文摘

类型两个先天免疫系统抗炎和可能发挥重要作用的手段,“褐变”是在皮下脂肪细胞诱导。结果表明,il - 4的命运可能会影响脂肪细胞前体通过促进分化走向更多的产热的老鼠体内的脂肪细胞。在这里,我们调查的影响il - 4和il - 4受体免疫细胞因子类型两个途径,代谢活动和产热的潜在人类脂肪细胞分化的脂肪间充质干细胞(ADMSCs)从皮下的样本获得健康女性进行腹壁整形术。免疫印迹分析、qPCR和生化分析10天后ADMSC诱导分化为成熟脂肪细胞。il - 4受体前体和分化的脂肪细胞,和il - 4的治疗增加磷酸化Y641信号传感器和激活的转录6 (STAT6)在两种细胞类型。il - 4的治疗也增加PGC-1产热的蛋白质的表达α、UCP-1 CITED1。此外,il - 4脂联素的分泌增加,瘦素,FGF21和促进分化的脂肪细胞的脂解作用。总之,il - 4可以直接调节人体脂肪细胞的分化走向米色表型代理通过il - 4受体脂肪前体细胞和人类脂肪细胞分化,代谢的影响,必须考虑在一些抗过敏药物。

1。介绍

肥胖与轻度炎症状态有关,可导致胰岛素抵抗和2型糖尿病1]。这轻微的炎症状态的特征是人口巨噬细胞在脂肪组织的变化2,3]。促炎1型巨噬细胞(M1)的增加,促进胰岛素抵抗,明显在肥胖者的脂肪组织,也证明2型巨噬细胞数目减少(M2),这是胰岛素敏化(4,5]。

几项研究已经强调了白细胞介素的角色(ILs)在脂肪细胞的生理学:盲降脂类分解增加和修改的身体脂肪分布和生产脂肪组织的细胞外基质(6- - - - - -8]。然而,这是表明脂肪细胞和免疫系统之间的交互是比此前认为的更加复杂9]。一些研究表明,组2先天淋巴细胞的激活(ILC2s)可能修改脂肪组织的功能和系统性葡萄糖体内平衡。后发现IL-33刺激,嗜酸性粒细胞和ILC2s产生il - 4和IL-1310- - - - - -13),盲降,这可能促进脂肪前体细胞的分化成“布朗喜欢“脂肪细胞(14]。另外,IL-33可以影响生产met-enkephalin ILC2s,可诱发“褐色”在脂肪细胞分化的过程(10]。此外,M2所激活的巨噬细胞il - 4可以动员皮下脂肪组织,分泌儿茶酚胺,激活棕色脂肪细胞和诱导米色脂肪细胞的分化14,15]。我们以前观察到海拔寒冷引起的产热的基因表达在人类脂肪细胞增加了il - 4 (16]。

尽管il - 4的观察效果米色脂肪细胞的前体细胞的分化,分化脂肪细胞il - 4的影响,其影响褐变的过程还有待调查。先前的研究显示减少il - 4受体(IL-4R)分化的脂肪细胞中表达。然而,这些研究主要是表现在3 T3-L1细胞和小鼠脂肪组织(11,17]。因此,il - 4的功能角色及其在人类分化脂肪细胞受体仍有待确定。另一方面,它最近观察到适应性生热作用是不相关的一种慢性治疗小鼠il - 4。费舍尔等人报道相反的结果对之前的评估相关的大量的儿茶酚胺合成的il - 4或者激活巨噬细胞,涉及il - 4的角色适应性生热作用和棕色/米色脂肪细胞代谢[18]。il - 4的常规信号通路是由绑定(IL-4R I型受体的配体α/γ链)和II型受体(IL-4Rα/ IL-13Rα1)(19]。il - 4的绑定IL-4R诱导受体二聚作用,激活细胞内的信号通路(20.),包括转录因子的激活信号传感器和转录激活6 (STAT6)和胰岛素受体底物2 (21,22]。

添加到有限的知识关于il - 4的影响在人类褐变过程中,我们研究了分化的脂肪细胞的表型特征从健康女性接受脂肪切除。我们观察到il - 4治疗引起的表型特征典型的浅褐色脂肪细胞分化白色脂肪细胞。此外,我们发现两个前体分化细胞和脂肪细胞表达IL-4R,和il - 4诱导增加STAT6的磷酸化。这意味着il - 4可能直接影响通过IL-4R分化的脂肪细胞,导致“布朗宁。”

2。材料和方法

皮下脂肪样本来自八20 - 40岁的健康女性,接受腹壁整形术。他们的身体质量指数(bmi)第23 - 25公斤/米²并没有收到任何药物治疗在抽样前3个月,没有表现出任何疾病的迹象。此外,他们的血脂和血糖水平在正常范围内。他们收到详细信息关于这项研究的目的,给知情同意。该项目是大学的伦理委员会批准的La Sabana。

2.1。细胞培养和分化

前体细胞分离从30 g腹部皮下脂肪组织在手术过程中获得的。脂肪样本用磷酸盐(PBS),以及所有可见纤维材料和血管被移除。随后,样本和250 U /毫升I型胶原酶消化,20毫克/毫升牛血清白蛋白(BSA)和60μ在PBS g / mL庆大霉素90分钟在37°C。消化后,样本在200×g离心10分钟,和红细胞溶解的颗粒是resuspended解决方案包含154毫米氯化铵,5.7毫米单碱的磷酸钾,和0.1毫米EDTA pH值7.3 10分钟。这个混合物是尼龙网过滤(孔隙大小:150μ米),其次是在200×g离心10分钟。增殖的细胞颗粒当时resuspended媒体包含杜尔贝科的修改鹰中等DMEM / F12, 10%v/v胎牛血清和50μg / mL庆大霉素和播种密度10000细胞/厘米²。

24小时后,这些细胞被洗和诱导增殖加法的PM4媒体(包含2.5%胎牛血清的DMEM / F12,基本成纤维细胞生长因子1 ng / mL, 10 ng / mL表皮生长因子,和8.7μ米胰岛素)。confluency当细胞达到100%,人类细胞分化成脂肪细胞前体的DMEM / F12培养基含有66 nmol L⁻¹胰岛素,1 nmol L⁻¹triiodo-L-thyronine 10μ0.5 g / mL转铁蛋白,更易与L⁻¹isobutyl-methylxanthine 100 nmol L⁻¹地塞米松,1μ摩尔L⁻¹罗格列酮(过氧物酶体proliferator-activated受体γ(PPARγ72 h)受体激动剂)。随后,媒介是取代preadipocyte基础培养基含有相同浓度的胰岛素,triiodo-L-thyronine,转铁蛋白10天,每3天变化。成熟的脂肪细胞il - 4的效果是评价治疗10 ng / mL的il - 4(美国新泽西PeproTech,落基山)的0.1%w/vBSA 6 h。作为一个消极的控制,成熟脂肪细胞治疗与白细胞介素6 100 ng / mL(细胞信号技术,丹弗斯、马、美国)的0.1%w/vBSA 6 h。

2.2。脂肪细胞冷诱导

在先前的研究中,由我们组表演,主要人类脂肪细胞进行评估和观察,减少温度从37°C到30°C期间可能类似与增加产热的冷诱导蛋白,UCP-1 PGC-1α。

脂肪细胞前体细胞在6-well盘子被诱导分化培养10天在基底分化培养基37°C。细胞被洗与PBS、基础培养基添加,然后在30°C细胞孵化有限公司5%₂的存在与否,10 ng / mL il - 4 6 h。细胞被细胞溶解蛋白表达进行分析。控制细胞培养在同等条件下在37°C (16]。

2.3。qPCR

总RNA从人类分离脂肪细胞前体分化细胞和脂肪细胞。使用高纯RNA RNA提取进行隔离设备(罗氏诊断,曼海姆,德国)按照制造商的指示。然后,500 ng RNA是用于生成cDNA使用Transcriptor第一链cDNA合成装备(罗氏诊断,曼海姆,德国)。以下引物被用于基因表达检测,建议协议使用后由于“快速上手”项目必不可少的DNA绿色主人混合(罗氏诊断,曼海姆,德国):IL-4R弗兰克-威廉姆斯:5′GTGCTATGTCAGCATCACCAAGA 3′,牧师:5′CCCCTGAGCATCCTGGATTAT 3′和解偶联蛋白1 (UCP-1)弗兰克-威廉姆斯:5′GTGTGCCCAACTGTGCAATG 3′,牧师:5′CCAGGATCCAAGTCGCAAGA 3′。信使rna表达水平定量分析的规范化表达glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH;引物序列:弗兰克-威廉姆斯5′ACCCACTCCTCCACCTTTGAC 3′, 5′牧师TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT 3′使用ΔΔCt方法。

2.4。免疫印迹分析

皮下脂肪组织的脂肪细胞分化细胞溶解在radioimmunoprecipitation化验(里帕)缓冲区(Abcam、剑桥、马、美国;ab156034)包含1μg蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏诊断,曼海姆,德国)。总蛋白质含量的溶解产物然后使用布拉德福德量化方法,和溶菌产物稀释至最后一个工作50浓度μg / mL的蛋白质。溶菌产物在95°C和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。产品被electrotransferred聚乙二烯二氟化物膜进行预处理以100%甲醇为2分钟。阻塞了PBS-T (1 x PBS含有0.1%渐变20)包含5%w/v脱脂奶粉。

膜被孵化与抗体针对蛋白质参与生热作用:兔子anti-PGC-1α(1:1000年,Abcam ab54481),兔子anti-UCP-1(1: 1000年,Abcam ab155117),兔子anti-IL-4R(1: 1000年,Abcam ab131058),兔子anti-STAT6磷酸化(磷Y641)(1: 1000年,Abcam ab54461),和鼠标anti-cAMP反应元件结合蛋白/ p300-interacting反式激活因子1 (CITED1;Abcam ab87978)。二次抗体兔免疫球蛋白,共轭PGC-1辣根过氧化物酶(IgG-HRP)α、IL-4R pSTAT6(1: 5000)和UCP1(1: 3000),是使用。后鼠标IgG-HRP作为二级抗体anti-CITED1应用(1:2000)。

发病表达水平的测量使用兔子anti-fatty结合蛋白4 (FABP4;1:3000年,Abcam 92501), anti-adiponectin(1: 3000年,Abcam ab92501)、成纤维细胞生长因子21 (FGF21;1:1000年,Abcam ab171941)和瘦素(Abcam ab16227),与兔子IgG-HRP(1: 5000)作为二级抗体。检测是由化学发光使用Luminata高潮工具包(美国微孔,Billerica的)。图像捕获和分析使用myECL成像仪,污点和凝胶文档工具(目录编号为62236,热科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。定量光密度分析使用我为三个独立的实验图像分析软件。

2.5。脂类分解分析

前体和分化的脂肪细胞被洗和孵化试验缓冲区的BSA作为载体或服用10 ng / mL il - 4。作为一个积极的控制,细胞治疗1μ异丙肾上腺素。甘油含量的上层清液测定使用人工培养的脂肪细胞的脂解作用分析工具包(Zen-Bio、研究三角园、数控、美国)制造商的指示后,用分光检测在540海里。

2.6。统计分析

数据使用单向方差分析进行评估,数据代表意味着±SD的三个独立的实验样品的8个病人蛋白质免疫印迹分析。通过学生之间的差异意味着进行t以及。时被认为是具有统计学意义的差异 。

3所示。结果

3.1。il - 4激活IL-4R信号通路在前体和分化的脂肪细胞

本研究建立在之前的实验中,小鼠脂肪细胞前体接受il - 4演示了一个米色的表型,IL-4R / STAT-6通路的激活。相比之下,分化脂肪细胞被认为接受“褐色”,因为不同的通路的激活,因为他们不表达IL-4R [11,14]。脂肪间充质干细胞(ADMSCs)从人体皮下脂肪被诱导分化为10天。IL-4R的表达以脂肪细胞前体(间质血管分数(SVF))和脂肪细胞诱导分化使用分化的鸡尾酒(成熟脂肪细胞),治疗前后与il - 4。

如图1(一)前体和成熟脂肪细胞表达IL-4R mRNA的表达和il - 4处理显著提高IL-4R在两种类型的细胞。先前的研究表明,il - 4可以通过IL-4R前体脂肪细胞中诱导褐变(11]。然而,IL-4R显示不能表达的脂肪细胞来源于小鼠前体细胞。我们旨在评估IL-4R的作用从人体皮下脂肪组织分化的脂肪细胞;因此,蛋白质含量IL-4R和pSTAT-6确定。IL-4R蛋白前体和分化的脂肪细胞,和pSTAT-6增加了管理的il - 4细胞类型(数据1 (b)和1 (c))。

3.2。pSTAT-6是由成熟的脂肪细胞中il - 4

建立il - 4信号通路被激活后是否成熟的脂肪细胞il - 4的治疗,我们pSTAT-6化验。成熟脂肪细胞治疗与il - 4、il - 6、il - 4和il - 6的分泌。正如所料,pSTAT-6在脂肪细胞il - 4处理发现,il - 6治疗没有诱导pSTAT-6(数字2(一个)和2 (b))。

3.3。在产热的il - 4蛋白表达的影响

确定治疗il - 4在成熟脂肪细胞可以诱导褐变,前体细胞和成熟脂肪细胞被刺激10 ng / mL il - 4 6 h。UCP-1信使rna被证明产生的il - 4(图3(一个)),如图3 (b)和3 (c)PGC-1、蛋白质表达水平α和CITED1增加了2.3 -近2倍,分别。

3.4。il - 4增加线粒体蛋白质的活动

探讨il - 4对线粒体的影响活动,成熟脂肪细胞治疗与il - 4和孵化31°C 6 h。孵化31°C与减少对UCP1温度和评论的影响。细胞溶解产物被准备,UCP1蛋白表达和TFAM被西方墨点法测量。il - 4增强hypothermia-induced增加线粒体蛋白表达(数字4(一)和4 (b)),这意味着成熟脂肪细胞的il - 4的褐变效应。

3.5。影响il - 4的表达分化脂肪细胞的发病

一个重大的挑战在评估布朗宁的感应是表征的影响发病的生产。评估成熟的脂肪细胞il - 4的治疗是否能诱导蛋白质参与脂质和糖代谢,发病的表达影响相关途径进行评估。il - 4的表达增加脂联素、瘦素和FGF21仅在成熟的脂肪细胞与细胞治疗与BSA(数字5(一个)和5 (b))。表达FABP4证实细胞成熟的脂肪细胞。

3.6。il - 4增强Hypothermia-Induced激活的生热作用

脂联素是一个adipokine闻名的保护作用与代谢疾病疾病和糖尿病。暴露在寒冷的在人类和小鼠诱发脂联素的生产,通过激活il - 4的途径。评估是否il - 4的治疗可能增加hypothermia-induced脂联素表达,脂肪细胞暴露在低温(31°C)与10 ng / mL il - 4和治疗。这导致增加脂联素的表达和PGC-1α在脂肪细胞,而细胞暴露在相同的温度条件但处理车辆(数字6(一)和6 (b))。

3.7。il - 4的分解脂肪的作用

我们的研究结果表明,il - 4调节成熟脂肪细胞的表型可能通过促进褐变和发病的诱导表达参与脂类和碳水化合物的新陈代谢。因此,我们提示评估il - 4是否可以调节脂质动员在成熟的脂肪细胞。为此,我们研究了影响il - 4的成熟脂肪细胞的脂解作用,表明il - 4治疗6 h增加脂类分解(图7)。

4所示。讨论

这项工作突出了il - 4受体(IL-4R)的角色在促进褐变成熟的人类脂肪细胞。这些脂肪细胞细胞分化ADMSCs腹壁整形术中,获得女性正常BMI。分化细胞的il - 4的治疗导致pSTAT-6的表达水平增加,PGC-1α、UCP-1 CITED1。这些发现表明,il - 4可以施加直接对脂肪细胞通过绑定IL-4R褐变的影响α受体。尽管一些研究认为il - 4的作用及其受体在脂肪细胞褐变,这些主要是脂肪细胞前体(11,23),优先分化成浅褐色脂肪细胞il - 4的存在。

以前,秋和他的同事们指出,嗜酸性粒细胞刺激产生的il - 4儿茶酚胺生产M2巨噬细胞,诱导脂肪细胞表型的变化走向,米色脂肪细胞(14]。其他的研究表明,ILC2s不需要il - 4诱导褐变;相反,他们可能引起这种效应met-enkephalin增产与IL-33[刺激后10]。最近,这是冬季的褐变过程中观察到的增加,一个事件由il - 4和肥大细胞(24]。目前的研究表明,在人类和pSTAT-6 IL-4R表达分化的脂肪细胞和il - 4的治疗增加PGC-1的表情α、UCP-1 CITED1。

此外,il - 4的治疗增加脂肪细胞的发病水平表达,其中包括脂联素和FGF21 [25,26),影响新陈代谢有益的。这一发现是相关的,因为除了在成人脂肪细胞增加产热,il - 4可能有额外的有利影响碳水化合物的新陈代谢。脂联素和FGF21可能改善葡萄糖吸收的外围组织和胰岛素敏感性(27,28]。

il - 4的效应蛋白的表达与成熟脂肪细胞的生热作用伴随着增加脂类分解增加甘油释放到介质(图所示5)。更有趣的观察UCP-1表达水平的增加,TFAM PGC-1α脂联素,当细胞受到低温,如图4和6。细胞的反应冷压力和适应环境的机制是由2型免疫细胞介导的部分(ILC2s、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞激活)产生白细胞介素(il - 4、IL-13和IL-33) (11]。以前证明冷可以使米色表型的诱导培养的脂肪细胞,介导的il - 4,其他因素(16,29日]。工作中存在我们的观察表明,进一步增加产热的蛋白质发现随温度降低展品额外比只有il - 4的效果和IL-4R机制。其他因素可能导致温度下降的结果在增加产热的蛋白质脂肪细胞可以激活肾上腺素能受体和methionine-enkephalin [30.- - - - - -32]。然而,还需要更多的研究来解决这个问题。鉴于先前的研究,观察到减少IL-4R表达式进行在小鼠和大鼠脂肪细胞细胞系,我们相信,这项研究是小说证明il - 4的参与及其受体的褐变成熟脂肪细胞来源于人类ADMSCs。这将是重要的分析患者的代谢行为对特定的IL-4R阻滞剂治疗过敏性疾病。这些数据暗示目标IL-4R鼓励增加能量消耗的脂肪细胞可能用于治疗肥胖症。ILs的褐变过程中作用示意图如图8。

信息披露

成立赞助商没有参与这项研究的设计;在收集、分析或解释数据;写的手稿;并决定发表的结果。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

费尔南多Lizcano和戴安娜巴尔加斯的构思和设计实验。戴安娜巴尔加斯和费尔南多Lizcano分析数据。安吉拉·戈麦斯和阿斯特丽德Torrado贡献试剂/材料/分析工具。费尔南多Lizcano和戴安娜Vargas写道。

确认

这项研究受到了Colciencias 519/2011和La Sabana大学地中海- 181 - 2014。由于DIN(研究和洛杉矶大学的医学院de La Sabana)后勤和经济支持。特别感谢半径标注。莱昂诺波特罗和胡安Duque博士合作。