同种异体的脂肪Tissue-Derived间充质干细胞改善急性肝损伤的狗

文摘

tissue-derived脂肪间充质干细胞(AT-MSCs)是一个有吸引力的来源细胞治疗一些疾病,包括急性和慢性肝衰竭,不仅在人类医学也是兽医。然而,在兽医,没有研究报道狗AT-MSCs对肝损伤的影响。本研究的目的是调查的影响外源的AT-MSCs在狗和四氯化碳急性肝损伤的治疗效果的比较AT-MSCs通过周围静脉(PV)或移植脾静脉(SV)。AT-MSCs通过光伏或SV移植后,血清肝酶显著降低,SV注射与PV注射更有效。通过比较的数量道AT-MSCs在肝脏,SV注入明显比光伏注射更有效。信使rna表达水平的促炎细胞因子,如il - 1、il - 6,引发和干扰素γ,在肝脏明显减少,但这些抗炎细胞因子,如il - 4和il - 10, HGF,和VEGFA第一AT-MSC注射后明显增加。这些发现表明,外源的AT-MSCs注入通过光伏或狗SV改善急性肝损伤,并通过SV AT-MSCs注入提供更有效的改进。

1。介绍

最近,间充质干细胞(MSC)移植研究作为各种疾病的治疗方法。msc的共同组织的起源是骨髓和脂肪组织。报告显示,msc可用于改善急性和慢性肝衰竭动物模型(1- - - - - -3]。此外,一些报道称,骨骨髓来源msc (BM-MSCs)对肝硬化患者的治疗效果和肝功能衰竭4- - - - - -6]。然而,可用骨髓的数量通常是获取过程是侵入性不足。相反,脂肪tissue-derived msc (AT-MSCs)也有类似的生物属性BM-MSCs [7),在体内大量存在。因此,AT-MSCs可以反复收割通过简单和微创程序。

在兽医,AT-MSCs一些物种,包括狗、猫、马,已经被隔离和表征,研究和临床试验AT-MSCs已经报道了一些疾病,如关节炎、炎症性肠病,慢性肾脏疾病,肌腱炎8,9]。然而,没有报告评估AT-MSCs肝脏疾病的影响。因此,本研究旨在确定的影响外源的犬AT-MSCs对四氯化碳所致急性肝损伤(三地₄),通过不同的移植途径AT-MSCs注射的治疗效果。

2。材料和方法

2.1。动物模型

9个健康的米格鲁猎犬(9个完整的男性;平均年龄:1.5岁;平均体重:12.2公斤)被用于这项研究。狗依照动物保健研究所实验动物资源的指导方针,日本兽医和生命科学大学,日本。狗被分配控制,周围静脉管理(PV),或脾静脉管理(SV)组( 狗/组)。机构日本兽医和动物保健和使用委员会生命科学大学批准了实验设计(S27S-13)。实验研究总结在图的设计1。

2.2。诱导急性肝损伤

实验性急性肝损伤被注入创新领导力的诱导₄。在第一天,狗注射20μ克/公斤medetomidine(日本Zenyaku Kogyo)静脉注射镇静。然后,狗CCl腹腔内注射₄和光;(kouichi玉米油稀释1:1)在超声指导下剂量的0.25毫升/公斤。

2.3。犬AT-MSCs

2.3.1。隔离和犬AT-MSCs文化

脂肪组织无菌收集从镰状韧带脂肪麻醉狗的对照组在4周诱导急性肝损伤。组织被广泛在PBS,剁碎,用胶原酶消化I型(Sigma-Aldrich) 37°C与间歇摇晃45分钟。洗后用PBS和离心法,包含基质血管的颗粒分数resuspended,透过100μm尼龙网,孵化在高葡萄糖杜尔贝科的修改鹰中(H-DMEM)补充10%胎牛血清(的边后卫;antibiotic-antimycotic Nichirei生物科学)和1%的解决方案(热费希尔科学)在湿润的气氛中有5%的公司₂在37°C。独立的细胞通过改变介质,和附加的细胞与PBS洗两次。此后,每3 - 4天中取代了。在80 - 90%融合,细胞分离与trypsin-EDTA (Sigma-Aldrich)和通过反复的解决方案。

2.3.2。表征AT-MSC表面标记

通道2 AT-MSCs被流式细胞术分析。细胞被置于fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)管(BD生物科学;2×10⁵细胞/管),用流式细胞仪缓冲区(PBS包含2%的边后卫),阻断Fc受体与犬Fc受体结合抑制剂(热费希尔科学),然后用以下孵化荧光素- (FITC)或藻红蛋白(PE)共轭抗体:anti-CD14-FITC (BD PharMingen) anti-CD29-PE (BioLegend) anti-CD34-PE(研发系统),anti-CD44-PE (BioLegend) anti-CD45-FITC (eBioscience)和anti-CD90-PE (eBioscience)或各自同形像控制表中列出1。流式细胞仪的细胞被洗两次缓冲区和resuspended在500年μl流式细胞仪缓冲区。评估了荧光流式细胞术在FACSCalibur仪器(BD生物科学)。数据分析使用WinMDI 2.9分析软件。

2.3.3。分化分析

成骨分化,通道2 AT-MSCs被播种在6-well板(5.0×10³细胞/厘米²)和孵化与10%的边后卫和1% H-DMEM补充antibiotic-antimycotic 24小时的解决方案。中被改为成骨的介质(细胞应用程序)10]。媒介是每周更换2次。成骨的分析,矿床定量分析了冯Kossa染色后21天。

脂肪形成的差异化,通过2 AT-MSCs被播种在6-well板块(8×10³细胞/厘米²)和培养在H-DMEM补充10%的边后卫和1%直到confluency antibiotic-antimycotic解决方案。然后,改变了媒介犬脂肪细胞的分化培养基(细胞应用程序)。媒介是每周更换2次。分析了脂肪生成油红O染色后21天。

2.4。AT-MSC移植

AT-MSCs被贴上CellTracker CM-DiI(热费希尔科学)注射前根据制造商的指示和悬浮在0.9%的盐水(图2)。光伏组注射标记AT-MSCs通过剂量的2×10头静脉⁶细胞/公斤。SV组注射标记AT-MSCs通过脾静脉2×10的剂量⁶细胞/公斤超声指导下。在第三天,PV和SV组注射通道3 AT-MSCs然后注入通道4天AT-MSCs 8。对照组注射同样体积的0.9%通过头静脉盐水。所有的狗都注射标记AT-MSCs或0.9%生理盐水与medetomidine镇静后(20μ通过静脉注射g / kg)。

2.5。评价白细胞计数和肝酶的活动

评价急性肝损伤、肝酶水平和白细胞每天测量在研究过程中。血样经颈静脉和转移到试管中EDTA和正常血清。在4°C血清被离心分离15分钟并存储在−80°C到化验。

白细胞计数得到使用血液学分析仪(sys - poch - 100 - i),和水平的血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)测定使用一个自动化的临床化学分析仪(富士Dry-Chem)。

2.6。腹腔镜肝脏活组织检查

所有的狗都受到腹腔镜肝脏活检在7天。狗在药用和麻醉酒石酸布托啡诺(明治精华制药;通过皮下注射0.2毫克/公斤)和异丙酚(Mylan;通过静脉注射7毫克/公斤)。与异氟烷麻醉维持(DS制药动物卫生)整个过程。在无菌条件下,狗背躺着的位置。一个套管针套管插入尾腹侧中线在1 - 2厘米的脐哈森技术(11]。腹膜腔膨胀了二氧化碳的最大压力12毫米汞柱,和套管针套管被允许插入一个5毫米杯活检仪器进入腹部。肝脏样本通过掌握肝实质与一杯活组织检查仪器,然后把组织样本和温和的牵引。

2.7。组织学评价

15天,每个狗安乐死的静脉注射过量戊巴比妥后收集血液样本。从每个肝组织样本得到叶和尾叶的肺。样品在7和15天在4%多聚甲醛固定的组织学检查或储存在−RNA提取80°C。肝组织学检查的样品从每个叶脱水和嵌入在石蜡,然后分段4μ米厚度。部分被苏木精和伊红染色())和马森的三色的(太)。

量化组织的纤维化是基于5领域采取随机从每个叶幻灯片。纤维化面积的百分比计算每个图像使用图像软件1.45版(https://imagej.nih.gov/ij/)。

2.8。免疫组织化学染色

免疫组织化学进行串行部分使用标记streptavidin-biotin方法与主抗体表中列出2。的部分处理0.03% H₂O₂33%甲醇室温下30分钟阻断内源性过氧化物酶,然后接受抗原(表检索治疗2),紧随其后的是一个孵化在4%牛奶溶液在室温下30分钟。最后,每个抗原的反应是可视化的,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride色原体与苏木精复染色。

量化的炎性细胞浸润、髓过氧物酶和CD163阳性细胞数在5个领域采取随机从每个幻灯片。

2.9。道的数量评估AT-MSCs

肝脏和肺样本固定在4%多聚甲醛在一夜之间在4°C。cryosectioning,样本洗在30%蔗糖,嵌入在10月化合物(樱花Finetek)和冷冻。部分被削减时8μ米厚度。AT-MSCs贴上CellTracker CM-DiI是在显微镜下计数为每个肝脏和肺在五个随机领域样本。

2.10。实时定量PCR分析细胞因子的表达

细胞因子表达在肝脏样本是由实时定量PCR。使用试剂盒+总RNA提取RNA净化设备根据制造商的指示(热费希尔科学)。1的互补脱氧核糖核酸合成μg总RNA使用随机引物和GoScript逆转录酶系统(Promega),根据制造商的指示。实时rt - PCR分析使用SYBR绿色实时PCR反应混合液(Promega)来确定的mRNA水平白介素- 1 (IL)βil - 10、il - 4、il - 6,引发,肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子α)、γ干扰素(干扰素γ)、肝细胞生长因子(HGF)和血管内皮生长因子(VEGF)的引物序列表中列出3。放大条件为2分钟95°C,紧随其后的是40 95°C的周期为15秒和60°C,持续60秒。40个周期后,解离曲线生成验证每个引物的特异性。所有的反应都是在重复执行。目标基因的表达水平是规范化的ΔΔCt甘油醛3 -磷酸脱氢酶和量化的方法。

2.11。统计分析

所有数据提出了均值±标准差。两组之间的差异与韦尔奇的比较t以及。多个组之间的差异是由单向或双向方差分析评估,然后差异比较使用Tukey-Kramer事后测试。的值 被认为是具有统计学意义。统计分析使用Excel 2010和插件软件Statcel 3。

3所示。结果

3.1。表征AT-MSCs

AT-MSCs成功培养和扩展。大多数的细胞表达了建立MSC标记CD29 (95.2%)、CD44(91.6%),和CD90(99.4%),和很少CD14表达(0.8%)、CD34(0.6%)、或CD45(0.7%)(图3)。展出的AT-MSCs multilineage可塑性的证明了他们的脂肪形成的潜力和成骨分化,而未分化细胞(图4)。

3.2。AT-MSC移植对肝酶水平的影响和白细胞

在注入创新领导力₄(14天、7),证实体检,完整的血细胞计数、血液化学是正常对照组的镰状韧带切除脂肪收集脂肪组织。因此,切除的镰状韧带脂肪并不影响从第一天在这个研究。连续变化的肝酶水平和白细胞在图所示5。诱导急性肝损伤后肝酶水平和白细胞明显增加。ALT在PV和SV团体第一AT-MSCs减少注射后的第二天,但对照组从第五天下降。AT-MSCs第一次注射后,ALT显著降低光伏和SV小组第四天(光伏组:5635±650 U / L;SV:集团5023±223 U / L)与对照组(8186±1576 U / L) ( 从第四天)。AST也显著降低光伏和SV组与对照组相比,在第四天(对照组:3388±511 U / L;光伏组:1565±611 U / L;SV组:695±175 U / L)。AST SV组也显著降低了与光伏组第五天(131±65 U / L与753±92 U / L) ( )。第一次注射后AT-MSCs, ALP显著减少SV组与对照组相比在第五天(对照组:896±295 U / L;光伏组:729±128 U / L;SV组:384±124 U / L) ( )。高山SV组也显著降低了与光伏集团在第二次注射AT-MSCs 9天(243±49 U / L与494±65 U / L)。SV组的白细胞也减少AT-MSCs第一次注射后,和SV组显著减少与控制和光伏组5天(对照组:18133±1724 /μl;光伏组:18300±2605 /μl;SV组:12066±585 /μl) ( )。

3.3。急性肝损伤的纤维化和炎症细胞浸润

7到15天,炎症细胞浸润,中央静脉周围肝细胞变性和萎缩,出血组(图观察6)。

中央静脉周围胶原沉积是所有组(图中观察到7)。纤维化面积的比例明显高于对照组(10.0±1.7%)相比,光伏和SV团体在第七天(光伏组:4.6±1.6%;SV组:2.7±0.8%)( )。在15天,纤维化面积的比例也显著降低光伏和SV组与对照组(对照组:8.9±1.4%;光伏组:3.7±1.0%;SV组:2.5±0.5%)( ),但第七天没有统计上显著的差异和15组。

中性粒细胞和巨噬细胞被染色髓过氧化酶(MPO)和CD163,分别。炎症细胞的数量(MPO的总和⁺和CD163⁺细胞)较低的PV和SV集团在第七天(39.0±3.8 PV组:细胞/高通滤波器;SV组:32.2±3.5细胞/高通滤波器)与对照组相比,在第七天(对照组:45.2±10.2细胞/高通滤波器),但各组之间没有显著差异。在15天,炎症细胞的数量明显高于对照组(77.8±8.4细胞/高通滤波器)与PV和SV集团(40.4±6.1 PV组:细胞/高通滤波器;SV组:32.0±4.5细胞/高通滤波器)( )(图8)。

3.4。根据路线比较道AT-MSCs数字注入

评估的数量道AT-MSCs路线的基础上注入,AT-MSCs贴上CellTracker CM-DiI观察肝脏和肺组织样本(数据9(一个)- - - - - -9 (d))。前7天,第二注入AT-MSCs AT-MSCs数量SV组的肝细胞(11.3±2.1)2.8倍高于光伏组细胞(4.0±0.8)( )(图9 (e))。15天的AT-MSCs SV组的肝脏细胞(181.7±31.6)3.7倍高于光伏组细胞(49.0±11.0)( )(图9 (f))。然而,道AT-MSCs SV组的肺组织样本中细胞(8.0±1.6)显著低于光伏组细胞(56.0±16.1)( )(图9 (g))。

3.5。AT-MSCs对mRNA表达的影响在CCl引起的急性肝损伤₄

3.5.1。促炎细胞因子

肿瘤坏死因子α表达式中没有不同的团体在7和15天。然而,il - 1β、il - 6、引发和干扰素γmRNA表达显著减少SV组与对照组相比,在这两天7和15 ( )。il - 6和TNFα光伏组的mRNA表达7天也降低与对照组相比 )(图10)。

3.5.2。抗炎细胞因子

mRNA的表达抗炎细胞因子il - 4和il - 10等mRNA表达7天在SV组相比显著增加控制和光伏组( )。il - 4和il - 10 mRNA表达15天SV组也减少了与光伏集团( )(图10)。

3.5.3。HGF和VEGFA

HGF mRNA表达7天SV组增加的价格相比对照组( )。VEGFA mRNA表达7天在PV和SV团体也增加的价格相比对照组( )(图10)。

4所示。讨论

我们的研究结果表明,外源的AT-MSCs改善急性肝损伤的狗。在这项研究中,AT-MSCs基于移植途径的疗效比较CCl犬急性肝损伤引起的₄注入。血清生化参数反映肝胆管的损伤,如明显增加ALT, AST,高山的水平。第一AT-MSC注射后,ALT和AST水平明显降低光伏和SV组。此外,高山水平也降低了SV组。在以往的研究中使用啮齿动物(12- - - - - -15),类似的结果,包括减少AT-MSC注入后血清ALT和AST水平。我们的研究结果表明,脾静脉和/或脾实质注入主要是有效减少肝酶与外围注入。然而,尼古拉斯et al。1)检查治疗AT-MSCs对小鼠急性肝衰竭的影响通过比较通过尾静脉移植路线,门静脉和肝实质,从我们的研究得到了不同的结果。先前的研究表明,通过尾静脉注射AT-MSC ALT和AST水平的降低导致更加突出比通过其他路线。这些结果表明,AT-MSCs通过周围静脉注射持续相对长比通过其他途径AT-MSCs移植体循环。因此,AT-MSCs的内分泌和/或旁分泌作用增强。据报道,AT-MSCs分泌一些有益的细胞因子和生长因子。最近,越来越多的数据表明,疗效AT-MSCs实现不仅为分化的能力,而且旁分泌释放的细胞因子和生长因子(16- - - - - -18]。然而,目前尚不清楚因素从系统性AT-MSCs循环血液中分泌或AT-MSCs道在几个器官导致器官功能障碍的恢复。

我们的研究结果表明,多AT-MSCs通过脾静脉移植相比,肝或脾实质是道与通过外周静脉移植。通过比较AT-MSC吸收由特定器官包括肺、肝、脾、膀胱移植后成健康的米格鲁猎犬(19),结果表明:系统性静脉注射导致几乎所有AT-MSCs被困在肺部,但高均匀扩散通过脾注射观察肝摄取。然而,AT-MSCs离家有能力向受伤的网站(18]。实际上,当AT-MSCs是肝移植到受伤的动物通过系统性的路线,AT-MSCs受伤的肝脏(12,20.]。AT-MSC归航的机制研究,由各种因素和信号通路(18]。局部注射是一种侵入性手术,也会打乱高度复杂和微妙的微环境。因此,最近的研究优先系统注入AT-MSCs的交付方法。根据我们的犬急性肝损伤的结果,更AT-MSCs通过系统性的路线被困在肺移植相比,通过脾移植路线。这个结果是使用健康的米格鲁猎犬(类似于以前的报告19]。尽管AT-MSCs归航的招聘行为AT-MSCs在伤口部位,它是首选,AT-MSCs将注入通过脾或门户路线当期待更多AT-MSCs道在肝脏损伤。

在我们的研究中,血清生化参数的变化如ALT和AST PV和SV团体之间是相似的。然而,组织学复苏的改变和细胞因子mRNA表达伤肝的SV组比光伏组更有效。Immnohistochemical和组织病理学评价表明,肝脏病变,如炎症细胞浸润及肝纤维化,改善后AT-MSC注入。此外,SV组的肝损伤的程度比光伏组在这两天7和15。SV组的细胞因子mRNA表达的改变表明,促炎细胞因子,如il - 1、il - 6,引发和干扰素γ,减少了在这两天7和15日和抗炎细胞因子,il - 4和il - 10等,更增加了7天与光伏组。此外,信使rna的HGF和VEGF的表达,促进肝细胞再生和扩散,SV组高。这些变化表明,AT-MSC通过脾静脉移植诱导比移植通过体循环更好的改进。然而,我们的研究都集中在澄清mrna的表达,以及还需要进一步的研究来评估这些基因的蛋白表达水平和机械化的途径。

一些研究表明,道AT-MSCs分化成hepatocyte-like细胞(15,18),但目前尚不清楚这些hepatocyte-like细胞功能类似于本机肝细胞。我们没有评估是否道AT-MSCs在肝脏分化成hepatocyte-like细胞在这项研究。然而,我们相信,如果道AT-MSC可以分化成肝细胞,这个属性可能受益于改善急性肝损伤。在这项研究中,我们评估了他生AT-MSCs对急性肝损伤的影响在短期内;因此,进一步的研究应该解决如何道AT-MSCs长期变化包括分化和功能。虽然道的数量AT-MSCs通过脾移植静脉和/或实质高于通过系统性的注入,道的总数AT-MSC很低在整个肝脏。此外,考虑到减少血清肝酶AT-MSC注入后不久,从AT-MSCs分泌的可溶性因子主要为肝脏损伤的恢复。从我们的研究结果,AT-MSC疗法可能导致炎症反应,其次是肝纤维化的抑制短期的急性肝损伤。

5。结论

本研究表明,外源的AT-MSCs可能有效改善急性肝损伤狗。因为血清生化参数,如ALT和AST,显著降低AT-MSC注射后,从AT-MSCs分泌的可溶性因子在急性肝损伤的恢复。我们的研究结果还表明,通过脾移植静脉比通过外周静脉移植更有效。这一发现与道的数量AT-MSCs在肝脏。然而,进一步的检查包括多少AT-MSCs用于移植是有效的,怎么道AT-MSCs长时间的变化,以及是否一定改善肝脏损伤的影响依赖于移植的数量需要AT-MSCs兽医临床应用。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持的日本社会科学促进KAKENHI(批准号16 k18808]。作者感谢Edanz集团(http://www.edanzediting.com/ac)编辑这个手稿的草案。

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