文摘

目的。当前研究的目的是调查的影响nephronectin (Npnt)在人牙髓干细胞(hDPSCs)。方法。Npnt被涂布nontissue culture-treated聚苯乙烯板(non-PS)。固定化蛋白质在表面的存在被多克隆兔子主要anti-Npnt抗体检测。然后细胞数量统计并与PBS -牛血清白蛋白(BSA),鱼鳞I型胶原蛋白(FCOL1),和人类纤连蛋白(Fn)涂井。细胞增殖是使用CCK-8试验评估。在光学显微镜和荧光显微镜下观察细胞形态。最后,整合蛋白mRNA表达谱,象牙质sialophosphoprotein (DSPP),骨涎蛋白(BSP),和矿化能力的hDPSCs进行了实时rt - pcr和茜素红染色,分别。结果。通过Arg-Gly-Asp Npnt介导hDPSC粘附和传播部分(RGD)主题。Npnt增强的mRNA表达ITGA1、ITGA4 ITGA7, ITGB1五天。Npnt下调DSPP但显著调节BSP mRNA表达在28天。此外,Npnt和FCOL1加速hDPSCs基质矿化。结论。目前的研究结果表明,Npnt将有利于招募hDPSCs hDPSCs有利于成矿。的组合与hDPSCs Npnt可能为硬组织再生提供一种很有前途的方法。

1。介绍

牙髓健康是至关重要的结构和功能完整性的牙齿。影响引起的牙齿变色等夺去生命兴趣驱动的重要生物活性材料的发展,促进受损的牙本质组织的再生利用牙髓进行自我修复的能力。

口腔组织的再生能力是有限的,接触的果肉,是否造成伤害或龋齿,需要立即手术干预,恢复其活力。牙质的成功再生的基本点是生长因子、干细胞和支架。人牙髓干细胞(hDPSCs)在2000年被发现,以他们的能力,形成dentine-like结构当移植到免疫缺陷小鼠1]。另一方面,hDPSCs还可以分化成脂肪细胞和neural-like细胞(2),强调他们的潜力用于神经退行性疾病的治疗。最近,据报道,检查参与组成分泌腺hDPSC减少细胞毒性和细胞凋亡引起的β淀粉样蛋白(Aβ)肽,淀粉样斑块的主要组成部分在阿尔茨海默病(AD)和可能利用治疗广告(3),一种慢性神经退行性疾病,全世界4600万人受其困扰现在(4]。更重要的是,尽管DPSC股票类似immune-phenotype骨髓基质细胞(BMSC)在体外牙原性的潜力,DPSC显示明显高于BMSC使用相同的诱导因素(5]。

一般来说,因为干细胞的存在,组织或器官修复损坏部分保持天生的能力,在某种程度上。然而,这种内生能力由衰老或受损严重的炎症。组织工程在牙科领域因此获得越来越感兴趣。过去几十年目睹了一个范式转变在脚手架的观念,从被动的载体生物活性改变的信号引发剂。尤其是不懈努力一直在持续探索天然聚合物,如细胞外基质(ECM)脚手架包含细胞互动主题。仅举几例,胶原蛋白6),壳聚糖(7),羟磷灰石(8)等都被报道为组织工程是合适的候选人。Npnt Arg-Gly-Asp——(RGD)包含ECM蛋白最初发现在胚胎肾,集中表现在发展中牙齿和认为重要的作用在调节sox2表达式,口腔上皮干细胞标记。重要的是,失去Npnt导致减少牙胚的大小(9),突显Npnt不可或缺的角色在牙齿发育的过程。此外,早前在我们的实验室工作证明的mRNA表达Npnt增加MDPC-23细胞的分化和Npnt蛋白质本身是有效的促进增殖和分化的具体odontoblast-like细胞系(10]。然而,MDPC-23细胞需要的precommitted性质研究使用一种多功能的细胞进一步证实Npnt的胶粘剂和诱导能力。

当前的实验是因此旨在澄清以下问题:首先,Npnt hDPSC胶吗?第二,如果是,RGD序列参与调节细胞粘附的吗?第三,Npnt有效促进hDPSCs的分化成牙质细胞或至少硬组织形成细胞?最后,用Npnt hDPSCs的矿化可以提高吗?为了回答这些问题,我们涂Npnt蛋白质参与组织培养聚苯乙烯板(non-PS)和评估大量的生化参数,比如RGD肽抑制试验、CCK-8试验,实时rt - pcr和茜素红染色的细胞行为。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

人牙髓干细胞(hDPSCs)(目录号码pt - 5025;批号0000361427)买来LONZA (Walkersville,医学博士,美国)。使用hDPSCs批准和指导下制定的伦理委员会健康科学大学的北海道。干细胞表型的表征进行了使用流式细胞仪包括表面抗原(CD105的测试⁺,存在⁺、CD29⁺,CD90⁺,CD73⁺,CD133⁻,CD34⁻、CD45⁻)由制造商(见补充文件的分析证明书可以在网上https://doi.org/10.1155/2017/2546261)。细胞被维护在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) (D5796,σ)补充10%胎牛血清(的边后卫)(10270 - 106,Gibco)。所有的媒体都补充了50个单位/毫升青霉素和50μg / mL链霉素(Gibco 15070063号目录)。细胞培养在37°C下湿润有限公司5%₂和95%的空气大气状况。矿化试剂包括β甘油磷酸盐(β全科医生,10毫米)和光)(191 - 02042年kouichi和抗坏血酸(AA, 50μg / mL)和光)(013 - 19641年kouichi成立融合。

2.2。ECM蛋白质和膜过程

Non-PS板块(磐24-well板:1820 - 024;12-well板:351143年,猎鹰)被涂上一层nephronectin (Npnt 10μg / mL, 1μ克/厘米²、4298 - np - 050、研发系统),纤连蛋白(Fn人血浆10μg / mL, 1μ克/厘米²,33016015,Gibco),鱼鳞I型胶原蛋白(FCOL1 10μg / mL, 1μ克/厘米²,Cellcampus AQ-3LE,塔基•化学稀释在磷酸盐(PBS)(参考10010 - 023,Gibco),水(pH值7.4),或无菌酸性水(pH值3.0),分别。PBS和牛血清白蛋白(BSA), 1%) (A9418σ)涂层衬底(s)作为控制。表面被涂上一层ECM蛋白质解洁净工作台内48小时在室温下,洗两次与PBS细胞接种。

2.3。确认存在的涂布Npnt免疫荧光染色

主多克隆兔anti-Npnt (1μg / mL, ab110230, Abcam)添加到Npnt——或者PBS-coated聚苯乙烯在室温下2 h。PBS是用来洗第一次antibody-treated表面两次。之后,表面被孵化1 h与亚历克斯在PBS面粉488山羊anti-rabbit免疫球蛋白(2μg / mL, A11034表达载体)。表面被PBS冲洗两次,并使用荧光显微镜成像(evo®FL细胞成像系统,产品目录号AMF4300,热费希尔科学)。

2.4。肌动蛋白细胞骨架的荧光染色

hDPSCs被播种到24-well板块(面积:2厘米²non-PS)在4×10的浓度³包含10%的边后卫在DMEM /好。在第五天,培养基是吸气和细胞单层冲洗了PBS (Gibco)前固定的两倍。固定的细胞进行使用methanol-free甲醛(16%,w/v目录编号为28906,热费希尔科学)稀释浓度为4% (v/v在PBS (200)μ信用证)在室温下15分钟。细胞被PBS简单冲洗三次之前添加permeabilisation试剂Triton x - 100 (0.1%,v/v在PBS) (400μ信用证)。五分钟后permeabilisation治疗,BSA浓度的1% (w/v在PBS)涌入每(400μ信用证)阻止任何非特异性结合在室温下为30分钟。Phalloidin(目录A12380数量,英杰公司)(工作浓度:2 U / 200μL, 200μ信用证),剧毒和特定的细胞骨架探针共轭的橙色荧光Alexa萤石®(AF) 568染料,用于本地化f -肌动蛋白。使用4核是复染色,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI D9542,σ)(工作浓度:300海里,200年μ信用证)为5分钟。最后,细胞被沉浸在PBS避免干涸和拍摄使用evo FL细胞成像站系统。四个不同的领域被选在荧光显微镜下计数DAPI-stained核的数量。每组之间的平均数量进行了计算和比较。

2.5。细胞增殖实验

对于细胞生存能力测试,50毫升的重组Npnt (10μg / mL)的解决方案是涂在96孔板(351172年,猎鹰)在室温下了两天。井干涸了,与PBS冲洗两次。使用胰蛋白酶hDPSCs与PBS冲洗一次,收获八分钟37°C,通过离心收集(500 ,5分钟,2800年,日本久保田公司),然后在无血清DMEM resuspended。细胞被播种到非、BSA - Npnt、Fn和FCOL1-coated井在8×10的浓度³/好。在18 h, 41 h和64 h, CCK-8试剂添加到每个(10μL /)和1 h和20分钟的孵化器孵化。吸光度是阅读的波长450 nm (iMark™, Bio-Rad)。

2.6。使用Npnt-Derived可溶性RGD肽抑制试验

的RGD-containing hexapeptide KPRGDV,设计基于氨基酸序列的鼠标Npnt (NCBI的参考序列NP_001025007.1)。KPRGDV及其异常对应KPRGEV与最终纯度超过97%来自Sigma-Aldrich,日本。肽是溶解在PBS的最终浓度10毫米,储存在4°C到使用。Npnt (10μg / mL)的解决方案是涌入24-well板(200μ信用证),板枯竭了覆盖洁净工作台打开了两天。细胞接种之前,涂板简单冲洗了PBS(400年的两倍μL /每次)。hDPSCs与KPRGDV preincubated(1毫米)或KPRGEV(1毫米)或PBS车辆10分钟37°C的孵化器。孵化后,细胞被播种到Npnt-coated井在2×10的浓度⁴/在serum-depleted DMEM。后的细胞照片19 h孵化;之后,媒体被变成DMEM包含10%的边后卫。细胞被拍到在43 h和67 h。

2.7。定量逆转录酶聚合酶链反应(存在)

hDPSCs被播种到12-well盘子涂Npnt或其他蛋白质(BSA、Fn和COL-1)在2×10的浓度⁴在37°C /好,孵化有限公司5%₂。在文化5和28天之后,细胞细胞溶解的试剂盒(表达载体)和总RNA提取每个示例使用酸胍盐thiocyanate-phenol-chloroform方法。沉淀步骤后,RNA RNase-free重新用75%乙醇和水。量化的RNA被吸光度测量使用Nanodrop 1000(热费希尔科学)。总RNA反转录成互补DNA(互补)和放大20μL反应系统。实时rt - pcr进行LightCycler®Nano(罗氏)使用由于“快速上手”项目必不可少的DNA探针大师(2 x)(罗氏)。管家基因GAPDH是内部控制。使用的引物如表所示1。SYBR绿色放大是在最初的10分钟的变性95°C,紧随其后的是50周期15 s在95°C(变性),30年代在退火温度(参考表1为每个组引物)和40年代在72°C(扩展)。

2.8。茜素红染色(ARS)

农业研究所是一个富含钙的沉积在细胞培养检测的方法。染色前的媒体吸气过程,细胞被冲洗两次与PBS短暂和固定中性缓冲福尔马林(200年增加10%μ信用证在24-well板;400年μ信用证在12-well板)和光)(060 - 01667年kouichi室温20分钟。固定剂残留物被用蒸馏水洗涤。ARS的解决方案(1%,pH值4.0)和光)(011 - 01192年kouichi补充道,同样体积的固定剂倒,孵化在37°C 5 - 10分钟。ARS的解决方案是丢弃之后;这些细胞被洗使用蒸馏水为另一个1小时和拍照。量化的染色强度,氯化十六烷吡啶(CPC) (10%,w/v在蒸馏水)(c0732 - 100 g,σ)添加到每个(700μ信用证)提取污渍。1 h 37°C下孵化后,中国共产党解决方案被转移到一个新的96孔板(200μ信用证在570 nm)吸光度的阅读。

2.9。统计分析

统计分析是由事后图基HSD测试。被认为是具有统计学意义的结果 。

3所示。结果

3.1。确认在聚苯乙烯表面Npnt的存在

Npnt-coated聚苯乙烯是阳性anti-Npnt-generating绿色荧光光,虽然没有中可观察到荧光PBS-coated控制(图1)。

3.2。在不同的基质细胞形态学观察和细胞数量

细胞的光学显微镜照片播种在五个不同的衬底(s)在图所示2(一个)。直到116 h,观察到细胞noncoated和BSA-coated团体仍是圆形的,没有发现细胞扩散的两组。细胞Npnt、Fn, FCOL1-modified表面成功,传播,和adopted-flattened或纺锤形;细胞继续生长在五次点的观察三组。观察细胞数量的显著差异Npnt - (1.95±0.13×10⁴),Fn - (3.00±0.27×10⁴),FCOL1 - (3.25±0.41×10⁴)涂层基质比PBS (s) - (0.10±0.04×10⁴)和BSA - (0.38±0.20×10⁴)涂在第五天对照组。Npnt-coated组的细胞数量略低于Fn - FCOL1-coated组( ),而检测中没有发现区别Fn -和FCOL1-coated表面(图2 (b))。

3.3。细胞骨架的可视化

成熟的肌动蛋白纤维应力形成并清晰地观察到Npnt, Fn和FCOL1-coated non-PS井(图3)。

3.4。细胞生长在没有血清

hDPSCs扩散率的分析,以应对各种衬底使用CCK-8试验(s)。三个矩阵蛋白(Npnt、Fn和FCOL1)显著促进了细胞的增殖没有血清在18 h,这效果持续到64 h(图4)。在18 h, hDPSCs的可行性Npnt(0.33±0.01)略低于FCOL1 (0.36±0.00)。41小时postinoculation,细胞的生存能力在Npnt(0.50±0.03)是在同一水平上FCOL1组(0.51±0.02)。在64 h,细胞的可行性Npnt(0.70±0.06)实现五组中最高的,而细胞的生存能力Fn仅略增广;FCOL1组细胞生长进入静态阶段自64 h值几乎不变相比,在41 h (41 h: 0.51±0.02和64 h: 0.50±0.02)。两个负对照组细胞停止生长所说明的可行性。值得注意的是,在64 h,生存能力的细胞noncoated(0.23±0.01)和BSA-coated(0.15±0.01)下降相比,他们更早的时间点数据(在18 h noncoated: 0.29±0.00, 0.33±0.00 41 h;在18 h BSA-coated: 0.17±0.01, 0.18±0.01 41 h)。

3.5。肽抑制试验

图5表明,粘附和传播hDPSCs被KPRGDV抑制(图5(一个)中间的照片上面板,和5 (b));细胞被成功地连接和传播在KPRGEV Npnt-coated表面,或接受pbs组。DAPI-stained核的计算进一步证实的贴壁细胞数量显著减少Npnt-RGD preincubated组,表明细胞的粘附Npnt-coated衬底(s)部分是由RGD域内Npnt(图5 (b))。此外,添加KPRGDV阻碍了传播hDPSCs(图5 (d))。天冬氨酸的变化(D)为谷氨酸(E)完全废除了抑制:细胞控制peptide-KPRGEV集团没有任何负面影响的参数测量(数据5(一个)19 h的边后卫,5 (b),5 (e))。测试是否RGD肽的抑制作用是可逆的,19 h粘附后,血清DMEM替代血清完全培养基。如图5(一个)(中下游面板),在43 h和67 h, Npnt-RGD的细胞粘附和传播集团整合后恢复的边后卫,暗示这种抑制细胞粘附活性是可逆的。

3.6。实时rt - pcr

整合素的基因表达谱(s)在早期(第五天)为特征。这是显示在图6ITGA1和ITGB1同时调节到1.31±0.04倍( )和1.87±0.09倍( 分别通过Npnt。表达ITGA8,有趣的是,报道的受体Npnt,被发现在Npnt-coated一成不变的。ITGA2 Npnt-coated组中表达下调(0.86±0.01倍, )。没有变化的表达式ITGA5 Npnt-coated组,而在Fn-coated集团表达适度减毒与控制。28天,硬组织形成标记的表达包括DSPP、BSP,和四个整合蛋白调节Npnt评估(图五天7)。Fn和FCOL1显著提升的表达DSPP 2.02±0.06倍和1.39±0.11倍,分别,而Npnt下调表达式(0.77±0.07)。另一方面,BSP被发现的所有三个矩阵蛋白质在不同程度上(Npnt: 2.31±0.14倍;Fn: 1.60±0.03倍;和FCOL1: 1.81±0.09倍)。至于整合素的四个亚型,发现ITGA7是大大提升了Npnt(3.31±0.10倍);相反,FCOL1压抑的表达了53%相比noncoated控制。轻微upregulation ITGA1和ITGA4 Npnt组中发现,当ITGB1适度抑制。

3.7。茜素红染色

图8(一个)显示hDPSCs在组织培养聚苯乙烯板进行了矿化培养成骨的媒体19天(总23天文化),表示hDPSCs能够分化成细胞矿化组织形成在体外。随后,发现矿化发生在细胞(高播种6×10³/)培养Npnt——FCOL1-coated衬底(s) (non-PS),尽管延长文化期(总30天,25天成骨的媒体文化)。细胞生长在消极的控制和Fn未能促进明显的矿化结节即使在成骨的媒体(数字的存在8 (b)和8 (c))。

4所示。讨论

我们使用nontissue culture-treated聚苯乙烯(non-PS),一个高度疏水性底物来研究三个矩阵的角色在hDPSCs蛋白质。表面改性的聚苯乙烯,可用多种方法:物理吸附(PA),化学交联、等离子改性,光化学固定,逐层自组装11]。在列出的方法中,PA,也称物理吸附,是最简单和最快的方式实现固定的目标聚合物。考评的主要机制在于分子间的互动范德华力(12]。我们因此选择了PA方法是因为它的方便和安全。蛋白质在溶液中都准备形式和固定化的申请在同一浓度non-PS 10μ克/毫升。涂层表面在室温下枯竭。主要抗体特定Npnt被用来验证蛋白质进行了有效的固定(图1)。细胞被允许坚持24-well板块(non-PS)呈现Npnt Fn, FCOL1,同时;那些生长在PBS和BSA-coated井被送往是负的控制。值得注意的是,相当数量的细胞开始坚持和传播早在1 h 30 m FCOL1组:细胞FCOL1膜突起形成遵守和连接到底层的基础,而那些消极的控制和Fn组保持圆形。Npnt-coated组,虽然在数量上少于FCOL1集团细胞膜突起仍然可以观察到。

早期观察的细胞突起形成的肌动蛋白聚合在FCOL1 Npnt团体表示潜在的积极作用采用这两种蛋白质指导分化的细胞,由后来的ARS回荡染色数据。18个小时后接种,所有三个基质蛋白配体介导的高效的细胞粘附和传播导致一个扁平的形态。因此,对于non-PS呈现在这个特定的蛋白质浓度(10μg / mL),每个蛋白质能有效地促进细胞粘附和蔓延。消极的控制,PBS和BSA未能协助高效细胞粘附和传播在整个时间点观察,表明PBS和BSA拥有细胞粘附图案,因此没有传授细胞粘附的活动。细胞数量的五组进一步表明显著更高数量的细胞连接Npnt, Fn和FCOL1组比PBS和BSA控制(图2 (b))。

接下来,细胞被允许连接到下层提供三种类型的蛋白和细胞骨架结构的固定允许成像。我们使用phalloidin房颤568(红色荧光)压力可视化肌动蛋白纤维。hDPSCs传播形态,肌动蛋白纤维在Npnt跨细胞的尺寸,Fn, FCOL1-coated表面(图3)。然而,细胞培养在PBS -或BSA-coated井未能生成类似的细胞骨架结构矩阵所示protein-coated组。是证据确凿的膜突出的形成的驱动力是聚合的肌动蛋白丝13]。肌动蛋白细胞骨架的改建过程中扮演着重要的角色在许多生物活性,特别是肌动蛋白聚合的重要性凸显了在干细胞的成骨的承诺,例如,间充质干细胞的成骨分化抑制肌动蛋白聚合使用中断细胞松弛素D(一个肌动蛋白聚合阻塞试剂)(14,15),而感应MC3T3-E1细胞的肌动蛋白聚合Jasplakinolide有助于增强mRNA的表达碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN) (16]。此外,抑制肌动蛋白解聚作用促进了分化(17]。当前结果强调,Npnt可以调解细胞骨架一样表型Fn和FCOL1类似,而PBS和BSA不能。此外,我们描述细胞增殖概要文件在没有血清96 -孔板(non-PS)(图4)。结果表明,播种在PBS和BSA组细胞生长停滞不前,作为三次吸光度读数分两组仍然几乎相同。相反,细胞Npnt集团持续增长,达成最高的生存能力在64 h与其他组相比。上面的数据揭示了小说的hDPSCs Npnt支持经济增长的能力存在,甚至没有血清,以促进细胞附着和增长潜力的暴露纸浆,血液供应的地方通常是被老化或炎症。

进一步阐明特定细胞粘附在Npnt主题,我们调查是否合成hexapeptide KPRGDV来自老鼠Npnt (Npnt-RGD)及其突变体对应KPRGEV (Npnt-RGE)以可溶性形式可能会阻止hDPSCs的附着力surface-presenting Npnt(图5)。我们发现Npnt-RGD可以阻止细胞粘附表面呈现Npnt(数据和传播5(一个)19 h的边后卫,5 (b),5 (d)),而突变Npnt-RGE没有(数字5(一个)19 h的边后卫,5 (b),5 (e))。进一步,尽管Npnt-RGD抑制细胞的粘附在短期(19 h),这种肽的存在并不能阻止细胞附着和蓬勃发展在长期文化(43 h和67 h),当媒体代替血清DMEM DMEM包含10%的边后卫(图5(一个)43岁的h和67 h)。随着技术的发展如化学芯片阵列(18),更多的细胞粘附和功能肽被确定。然而,蛋白质窝藏RGD图案构成细胞粘附的主要识别系统。RGD的图案出现在大量的胶细胞外基质蛋白质和被20多个已知的整合蛋白(19]。可以复制的RGD-integrin结合活性合成短肽含RGD序列,稳定条件下,固定化基质,而不是简单的加法文化传媒(20.]。因此,小型合成RGD序列通常是用来测试是否一个特定类型的细胞的粘附RGD-dependent某些基质蛋白。以前工作Kulkarni等人使用可溶性肽(GRGDNP与GRGESP)透露,牙本质基质蛋白1 (DMP1)促进细胞附着在MC3T3-E1通过RGD域(21]。在这里,我们的研究结果首次证明在治疗由可溶性RGD肽来源于Npnt,附着力和传播hDPSCs Npnt非常废除,表示细胞粘附活动由RGD主题。此外,考虑到粘附的抑制和传播,RGD部分,参与的活动序列以外的RGD建议。事实上,除了RGD,发现了新证据,Phe-Glu-IIe(范)领域的下游RGD与RGD协同行为支持人类的大脑神经胶质瘤细胞的粘附(H4细胞)22]Npnt-coated下层。然而,在hDPSCs范是否扮演类似的角色等待进一步的审查。

理想的支架应能促进附件和扩散所需的特定的细胞群结构和功能受损组织的修复。non-PS高度疏水,这是通常用于哺乳动物细胞在悬浮生长和细菌细胞培养,附件不是必需的。上述结果得出Npnt hDPSC胶粘剂和支持hDPSC增长血清或无血清条件。这种潜在的Npnt启动细胞生长可能产生新方法招募干细胞原位。

整合素,包括α和β跨膜糖蛋白的子单元,是一个复杂的家庭细胞粘附受体调节多样化的功能。的胞质域整合素连接到肌动蛋白细胞骨架。积累的证据表明,整合素和环境线索之间的相声等细胞外基质蛋白在调节细胞增殖和分化是很重要的23]。为了阐明基因表达谱的十种整合素(8α整合蛋白和两个β整合蛋白),实时rt - pcr进行了在早期细胞接种后(5天)。结果强调,Npnt触发的upregulation ITGA1(1.31±0.04倍),ITGA4(1.40±0.05倍),ITGA7(1.33±0.07倍),和ITGB1(1.87±0.09倍)。作为一个广泛表达整合素和共同合作伙伴几乎所有的α整合蛋白,β1整合素(ITGB1或CD29)是主要的质膜受体发射信号从细胞外基质细胞内信号通路;这里的upregulation ITGB1关联使用MDPC-23细胞系(与我们之前的数据10]。大关等人报道增强ITGA1表达导致人类骨骼肌干细胞的分化成(hSMSCs)证明的upregulation牙质sialophosphoprotein (DSPP),牙本质涎蛋白(DSP)和碱性磷酸酶(ALP) (24]。此外,象牙质磷蛋白质——(民进党)包覆聚苯乙烯可以增强在老鼠preodontoblast ITGA4细胞系的表达(T4-4) [25]。另一项研究表明,ITGA7积极hSMSCs有可能分化成成在适当的诱导条件下(维甲酸和骨形成含有(BMP4)) (26]。在目前的实验结果表明α1β1,α4β1,α7β1可能参与在早期阶段的Npnt-mediated粘附和细胞内的信号。相比之下,没有高度的表达ITGA8以定量rt - pcr Npnt-coated组。的影响表现ITGA8 Npnt组表明补偿效果与其他α整合蛋白,如ITGA1 ITGA4, ITGA7形成与整合素形成β1或/和早期的角色ITGA8。差别没有检测到,因为它晚了对这些此外,轻微的衰减ITGA2 ITGA6表达式Npnt-treated组中观察到。除了海拔ITGA3 ITGA7, FCOL1会使其余α整合蛋白(ITGA1, ITGA2、ITGA4 ITGA8)而不影响ITGA5 ITGA6。值得注意的是,表达式ITGA8(0.46±0.05倍, )被发现显著减少FCOL1的影响下。Fn(1.55±0.01倍, )和FCOL1(1.63±0.08倍, )增强ITGB1的表达水平的统计学意义,而两组之间没有差别。关于ITGB3,发现其在noncoated mRNA表达保持不变,BSA-coated, Npnt-coated团体和被Fn和FCOL1抑制。数据表明Npnt选择性地调节mRNA表达ITGA1, ITGA4, ITGA7。然而,这仍有待澄清具体的整合素受体(α1β1,α4β1,或者α7β1)扮演着主导的角色在调停hDPSCs的附着力和分化。要回答这个问题,使用抗体抑制试验是必要的α1β1,α4β1,α7β1在未来的研究中。

此外,晚期基因表达分析在图7透露,Npnt倾向于直接hDPSCs的向成骨细胞的分化谱系odontoblastic血统,而是DSPP,行之有效的成牙质细胞分化标记(27),被Npnt适度抑制,但BSP,一个被普遍认可的成骨细胞标记,28)是显著增强Npnt相比其他组。结果与前一个工作相关Kahai et al。29日),这表明Npnt hDPSCs诱导分化为成骨细胞,而不是成牙质细胞。然而,Npnt仍然声音在盖髓治疗中的应用潜力,作为涂料hDPSCs Npnt显著增强基质矿化。此外,ITGA7被发现显著增加了Npnt多达三倍比noncoated控制,表示,可能需要ITGA7 Npnt之间的交互和hDPSCs后期的成骨细胞的分化。

检查是否有涂层的聚苯乙烯基质蛋白可能导致一个增强的矿化,在体外矿化能力hDPSCs各基质(s)都是被监控的。正如所料,细胞的诱导分化Npnt和FCOL1导致矿化结节的出现了茜素红染色在30天。此外,我们观察到一个较低的初始种子数量未能启动后的矿化培养为同一时间,无论是noncoated还是protein-coated表面,表示足够数量的细胞(在目前的工作:6×10³/毫升24-well板块)必须确保可观的发病晚期石灰质的沉积。的矿化活动,比较Npnt, Fn, FCOL1透露,Npnt和FCOL1都承诺在诱发密集的石灰质的沉积。这项发现暗示Npnt假设与FCOL1可比mineralization-inducing能力,这是一个证据充分的组织工程材料(30.,31日]。有趣的是,尽管RGD-containing Fn支持hDPSC增殖,细胞生长在没有接受一个明显的矿化Npnt和FCOL1也是如此。早先的工作表明,Fn促进矿化,尽管比COL1在较小程度上,在牛血管细胞(32]。一个可能的解释观察到的现象可能是由于不同类型的细胞。此外,除了RGD,还有其他细胞蛋白胶图案,即PHSRN。Fn与细胞的相互作用不仅是通过RGD但RGD的协同行动,PHSRN和其他潜在的主题。此外,有各种粘附蛋白的边后卫和分泌细胞;涂覆蛋白质并不是孤立地发挥他们的影响力:细胞暴露在固定化蛋白质相互作用的背景下,各种本地integrin-binding蛋白质。茜素红染色数据显示,加速细胞粘附和增殖并不一定会导致矿化的最终增强。

根据研究结果,建议FCOL1 Npnt拥有类似的能力在促进增殖和诱发hDPSCs密集的矿化。然而,关于成本效益,FCOL1站未来应用的更好的机会,比Npnt FCOL1更便宜的价格。尽管有这样的限制,目前的实验阐明小说角色在调制Npnt hDPSC整合素表达和改变与微环境的相互作用,导致矿化。

5。结论

总的来说,结果表明,Npnt促进hDPSC粘连和蔓延到疏水性nontissue culture-treated聚苯乙烯。的附着力和传播hDPSCs Npnt是部分由RGD主题。此外,Npnt作为生物活性的信号来启动ITGA1 upregulation, ITGA4, ITGA7, ITGB1早在第五天。进一步的mRNA表达DSPP被Npnt略有下调,而BSP显著增强。最后,后期矿化明显增强细胞培养在Npnt-coated和FCOL1-coated井比消极的控制。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突的关于这篇文章的出版。

确认

这项工作是由jsp KAKENHI格兰特。JP15H05024 Takashi齐藤,JP17K17139贾庆林唐。

补充材料