的先决条件。二甲亚砜(DMSO)和乙二醇(EG)的两种类型的冷冻保护剂广泛用于细胞玻璃化。然而,DMSO溶液的影响,如生物学特性和转录组配置文件的msc低温贮藏后仍然未知。在目前的研究中,可行性,immunophenotype细胞表面标记,增殖,分化能力和全球基因表达的恒河猕猴骨骨髓来源msc玻化用DMSO和如进行了研究。结果表明,玻璃化不影响形态、表面标记,和分化的msc、和DMSO溶液相比,如更好的保护细胞生存和增殖。最重要的是,玻璃化导致大量记录的变化msc保存使用DMSO溶液或如。这份报告是首次考察DMSO溶液的影响,如全球干细胞的基因表达。这些结果将有利于理解生物过程参与MSC玻璃化,将有助于提高低温贮藏协议维护转录组身份高cryosurvival临床前研究和临床长期储存。

1。介绍

间充质干细胞是纺锤状呈容易隔离的成体干细胞,文化,和扩大在体外。间充质干细胞可以分化为不同的细胞类型在体外和在活的有机体内在适当的条件下,反映出其多功能能力(1]。除了直接转换成分化细胞组织再生,msc的治疗机制包括免疫抑制和生长因子的分泌和促进内源性再生过程。此外,伦理问题越来越少与msc比胚胎干细胞临床应用(2]。因此,msc可用于治疗各种临床情况和被认为是最有前途的一个成体干细胞在细胞疗法和再生医学临床应用。再生治疗的成功与msc在临床试验中需要大量的细胞。例如,大约10⁶每公斤体重和msc 10⁸msc病人输注细胞疗法。然而,长期培养的msc可以导致的损失祖属性和产生恶性转变由于细胞分化相关基因表达的变化(3,4),改变细胞和线粒体形态、活性氧的生成,降低抗氧化能力(5]。因此,最优的低温贮藏技术的发展是一个大规模的临床治疗(msc和存储的先决条件6]。

低温贮藏提供了一种实用和有效的方法维持干细胞的效力较低的成本和更少的劳动。传统上,msc在缓慢冷却速率使用低温贮藏DMSO作为冷冻保护剂。细胞冷冻剂含有5 - 10% DMSO打包到cryovials在计算机编程冰箱和冷冻冷却速率−−1°C /分钟的80°C之前在液态氮冷冻存储(7,8]。玻璃化冷冻保存的过程中使用高浓度的冷冻保护剂和快速冷却速率,及时将玻璃化解决方案转换为一个无冰的形成玻璃态冷却期间(9,10]。近年来玻璃化已经得到普及,反映成本效益和节省时间的特性,和该技术已成功用于胚胎的冷冻保存,卵母细胞、胚胎干细胞、组织和器官(11,12]。二甲亚砜广泛用于细胞缓慢冷冻和玻璃化冷冻保存,因为其优越的membrane-penetrating和水位移特性。先前的研究已经报道,msc在10% DMSO的长期为了不影响增生性特点,衰老,核型,msc的可塑性13]。然而,其他研究显示细胞DMSO的负面影响。DMSO诱导细胞凋亡的细胞通过细胞凋亡蛋白酶活化和质膜孔隙的形成,改变ATP合成、mtDNA复制和线粒体功能(14,15]。此外,不良反应,包括恶心、头痛、低血压、高血压、腹泻、腹部绞痛,已报告的病人注射了低温贮藏干细胞用DMSO作为冷冻保护剂(16,17]。最近的研究表明,传统的缓慢冻结可能导致凋亡细胞死亡和细胞周期调节基因表达的msc (18,19]。另外,另一个穿透冷冻保护剂如被用于多种细胞类型的缓慢冷冻和玻璃化,包括精子、卵子,卵泡,胚胎,msc (20.- - - - - -23),如有被认为是一个更合适的渗透比DMSO溶液的冷冻保护剂,反映其低极性和分子质量,降低毒性,和更高的渗透系数(24]。防冷冻的角色和附加两个渗透冷冻保护剂对全球的影响基因表达,然而,并没有研究和比较msc的低温贮藏。

恒河猕猴是生物医学研究中最广泛使用的实验动物由于其遗传、生理、行为、和人类神经系统相似,猕猴提供了出色的平移有效性在临床前研究25]。本研究旨在比较DMSO溶液的冷冻保存效果,如在玻璃化的恒河猕猴msc和完善cryosurvival msc。此外,进一步影响玻璃化和DMSO如全球msc的基因表达是研究促进未来msc在再生医学中的应用。

2。材料和方法

2.1。动物

三个雄性恒河猴(2岁)被用作骨髓捐赠者。骨髓检索的过程被批准通过的制度动物保健和使用委员会昆明科技大学和执行按照指南的护理和使用实验动物。

2.2。准备和msc的文化

来源于msc的骨头被孤立的胫骨年轻的恒河猴。肌肉组织被小心翼翼地在胫骨。骨骼的末端被削减,骨髓无菌冲十倍使用无菌注射器包含10毫升的杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)(美国纽约Gibco BRL,大岛)补充10% (v/v胎牛血清(的边后卫)(Gibco)和1% (v/v青霉素、链霉素(Gibco)。细胞悬液随后离心机在500年5分钟,浮在表面的被丢弃。接下来,骨髓细胞机械分散成单细胞悬液,播种到10厘米的塑料盘子1×10的密度⁶细胞/毫升。细胞在DMEM培养基培养补充10%的边后卫在孵化器37°C调湿大气的5%股份₂。不依从细胞被移除,媒介是每48小时刷新。十天后,主细胞培养(0)通过通道80% confluency用0.25%胰蛋白酶(Gibco)。resuspended在细胞培养基稀释比例为1:3和扩大新塑料培养皿通道1。的形态、表面标记和分化潜能的msc被确定通过3。msc扩展到通道5,随后被玻璃化和全球基因表达检测如下所述。

2.3。流式细胞术分析Immunophenotype msc的表面标记

msc的表面标记物的表达是研究利用流式细胞术分析(BD生物科学,圣何塞,CA)。所有抗体都购自BD生物科学。大约5×10⁵msc与500年收集和清洗μL (PBS(包含3%的边后卫,PBSF)。100年洗细胞resuspendedμL (PBSF msc的表面标记的分析。每个细胞样本孵化与5μL (10μ克/μL)的反人类的PE-CD44、APC-CD73 FITC-CD90, PE-CD105, PE-CD105, PE-CD59,抗原,B, C, PE-CD45, PE-CD14, PE-CD34, PE-CD11b, PE-CD19,和1 h在冰上PE-HLA-DR抗体,抗体和同形像控制并行使用。与PBSF游离抗体被冲洗掉,随后,这些细胞被resuspended在500年μL PBSF。

2.4。微分效能评估骨骨髓来源msc

2.4.1。脂肪形成的分化

来源于msc的骨头被播种到24-well盘子和培养8×10的密度⁴细胞每12 h。随后,在脂肪形成的分化培养基培养细胞(美国纽约Gibco BRL,大岛)为7天(26]。每3天中被刷新。这些细胞被使用过滤油红O染色(0.2%油红O 60%异丙醇,v/v与PBS) 15分钟,洗3次后固定在4%甲醇。脂肪形成的分化是确认为中性脂质空泡的细胞积累的出现红油红O染色(美国圣路易斯σ)。

2.4.2。成骨分化

来源于msc的骨头被播种到24-well盘子和养殖密度的4×10⁴细胞每12 h。随后,培养基是取代成骨分化培养基(Gibco BRL,宏伟的岛,纽约,美国),进一步培养21天。媒介是每三天更新一次。这些细胞被沾着新鲜茜素红溶液和0.5%与PBS洗3次,其次是固定4%甲醇。成骨分化是确认的外观茜素红染色。

2.4.3。Chondrogenic分化

骨骨髓来源收集msc在15毫升离心管包含大约2×10⁵每管,随后在chondrogenic分化培养基培养(Gibco BRL,宏伟的岛,纽约,美国)。媒介是每三天更新一次。经过21天的分化诱导软骨样的颗粒生成和洗PBS和固定在4%多聚甲醛,嵌入最佳切削温度(10月)嵌入材料(徕卡,位于德国)。丸是使用冷冻切片机切片,和随后,硫酸蛋白聚糖是可视化与1%甲苯胺蓝染色(默克公司,达姆施塔特,德国)10分钟(27]。这些片洗3次与PBS和倒置显微镜下拍照。分化是确认为阿尔新蓝染色的外观。

2.5。玻璃化的msc

三个捐助者的骨骨髓来源msc收获在通道5 confluency玻璃化分析当细胞达到80%。细胞悬液被分成三个相等的整除2×10的密度⁶细胞/毫升。没有低温贮藏的整除之一是24小时亚文化的新媒介,和细胞生存能力,immunophenotype表面标记,增殖和代谢活动随后检查nonvitrified控制(VC)。其他两个整除玻化使用DMSO(美国圣路易斯σ)(VD)或如(美国圣路易斯σ)作为一个插入式冷冻保护剂(VE),分别。玻璃化协议包含一个两步平衡和玻璃化解决方案,分别是(23]。平衡解决方案包含2.8 DMSO溶液或如玻璃化溶液由5.6 DMSO溶液或如70聚蔗糖的18%(美国圣路易斯σ),和0.3蔗糖(美国圣路易斯σ)。所有的解决方案都是基于PBS溶液含有20%的边后卫。简而言之,共有1×10⁶msc是悬浮在50μL平衡解的5分钟,随后与500年混合μL 40年代的玻璃化溶液(步骤1)。玻璃化溶液中的悬浮msc立即转移到1毫升cryovials(美国纽约康宁)和直接在液态氮冷冻(步骤2)。在液氮储存后24 h,细胞被迅速加热cryovial沉浸于37°C水浴5分钟(28,29日]。包含20%的细胞在PBS顺序洗的边后卫补充了0.5,0.25,0 M蔗糖为3分钟。最后,msc在DMEM培养基培养resuspended和补充20%的边后卫24 h。细胞培养使用相同的条件没有玻璃化担任控制。形态、细胞生存能力,immunophenotype细胞表面标记的增殖和代谢活动,和基因表达的msc VC, VD和VE组随后被评为中描述下面的化验。

2.6。细胞生存能力分析

可行的细胞的百分比从陶瓷(VD和VE、职责)和控制(VC)组评估使用一台盼蓝染料排斥试验1:1稀释在PBS(0.4%台盼蓝)。细胞的染色和总数量(约100个细胞)在显微镜下计算使用血细胞计数器。这个评估重复了三次。

2.7。增殖能力和代谢活动

msc的增殖能力和代谢活动玻化(VD和VE)和控制(VC)组决定使用MTS (3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 5 (3-carboxymethoxyphenyl)——(4-sulfophenyl) 2 h-tetrazolium)测定。简单地说,200年μL细胞悬液被播种到96孔板的密度10⁴细胞/。随后,20μL 96年CellTiter水一个解试剂(Promega,北京)添加到每个孵化2 h。甲瓒产品的数量成正比的活细胞数文化。彩色甲瓒测量在96 - 490海里标(0),12、24、48和72 h (30.]。这个评估重复了三次。

2.8。转录组的msc和玻化msc在DMSO,如控制

细胞从VC、VD和VE组收集和resuspended试剂盒中的试剂(豆类,大连,中国)和存储在一个冰箱−80°C,分别。从每个样品的总RNA提取。每组的RNA质量评估使用琼脂糖凝胶电泳,RNA纯度是评估使用NanoPhotometer®分光光度计(IMPLEN、钙、美国)。核糖核酸的浓度测定采用量子位®RNA检测装备在量子位2.0荧光计(美国生命科技,CA)。6000年使用RNA RNA完整性评估纳米生物分析仪的分析工具2100系统(安捷伦科技、钙、美国)。最后,RNA-seq程序进行Novogene有限公司(中国,北京)。总金额的3μ每个样本作为g RNA RNA样本的输入材料准备。测序库生成使用NEBNext®超™RNA图书馆准备包Illumina公司®(美国内)根据制造商的指示,和索引代码添加到属性序列中每个样本。简单地说,信使RNA从总RNA纯化使用poly-T oligo-attached磁珠。碎片是一头在高温下使用二价阳离子执行NEBNext第一链合成反应缓冲区(5×)。使用随机六聚物合成第一链cDNA底漆和M-MuLV逆转录酶(前体)。两样东西互补脱氧核糖核酸合成随后执行使用DNA聚合酶和核糖核酸酶H .其余逼近转化成钝结束通过核酸外切酶/聚合酶的活动。腺苷酸后3结束的DNA片段,NEBNext适配器发夹环结构是结扎准备杂交。选择cDNA片段长度,优惠150 ~ 200 bp的图书馆片段被纯化使用AMPure XP系统(美国贝弗利贝克曼库尔特)。随后,3μL用户酶(美国内)是用于size-selected,在37°C adaptor-ligated cDNA 15分钟紧随其后PCR前5分钟在95°C。随后,PCR进行使用Phusion高保真DNA聚合酶,普遍的PCR引物,和索引(X)底漆。最后,PCR产物纯化(AMPure XP系统),2100年安捷伦生物分析仪和图书馆质量评估系统。index-coded样本的聚类进行芝加哥期货交易所集群生成系统使用TruSeq PE集群装备v3-cBot-HS (Illumina公司)根据制造商的指示。集群生成后,图书馆准备被测序的Illumina公司Hiseq平台150个基点和125个基点/ paired-end读取生成。

2.9。差异基因表达验证使用中存在

几个选定的(表的差异表达基因1)在VC、VD和VE组中发现RNA-Seq进一步验证使用中存在。短暂,总RNA提取从msc VC, VD和VE组使用试剂盒试剂(豆类,大连,中国)。RNA是首先分为一个水相用氯仿,随后用异丙醇沉淀,用75%的乙醇清洗,最后在无菌DEPC水中可溶性。互补DNA(互补)随后合成使用PrimeScript RT试剂盒(豆类、大连、中国)根据制造商的指示。高纯度gene-specific引物(表1),包括管家基因glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH),是商业合成(Shenggong、上海、中国)。执行的特定基因的互补是量化Bio-Rad CXF实时PCR系统。所有的实验进行了一式三份,数据分析使用2^−△Ct程序。

2.10。统计分析

这些实验的结果提出了作为±SD方法。细胞生存能力的统计学意义,增殖,VC之间和代谢活动,VD和VE组测定使用SPSS 17.0软件与单向方差分析(方差分析)和费舍尔的保护至少显著差异测试。一个被认为具有统计显著性值小于0.05。差异基因表达分析的VC, VD和VE组都使用了DESeq R包(1.18.0)。DESeq提供统计程序来确定微分表达数字基因表达数据使用一个基于负二项分布模型。由此产生的值调整使用Benjamini和业务控制错误发现率的方法。基因的调整值< 0.05根据DESeq被指定为差异表达。基因本体论(去)富集分析差异表达基因的使用GOseq R包,实现基因长度偏差的纠正。去与纠正值明显小于0.05被认为是富含差异表达基因。

3所示。结果

3.1。形态、表面标记资料,和骨骨髓来源msc分化的潜力

在初代培养,来自猕猴骨髓msc增长胶着地塑料盘子以分散的方式。殖民地和出现不均匀形成的细胞被称为通道0。msc开始出现同质呈细长,与单一核纺锤状特征之后的文化(图1(一))。MSC殖民地通道0与进步的亚文化,扩展到通道3和MSC的形态通过异构呈形状(图3显示1 (b))。msc的识别是在通道3所示的先前的研究[31日,32]。骨头的表面标记资料来源于msc使用流式细胞仪分析了通道3。结果表明,积极表达高水平的细胞CD44, CD73, CD90、CD105, CD59,和抗原,B, C,但负面表达CD45 CD14, CD34, CD11b CD19和HLA-DR(图1 (c))。msc的脂肪形成的细胞分化形成大量的中性脂质颗粒在细胞质中发现使用油红O染色(图1 (d))。msc显示矿物积累的细胞成骨分化和骨结节形成确定使用茜素红染色(图1 (e))。chondrogenic分化的细胞msc被确定使用阿尔新蓝染色(图1 (f))。

3.2。玻璃化的msc通道5

3.2.1之上。细胞相比,陶瓷的使用如玻化msc用DMSO显示较低的细胞生存能力,增殖和代谢活动

玻璃化显著减少的可行性msc使用DMSO (VD, 54.93±13.07%)或如(VE、87.31±4.36%)渗透的冷冻保护剂相比nonvitrified对照组(VC 98.83±1.03%),和相对于如DMSO cryoprotection较少的细胞(图2(一个), )。整个细胞代谢活动的VC, VD,已经在不同的时间点后24 h文化如图2 (b)。结果表明,细胞的增殖和代谢活动的VD组显著低于VC和VE组在12日24、48和72 h(图2 (b), )。然而,没有观察到的细胞之间的差异VC和VE在任何时间点(图2 (b), )。温暖了细胞的形态后24 h亚文化如图2 (c)。没有明显的形态学变化观察三组中,除了confluency VD的稀疏而VC和VE组。

3.2.2。表面标记物的表达并不影响玻璃化

亚文化变暖和后24 h后,陶瓷的表面标记资料msc VD和VE组相比从控制细胞(VC)。所有组显示的msc CD44的积极immunophenotype, CD73, CD105, CD59抗原,B, C,和CD90 CD45的负面immunophenotype, CD14, CD34, CD11b CD19和HLA-DR(图3(一个))。

3.2.3。分化效力不影响玻璃化

类似于VC组,细胞的玻化msc VD或已经分化成脂肪细胞,骨细胞和软骨细胞(图3 (b))。脂肪形成的诱导后,大量的中性脂质水滴沾油红观察细胞的细胞质从VC, VD和VE组(负控制VD和已经被显示在图可以在网上https://doi.org/10.1155/2017/3893691)。成骨诱导后,玻化msc (VD和VE)和控制细胞(VC)提出的聚合micronodules或钙沉积和茜素红染色。温暖msc和控制细胞的chondrogenic分化可以使用阿尔新蓝染色观察。

3.3。转录组的msc改变在大规模使用DMSO溶液或如玻璃化

显著调节基因的数量从VC在msc, VD和VE组总结表2。结果表明,玻璃化和变暖24小时后,msc低温贮藏用DMSO溶液或如(VD或VE组)提出了大量的改变记录相比从nonvitrified控制(VC组)。维恩图的结果分析三组基因调控的图所示4(一)。结果表明2524个差异表达基因在VD和VC之间,6987已经和VC之间的差异表达基因,2766 VD和VE之间的差异表达基因。控制msc的转录组配置文件相比,VE玻化msc显示更多的影响比那些细胞基因表达的差别,对这些VD。聚类分析根据所示的维恩图4(一),共有7943个差异表达基因被发现后玻璃化和变暖从VC msc, VD, VE组。热图显示三组(图中7943个差异表达基因4 (b))。根据维恩图如图4(一),461个基因在三组差异表达同时提出一个十字路口在VC中,VD、VE。461个基因差异表达的热图三组呈现在图4 (c)。基因本体论(去)的富集分析msc的VC之间,VD,已经呈现在图5。图显示分布的生物方面的本体方面,提出了在生物过程中,细胞组件,和分子的功能。

3.4。差异基因表达验证使用中存在

差异表达基因分离分成几类,根据他们的功能,包括免疫通路、细胞信号、表观遗传调控、细胞分化、细胞粘附和信号转导,代谢途径和细胞凋亡。10所选基因决定使用中存在确认转录组的结果概要文件RNA-Seq msc根据原来的分析结果,包括——或差异表达基因表达下调和相应的倍数。10个基因的表达水平在msc从控制(VC)和陶瓷集团(VD和VE)在图进行了总结6。免疫相关基因编码蛋白通路(DUSP10),细胞信号(PLA2G4A PRKCD)、表观遗传调控(DNMT3L, H2AFZ MBD3),细胞分化(生活),细胞粘附和信号转导(ITGAV),代谢途径(RASL 12),和细胞凋亡(FAS)三组之间的差异表达,符合使用RNA-Seq结果决定。基于这些结果,如的影响和DMSO msc玻璃化后的生物学特性和变暖被证实。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们使用恒河猕猴模型建立骨骨髓来源间充质干细胞,探讨使用两个常见的穿透玻璃化冷冻保护剂的作用和自我更新的能力在体外msc分化和全球基因表达。来自骨髓msc的猕猴异构的特点,呈纺锤状形态,形态一致,之前报道的骨骨髓来源msc (33]。表达的细胞典型的正面和负面的msc的表面标记33]。这些结果表明,积极的和消极的表面分子都表达了在人类和猕猴。msc tri-lineage分化为脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞在各自的诱导条件下识别msc被认为为主要过程的功能细胞疗法的能力(33]。孤立的猕猴msc在当下研究猴子msc的定义是一致的,与一个典型的形态、细胞表面标记表达式,和tri-lineage分化力量如前所述34]。

低温贮藏中扮演一个重要的角色在维持细胞功能的组织工程、细胞移植,药物测试,和未来的治疗适应症(35]。传统上,DMSO作为在常规慢速冷冻和玻璃化冷冻保护剂代理协议msc (36]。由于副作用,如恶心、发冷、低血压、心律失常,被报道在人类干细胞注入低温贮藏期间,努力发展与低水平的DMSO低温贮藏协议或DMSO-free条件需要避免毒性作用。月亮和同事保存人类amnion-derived msc使用DMSO-free玻璃化的协议和一个两步过程。msc在解决方案包含40%的乙二醇,玻化聚蔗糖18%,蔗糖0.3米,和20%的边后卫40年代。结果表明84.3±3.2% postthaw细胞生存能力(23]。些许和同事玻化人类脐带沃顿jelly-derived msc使用月球的协议,和他们的结果显示95.54±2.30% postthaw可行性和保留的表面抗原和tri-lineage分化(37]。然而,到目前为止,防冷冻的角色差异DMSO和如玻璃化的msc还没有被研究过。本研究比较了两种不同的冷冻保护剂(DMSO和EG) cryosurvival,增殖,分化潜力的猕猴骨骨髓来源msc。结果表明,postwarmed msc玻化用DMSO溶液的可行性,如为54.93±13.07%和87.31±4.36%,分别。msc玻化的可行性,如在目前的研究是在同一水平上比人类amnion-derived和胎儿liver-derived msc玻化,如使用一个类似的协议在先前的研究23,38),与先前的研究相比,低水平的如用于本研究(分别为31.33%和40%,v/v)。灵长类MSC玻璃化冷冻保护剂的最佳浓度应该进一步研究和优化。

在目前的研究中,msc的可行性玻化使用DMSO明显低于使用如和VD组的细胞稀疏confluency文化后24 h和较低的代谢活动而msc的增殖和对照组。在玻璃化,高浓度的冷冻保护剂,这可能会导致细胞毒性的影响。因此,DMSO-free协议传统缓慢冻结或玻璃化开发优化干细胞冷冻保存(38,39]。比较研究调查的cryosurvival DMSO溶液的影响,如诱导多能干细胞和沃顿商学院的果冻组织使用缓慢冷却方法证明,如有更好的比DMSO cryoprotection [19,24]。玻璃化msc与高水平的如DMSO也取得了理想的细胞生存能力(23,38]。DMSO溶液相比,如有毒猕猴精子,老鼠和人类胚胎(20.,40,41),这表明可能更适合猕猴MSC玻璃化。然而,没有研究直接比较的影响如和DMSO溶液玻璃化的灵长类动物msc。在目前的研究中,猕猴msc玻化的可行性和DMSO玻化,如低于细胞。这一结果表明,如更少的有毒和提供了更多的猕猴cryoprotection MSC比DMSO溶液玻璃化。DMSO本质上是对细胞有毒性作用,能激活细胞凋亡通路,导致线粒体膜损伤和posttransplantation并发症(14,17),可能的原因之一的msc保存DMSO显示cryosurvival率低和代谢活动。此外,如渗透系数和DMSO来源于msc的猕猴骨头是未知的。精子膜的渗透性研究表明,如对恒河精子冷冻可能最合适的注册会计师由于其高渗透系数(42]。我们建议猕猴MSC膜更渗透如DMSO溶液。如可能导致更少的渗透压力在添加前冷冻保护剂玻璃化和冷冻保护剂的移除后变暖,因此可以提供足够的cryoprotection和导致更少的细胞损伤。

最近的研究表明,尽管可塑性的基本特征和multipotency msc没有改变与传统缓慢冻结DMSO溶液的低温贮藏后,apoptosis-related基因的表达,如BAC、bcl - 2、BAX、P53、P21,影响(7,19]。然而,据我们所知,msc低温贮藏后的高通量基因表达谱通过传统缓慢冻结或玻璃化方法没有被记录。然而,由缓冷或玻璃化冷冻保存对基因表达有深远的影响,主要是在生殖细胞。例如,玻璃化小鼠卵泡apoptosis-related基因的表达,影响受精卵和胚胎43- - - - - -45];缓慢冷冻和玻璃化不同修改人类中期ⅱ卵母细胞的基因表达谱(46]。研究表明,暴露在DMSO溶液,即使在低浓度(0.02 - -1.0%),影响胚胎干细胞的表观遗传的状况和拟胚体,导致upregulation DNA甲基转移酶的表达和变化的全基因组DNA甲基化资料与表型的变化(47]。同样,内皮细胞的接触高水平的如导致改变整个基因组的基因表达分析证明了微阵列(48]。在目前的研究中,玻璃化使用DMSO溶液或如导致大量记录的变化猕猴骨骨髓来源msc,表明玻璃化有显著影响整个基因组的表达。乙二醇冷冻保护剂的毒性是一个比DMSO溶液。结果表明,msc玻化如显示高cryosurvival和DMSO溶液扩散比,符合低毒性的。然而,如影响更多的基因的表达比DMSO在目前的研究。msc玻化用DMSO溶液的表观遗传或如也受到影响,以及DNA甲基转移酶表达的upregulation msc玻化如(DNMT1和DNMT3A)和DMSO (DNMT3L)观察。类似于先前的研究结果报道,全球基因表达和表观遗传的胚胎干细胞被暴露在DMSO溶液的影响(46,47]。值得注意的是,在目前的研究中,msc被玻化使用相同的协议,但是不同的注册会计师(DMSO和EG)。众多全球基因轮廓的变化导致注册会计师和玻璃化。然而,在全球之间的基因表达差异新鲜msc和DMSO溶液或如组可能反映了冷却/变暖过程。相比之下,冷却/气候变暖对全球的影响基因表达之间的msc在DMSO和如团体可能被排除在外。CPA的临界浓度和冷却/变暖周期的影响在全球基因是未知的,以及对全球的影响基因的表达是否永久或暂时没有决定在目前的研究。还需要进一步的实验来阐明这些问题。此外,在目前的研究中,虽然玻璃化使用DMSO溶液或如导致msc、大量记录的变化和较低的可行性,增殖能力,和代谢活动观察msc玻化用DMSO,形态学,表面immunophenotypes, tri-lineage msc分化的潜力并没有受到影响。最近,信使rna和蛋白质的区别揭示了通过测量全基因组转录和蛋白表达在小鼠肝脏,这表明调节蛋白mRNA水平而不是依靠一个简单的中心法则是复杂的49]。此外,卵巢癌的研究显示,通过蛋白质改性蛋白质显示功能和交互与其他蛋白质而不是高或低表达水平的信使rna和蛋白质通过proteogenomics透露50]。这种现象可以解释为什么msc的影响基因表达改变,但形态的生物学特性,表面immunophenotypes,分化能力在目前的研究没有受到影响。

总之,玻璃化使用DMSO溶液或如不影响形态、表面标记,msc分化。然而,msc玻化使用DMSO显示可怜的细胞生存能力和扩散能力相比陶瓷的使用。msc的玻璃化使用DMSO溶液或如导致大量记录相比的变化控制的细胞。这份报告是第一个显示DMSO溶液的不同的影响,如全球基因表达,如对干细胞的表观遗传剖面的影响。这些结果将有利于理解生物过程参与msc的玻璃化,有助于改善低温贮藏协议维护转录组身份高cryosurvival临床前研究和临床长期储存。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Xufeng傅和yap燕了同样的工作。

确认

作者要感谢博士你好男人的援助的准备手稿。这项工作通过赠款财务支持中国国家重点研究和发展项目的(2016 yfa0101403),中国国家自然科学基金(31660346和31660346),云南青年领袖在学术和技术人才项目(2012 hb040),和云南省卫生科技项目(2017 ns248)。

补充材料