文摘
抑制睾丸间质细胞(slc),位于在哺乳动物的睾丸,睾丸间质间能够区分,testosterone-synthesizing睾丸间质细胞(LCs),从而提供一个新的治疗睾丸素不足的策略。但是,没有先前的报告识别和培养slc来自猪。当前研究的目的是孤立、识别、和文化slc的猪。苏木精和伊红染色和免疫化学分析表明,slc和PDGFR在座α主要是用猪睾丸间质表达,表明PDGFR吗α在新生儿猪slc的标志。此外,一结论结果表明SLC标记主要表达在孤立的LCs,表明他们假定的SLC。假定的slc随后被培养的睾丸小猪(pTF)的流体介质。克隆形成7天后和PDGFR表达的细胞α。但是,没有克隆没有pTF增长,但CYP17A1表达的细胞,表明pTF可以维持猪slc的特点。总而言之,我们孤立猪slc和确定他们的基本特征。综上所述,这些研究结果可以为研究奠定基础猪slc的临床应用。
1。介绍
睾丸激素不仅维持精子发生过程,但也保护androgen-dependent组织的功能(1,2]。合成的主要来源和哺乳动物睾丸分泌睾丸激素,成人睾丸间质细胞(美联冠军赛)发挥重要作用在维护至关重要的运动(3]。最近,它已经表明,美联冠军赛干细胞出现睾丸间质细胞(slc) [4]。slc,位于间质舱接近哺乳动物睾丸细精管,是最重要的一个成体干细胞类型(5,6]。
slc从新生鼠睾丸首先识别和丰富了Ge et al .(2006),和进一步的研究表明,假定的老鼠和人类slc有能力分化成testosterone-producing细胞(4,7,8]。根据这些先前的研究,确定了slc的一些特征(4,9,10]。首先,哺乳动物的数量slc相当小;例如,平均只有8500的slc获得从一个产后7-day-old鼠睾丸(4]。第二,slc驻留在细精管的外表面在大鼠睾丸原位纺锤状(4,10]。此外,假定的slc表达生活受体(LIFR),血小板源生长因子受体α(PDGFRα)、巢蛋白Thy-1,一些干细胞标记;然而,他们是3βhsd -和促黄体激素受体(LHR) - (4,8,10,11]。不幸的是,没有slc的研究在其他哺乳动物动物除了老鼠,老鼠和人类。
随着年龄的增加,功能的LCs的数量减少,睾丸激素生产能力,营地生产,减少steroidogenic酶的活动(12,13]。因此,男性不育的疾病可能发生在老年男性由于LCs功能障碍或睾丸激素紊乱14,15]。目前,androgen-replacement是最有效的治疗抢救睾丸素不足;然而,它需要连续治疗和带有固有的风险16]。slc自我更新和分化成LCs的能力,因此,提供一个slc移植治疗这些疾病的新策略(17]。
猪作为哺乳动物模型起到了至关重要的作用在人类疾病研究[18,19]。猪睾丸被认为是“最多才多艺的类固醇生成器官”,提供了重要的材料研究人类甾类产生的生理学和遗传学20.]。然而,猪slc尚未分离和浓缩。此外,物种区别复杂猪slc的研究,由于完全映射标记和文化系统的老鼠和老鼠slc猪slc尚未实现。由于猪slc在临床应用的重要性,本研究的目的是分离、识别、和文化从新生儿slc猪睾丸。
2。材料和方法
2.1。猪睾丸的集合
这项研究是通过西农大学动物保健和使用委员会按照指南的实验室动物保健和使用美国国立卫生研究院,中国。新鲜睾丸的样本7-day-old男猪来自Besun农业产业集团有限公司有限公司(陕西杨凌,中国)被运到实验室杜尔贝科Penicillin-Streptomycin磷酸盐(DPBS)补充2% (P / S)解决方案(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)在1 h。睾丸的样本收集丽江男猪的猪育种杨凌农业,中国陕西省。
2.2。隔离猪slc
一个酶消化法获取猪slc。睾丸附睾后第一次清洗和切碎的膜被移除。然后睾丸片段被悬浮在0.75毫克/毫升胶原酶IV型(表达载体)含有5% (v / v)胎牛血清(英国的边后卫,Gibco)加上DNase我(100μg / mL;生物基础,马卡姆,加拿大)和孵化,不断颤抖的34°C 90分钟(21]。160和59μm单丝尼龙网格(Solarbio,北京)被用于筛选细胞悬液(21]。孤立的细胞治疗1毫克/毫升透明质酸酶(表达载体)和离心,享年500岁5分钟在20°C。5分钟平静下来后,上面的悬浮液在媒体培养另一个15分钟静。细胞悬浮液的上一边被收集。最后,孤立的LCs是杜尔贝科修改鹰的培养基培养:营养混合物F-12 DMEM / F12,表达载体介质。
2.3。小猪睾丸液的制备(pTF)
pTF和初级LCs是来自同一来源。7-day-old猪的睾丸被切成碎片尽可能小和pTF被组织均匀化提取20°C (22]。最后,pTF是透过0.22μm消灭病菌的过滤器。
2.4。猪的文化孤立的LCs
孤立的LCs沉淀resuspended在两个媒体:一个基本的媒介和其他pTF介质(基础培养基+ 30% (v / v) pTF) (22]。的基本介质由DMEM / F12, 10% (v / v)的边后卫,1% (v / v) P / S,和1% (v / v)维生素。LCs被孵化的氛围中公司空气95% - 5%2在34°C和培养至少2周。文化媒体每天都在变化。
2.5。乙烷Dimethanesulphonate (EDS)治疗
教授提供的EDS是Yuanqiang张(人体解剖学、组织学和胚胎学,第四军医大学,中国)。根据前面的方法,EDS是溶解在二甲亚砜(DMSO) /无菌水(1:3,v / v) (23- - - - - -25]。之后,主孤立slc被播种到6-well板和0,0.5,0.75,和1.0毫克/毫升EDS(最终浓度)被添加到文化解决方案,分别是(24,25]。定量真正time-PCR(存在)和immunofluorescent EDS分析进行了24小时后治疗。
2.6。苏木精和伊红染色和免疫组织化学分析())
睾丸的7天样品和2个月的老男猪是固定,脱水,石蜡和嵌入。石蜡包埋组织被切割5点μ米使用标准程序和坚持预镀玻璃幻灯片。后来,他走时染色石蜡包埋的部分进行了观察组织学(26]。
免疫组织化学,PDGFRα7-day-old猪睾丸间质细胞的表达,这些蛋白阳性细胞的类型决定。在细节中,石蜡切片deparaffinized,水化,并在PBS冲洗。然后抗原检索涉及到沸腾的样品溶液0.01 Tris-ethylenediamine四乙酸(Tris-EDTA;pH = 9.0) 10分钟。驴孵化与10%的部分血清2 h在37°C,其次是与主要抗体(anti-PDGFR孵化αAbcam, 1: 200年,英国剑桥)一夜之间在4°C和随后的孵化与二级生物素化的抗体(ZSGB-BIO,中国)1 h在37°C [27,28]。之后,3、3′-diaminobenzidine(民建联、ComWin生物科技、中国)被用作色原体检测蛋白表达。
孤立的特征细胞被免疫荧光染色检测。首先,细胞被固定用4%多聚甲醛和permeabilized 0.05% Triton x - 100 15分钟。细胞被孵化主要抗体在4°C一夜之间,然后用适当的Alexa萤石2 h 594 -共轭二次抗体(表达载体1:400年,美国)37°C。最后,这些细胞被标记为4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1: 1000;Beyotime,中国)。被兔子anti-PDGFR使用的主要抗体α(1:200年,Abcam)和鼠标anti-CYP17A1(1: 100年,圣克鲁斯,美国)。
捕获所有的图像染色使用尼康Eclipse 80我荧光显微镜相机(日本东京)。
2.7。存在分析
从细胞和猪睾丸组织总RNA提取使用RNAiso +试剂(豆类、大连、中国)根据推荐的协议。互补脱氧核糖核酸被合成的逆转录PCR (RT - PCR)使用PrimeSript™RT试剂盒(豆类)。特定的引物(表1)被用来描述孤立的细胞。中存在的反应系统是20μL体积:10μL SYBR®预混料的前女友Taq二世(2 x)(豆类),0.8μL cDNA、0.5μL PCR引物(10μ0.5 mol / L)μL反向PCR引物(10μmol / L),增加了无菌水总量的20倍μl . PCR反应条件如下:变性在95°C 3分钟,其次是40的周期(95°C 15年代,60°C 30年代,30年代和72°C)。
2.8。油红O染色
可视化的脂质滴,LC是固定在4%甲醛(刚做好的从多聚甲醛)15分钟,彩色油红O染色溶液(0.3%油红O解决方案)10分钟,然后用PBS洗2 ~ 3次。细胞被使用了Eclipse 80我荧光显微镜相机尼康。
2.9。统计分析
mRNA表达检测到存在计算使用的表达方法和规范化β肌动蛋白(29日]。不同样本之间的mRNA表达变化计算使用SPSS(18.0版)(美国IL SPSS, Inc .,芝加哥)。统计差异的基因在不同的组由方差分析,和数据提出了重复的平均值±标准偏差。
3所示。结果
3.1。slc在场的新生儿猪睾丸
大量的纺锤状细胞被发现在睾丸间质产后7天”和2个月的老猪睾丸)染色(图1(一))。此外,免疫化学分析表明,PDGFRα主要是表现在产后7-day-old猪睾丸间质,而PDGFR的表达α在很低的丽江猪睾丸间质(图1 (b))。此外,的表达巢蛋白在7-day-old猪睾丸明显高于在丽江睾丸()(图1 (c))。基于这些结果,我们选择从7-day-old收集slc猪而不是2个月大的猪。
(一)
(b)
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3.2。孤立的LCs的猪睾丸间质表达了slc的标志
主要的LCs是通过消化方法(图2(一个))。rt - pcr和immunofluorescent分析被用来描述这些细胞。如图2 (b)rt - pcr结果显示,孤立的LCs表示slc或多能性干细胞标记(PDGFR巢蛋白α,Oct4 GATA-4和LIFR)(图2 (b))。此外,支持细胞的标志(SOX9)和精原干细胞(PLZF)没有发现(图2 (b)),这表明这些细胞LCs没有污染。结果表明,这种消化方法被用于去除细精管。此外,存在显示表达式的结果LIFR和PDGFRα在LCs明显高于猪睾丸()(数据2 (c)和2 (d)),表明此方法能够丰富slc从猪睾丸。总之,主要的孤立的LCs,表达slc标记(PDGFR巢蛋白α、GATA-4 Oct4、LIFR),假定的slc。
(一)
(b)
(c)
(d)
EDS是专门用来消除分化LCs在大鼠和小鼠睾丸(4,8]。根据EDS治疗,结果猪差异化LCs的比例大约是23%的初级孤立的LCs,和主要分离猪slc的纯度超过77%(数据,,在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/2740272)。此外,存在的结果巢蛋白,PDGFRα,CYP17A1表达式和CYP17A1 immunofluorescent分析进一步证实,EDS可以专门消除分化LCs猪(数字,),这是符合EDS治疗后细胞存活率的结果(图)。
3.3。这些孤立的slc表现出高单独使用潜力
即使主slc是孤立的,他们的文化系统还有待确定。在最近的研究中,pTF曾是主要的组件在中。七天后,克隆形成,增长更大的文化(图2周后3(一个))。Immunofluorescent分析表明,克隆PDGFRα积极的(图3 (b))。的表达式巢蛋白和LIFR高与pTF猪slc培养媒介相比,在slc文化()(图5),这表明pTF能够维持干细胞slc的潜力。
(一)
(b)
3.4。孤立slc显示自发分化成LCs的能力在体外培养
孤立的细胞培养的基础培养基(图2周后没有形成克隆4(一)),表示CYP17A1猪有区别的LCs(图一个标志4 (b))。此外,两者的表达巢蛋白和LIFR在猪显著降低slc的基本培养基培养2周相比在slc文化()(图5)。的表达CYP17A1明显高于在猪slc的基本培养基培养2周比slc没有文化()(图5)。油红O染色显示,培养细胞分泌的脂质滴,也是有区别的LCs(图的标记6)。这些结果表明,主孤立slc能够分化成LC血统与基本培养基培养时,表明假定的slc自发分化成LCs的能力。
(一)
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(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
几个睾丸细胞是精子形成的必要条件:生殖细胞、支持细胞、管周肌肉的细胞,美联冠军赛(30.]。美联冠军赛在哺乳动物睾丸激素分泌的主要来源;然而,他们不能扩散。睾酮可以扩散到支持细胞,间接调控精子发生。睾酮合成过程的干扰时,postmeiotic精子明显减弱或消失(30.]。slc因此适合拯救不孕LCs功能障碍所致。此外,它已经证明了slc能够分化成美联冠军赛体内alginate-encapsulated间质组织移植到老鼠extra-testis组织(31日]。因此,哺乳动物slc举行了男性不育研究和临床使用的巨大希望。
最近,slc已经成功地分离出老鼠,老鼠,和人类,而不是猪。先前的研究表明,一些蛋白质被发现在假定的slc老鼠睾丸间质,如巢蛋白、LIFR PDGFRα,CD90 CD51 [11,32]。然而,大多数这些也表示在其他睾丸细胞,slc和他们有用的标记,他们表达了时间和/或stage-specific的方式。例如,通用电气和他的同事证明了PDGFRα艾滋病患者和3β-HSD-negative细胞产后7-day-old老鼠假定的slc (4]。然后他们认为PDGFRα是一个老鼠slc在新生儿阶段的标志。在这项研究中,确定了slc和PDGFRα显示被表达在slc使用)染色和免疫化学。此外,免疫化学和存在分析的结果表明,该表达式PDGFRα和巢蛋白在产后7天显著高于“2个月”老猪()。这些结果预测PDGFRα也可以用作标记的新生儿猪slc和7-day-old采样点更适合隔离slc比2个月大的猪。
然而,没有研究报道猪slc的隔离。老鼠,Percoll纯化和免疫选择技术被用于获得slc Ge et al。(2006)4),和一些研究利用转基因小鼠获得鼠标slc (8,9]。在目前的研究中,胶原酶和透明质酸酶消化被用来隔离猪睾丸间质细胞的睾丸。此外,透明质酸酶可能分离单个细胞细精管的外表面。因此,在当前的研究中使用的方法更简单和更快的比的方法用于小鼠和大鼠。
像其他干细胞的增殖和分化,slc也受微环境,提供至关重要的细胞因子和蛋白。睾丸,某些类型的细胞,如支持细胞和小肌肉的细胞,分泌因素到睾丸液调节slc的活动(33- - - - - -35]。自猪slc没有发达的文化系统,所有因素提取整个睾丸pTF。首先,我们推测,pTF可能维持干细胞的潜力猪slc当添加到培养基中。这项工作的结果表明,pTF的确可能支持干细胞体外slc 2周的潜力。pTF能够维持自我更新slc的性质,随着pTF是一致公认的slc的起源。此外,pTF包含丰富的激素,生长因子,细胞因子,和大量的蛋白质,提供必要的物质基础为slc扩散(22,36]。PDGFR immunofluorescent分析α也证明了细胞培养了2周是假定的slc。总的来说,结果表明,pTF可能有助于维持自我更新假定的slc的属性。因此,未来的研究将针对揭示维护pTF slc自我更新的重要组件。
本研究有两个方面的创新。首先,它提供了一个更简单和更快的方法获取猪slc,这可能会提供一个水库LCs-lineage分化。第二,它开发了一个新的短期猪slc文化系统。此外,作为人类理想模型,一些人类药物毒性的无菌疾病可以评估调查猪首先,人体试验之前,这可能会降低调查费用的新药。
5。结论
总而言之,我们孤立的猪slc和确定他们的一些基本特征。此外,pTF能保持猪slc的特性添加到文化系统。这项工作可能会帮助我们理解slc的增殖和分化的调节机制,有关猪slc承诺进行进一步研究。
信息披露
当前地址Chuanying锅是动物科学技术学院,西农大学,西农路22号中国712100年陕西杨凌。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项工作是支持中国博士后科学基金资助项目(没有。2014 m560809),中央大学基础研究基金(NWSUAF,不。2452015145),中国国家基础研究计划(973计划;不。2014 cb943100)。特别感谢将教授Yuan-Qiang张(第四军医大学、中国)EDS的慷慨的捐赠。
补充材料
EDS是用来消除分化LCs的孤立的主要细胞。如图S1,主要的一部分细胞与不同浓度的死当孵化EDS(0, 0.5, 0.75,和1.0毫克/毫升)。死细胞比例大约是23%,这表明,差异化的LCs的比例大约是23%,和主要分离猪slc的纯度超过77% (S1, S2图)。然后存在显示表达式的结果巢蛋白和CYP17A1在统计学上意义在1.0毫克/毫升EDS治疗组比对照组,预测,1.0毫克/毫升是最好的治疗浓度的EDS研究(图S3)。在这个结果的基础,immunofluorescent分析被用来检测到的表达CYP17A1 EDS治疗前后的主要细胞。如图S4, CYP17A1-positive细胞的比例大约是25% EDS治疗前,这是与死细胞比例一致。同时,CYP17A1-positive细胞的膜结构打破了EDS治疗后,预测,EDS可以消除猪分化LCs在这项研究中(图S4)。