文摘

人类胚胎干细胞(为)被广泛用于阵列的研究来理解不同的机制如早期人类胚胎发生、药物毒性测试、建模、疾病和细胞替代疗法。协议的定向分化为其向特定的细胞类型往往需要长期的细胞培养。为了避免细菌污染,这些协议包括添加抗生素pen-strep、庆大霉素等。虽然氨基糖甙类、链霉素、庆大霉素已被证明导致各种动物模型,细胞毒性的影响这些抗生素为还不清楚。在这项研究中,我们发现,抗生素,pen-strep,庆大霉素并不影响hESC多能性的细胞生存能力或表达标记。然而,在对神经定向分化和肝的命运,重要的细胞死亡是通过激活半胱天冬酶级联。神经祖Pax6标记的表达,Emx2, Otx2和Pou3f2显著降低表明庆大霉素可能影响胚胎早期神经发生而没有效果出现在内胚层分化期间或肝标记的表达。我们的研究结果表明,在细胞培养中抗生素的使用媒体的维护和分化为需要在使用前彻底的调查,以避免错误的结果。

1。介绍

抗生素通常用于实验室长期干细胞文化避免细菌污染。Penicillin-streptomycin (pen-strep)是最常用的抗生素之一,在细胞培养媒体控制细菌污染。然而,许多的细菌菌株耐pen-strep。在这些情况下,其他广谱抗生素如normocin和庆大霉素(1]。细胞毒性的影响庆大霉素已报告在动物模型(审查,看2])。庆大霉素也广泛用于治疗由革兰氏阴性细菌引起的感染。在动物和人类模型中,据报道,使用庆大霉素引起耳毒性和肾毒性(3,4]。动物治疗庆大霉素治疗剂量高的显示广泛的近端肾小管细胞坏死(4]虽然低剂量庆大霉素诱导细胞程序性死亡通过激活半胱天冬酶级联(5]。此外,治疗剂量庆大霉素已被证明导致新生儿听力损失和肾毒性(6,7]。尽管众所周知,氨基甙类抗生素可以穿过胎盘,孕产妇的影响使用这些抗生素对早期胚胎发育是否仍然不是众所周知的。

人类胚胎干细胞(为其多能细胞,可以分化成三个胚芽层,外胚层、中胚层和内胚层,协议为其向特定细胞定向分化的血统已发表(8- - - - - -11]。hESC-derived细胞系的可用性开放的可能性来检测各种药物的细胞毒性以及可能使用它们作为发展模式来理解不同的毒素或致畸剂对早期人类胚胎的影响,否则可能只在动物模型。

自从庆大霉素在怀孕期间可以穿过胎盘,它可能导致负面影响对发育中的胎儿的器官。因此本研究旨在了解常规使用抗生素的效果如pen-strep和庆大霉素hESC增殖和分化对神经系统和肝脏命运要记住,这可能也有助于理解这些氨基甙类抗生素的副作用在早期人类胚胎体内。

2。材料和方法

2.1。细胞培养、分化和抗生素治疗

为(H9 WiCell研究所)保持在基底膜基质feeder-free条件(康宁,猫。mTeSR1介质(354227)涂板数量的干细胞技术,猫。段落37至46 05850)和数量在所有的实验。神经感应协议是复制发布之前(11,12]。简单地说,50000个细胞/厘米²被镀24好板涂层与基底膜基质和维护mTeSR1媒介,直到完全汇合的。中被替换为神经感应介质包含KSR媒体(15%击倒血清替代(KO-SR Gibco,猫。号10828028),1%谷酰胺(100 x-gibco,猫。号25030081),1% MEM (Hyclone猫。SH40003.01数量),0.1% beta-mercaptoethanol (Gibco猫。在淘汰赛DMEM (31350010) Gibco,猫。数量10829018)补充LDN193189(干细胞技术,猫。编号72142 - 1毫克批号SCO4565),骨形态发生蛋白抑制剂1型受体(100海里)和SB431542 (Milipore,猫。616461号- 5毫克批号D00165595),和激活素受体抑制剂(10μ米)和N2媒体(8.5毫米葡萄糖,1 x n (Gibco,猫的补充。在DMEM / F12 (17502048) Gibco,猫。数量17330 - 032,1:1))。最初的5天的分化包括100%的KSR媒体逐渐取代N2媒体从第五天开始25% N2, 50% N2, 75% N2, 100% N2。分化进行了总共12天。

对于肝分化,我们采用协议发表之前(10,13]。短暂,H9细胞培养在feeder-free条件Matrigel-coated盘子mTeSR1直到70 - 80%汇合的媒介。在这一点上,与明确的内胚层分化诱导代替mTeSR1媒体(DE)感应媒体组成的rpmi - 1640 (Gibco,猫。数量11875093)补充2% B27 (Gibco猫。17504044),100 ng / ml苯丙酸诺龙(研发系统,猫。338号- ac - 050), 50 ng / ml Wnt3a(研发系统,猫。5036号- wn / CF), 1毫米丁酸钠(Sigma-Aldrich,猫。303410号)第一个24小时。媒体改变了Na丁酸的浓度降低到0.5毫米,每24小时培养与媒体变化。经过5天的文化、媒体改变了肝细胞分化KO-SR媒体包含KO-DMEM补充20%,0.5%的谷酰胺,不必要的氨基酸1%,0.1毫米β巯基乙醇,1% DMSO (Sigma-Aldrich猫。D8418)和培养5天肝祖细胞。抗生素,penicillin-streptomycin (10000 U / ml,猫。数量15140122)、庆大霉素(50毫克/毫升,猫。15750060)数量从热费希尔科学和购买作为显示在文本。

2.2。RNA隔离和rt - pcr

总RNA分离使用MasterPure™RNA净化装备从震中(猫。数量MCR 85102)根据制造商的指示。互补脱氧核糖核酸的合成,1.0μ克总RNA中反向转录20μl反应使用上标®很互补脱氧核糖核酸合成工具包(猫。数量11754050)按照制造商的指示。实时执行中存在使用SYBR®绿色实时PCR反应混合液(热费希尔科学)10或20μl反应体积。实时PCR反应中使用的引物序列引物获得银行(https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html),表中列出1。

2.3。蛋白质的提取和定量

未分化、神经或hepatic-differentiated为其培养24 -(康宁,猫。3527号)或4板(热科学、猫。176740号),预镀与人类ESC合格基底膜基质(康宁,猫。354227号)。细胞与无菌冲洗1 x-d-pbs(干细胞技术,猫。37350号),轻轻刮使用无菌细胞刮刀(Sarstedt,猫。1 x 83.1832)人数里帕缓冲区(Abcam ab156034)包含1 x停止蛋白酶和1 x停止磷酸酶抑制剂鸡尾酒(热科学、猫。数量1862209,猫。号码1862495)。原油溶解产物是离心机在4°C 14000 rpm 10分钟。 The supernatant containing the total cellular protein was quantitated with Pierce BCA Protein Assay Kit (cat. number 23225) using the Infinite M200Pro multimode microplate reader (Tecan). The quantitated protein was denatured by heating in NuPAGE LDS sample buffer (Life Technologies, NP0007) for 10 min at 70°C and 40μg整除的蛋白质样品缓冲被冻结在−80°C到使用。

2.4。sds - page及免疫印迹

3。μ克的蛋白质是随着加载精度+双颜色标准(Bio-Rad,猫。1610374),表达+ 4 - 12%的页面上凝胶(GenScript,猫。M41210数量在1 x拖把或M41215)和电泳缓冲(GenScript M00138)在100 V。Electroblotting执行1 x Towbin缓冲以恒定的电压100 V的1小时在4°C。转让后,PVDF膜(热科学、猫。88518号)被烂醉如泥的5%,脱脂奶粉(圣克鲁斯生物技术、sc - 2324)在室温下1 h。膜在PBST洗几次(1 x磷酸盐,含有0.05%渐变20)和孵化一夜之间在4°C适当主要抗体。探讨了膜与过氧化物酶共轭与适当的二次抗体。抗体是下面列出的信息。可视化的乐队,膜与西方SuperSignal孵化皮科和皮尔斯西方毫微微最大灵敏度化学发光底物(热科学、猫。 number 34080 and 34096) or Pierce ECL2 Western Blotting Substrate (Thermo Scientific, cat. number 80196) as per the manufacturer’s instructions. The membranes were superimposed onto UltraCruz autoradiography films (Santa Cruz, cat. number sc-201697), and the films were developed using Carestream GBX developer (cat. number 1900984) and fixer (cat. number 1902485) solutions purchased from Sigma-Aldrich.

2.5。抗体

下面的抗体被用于免疫印迹和免疫细胞化学:Anti-Oct4 (Abcam ab19857) anti-SOX17抗体[3 b10] (Abcam, 60721 ab), anti-FOXA2抗体(Abcam, 84990 ab), anti-HNF-4-alpha抗体[K9218] (Abcam, 41898 ab), anti-PARP抗体(细胞信号技术,9542),anti-caspase-3抗体(细胞信号技术,9662),Nanog (1 e6c4)鼠标马伯(细胞信号技术,4893),Sox2 (L73B4)鼠标马伯(细胞信号技术,4195),GAPDH (14 c10)兔马伯(细胞信号技术,2118),和anti-PAX-6 (Biolegend, 901301)。

2.6。免疫细胞化学

镀处理细胞,在1.9厘米²4板(Nunc-USA),洗两次与PBS和固定3.7%甲醛在室温下12分钟。与PBS的细胞被洗两次,permeabilized孵化10分钟在室温下用PBS - 2% triton-X然后孵化阻断缓冲区(1%牛血清白蛋白在PBS)在室温下15分钟。固定细胞培养用适当的初级抗体在一夜之间在4°C,然后用PBS洗了三次。Alexa Fluor-conjugated适当的二次抗体被添加到细胞在室温下1 h,并与PBS三洗后,这些细胞被复染色与核DAPI染色(热费希尔科学DAPI (4 ,6-Diadino-2-Phenylindole Dihhydrochloride)猫。D1306)。荧光图像是用一个倒置的Axiovert 40节能灯荧光显微镜(卡尔蔡司),配备AxioCam HRc(卡尔蔡司)。

2.7。细胞的生存能力(MTT和LDH)测定

对细胞生存能力分析,为其在96孔培养组织文化菜涂层与基底膜基质。总共有10μl (MTT (3 - (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴)(美国Sigma-Aldrich)(5.5毫克/毫升)在PBS分发到每个好,板是孵化在37°C 4.5 h。MTT-containing介质是小心,100μSDS裂解缓冲的l (15%, 50% N, Ndimethylformamide, pH值4.7)被添加到每个,孵化一夜之间在37°C的在590 nm测定吸光度值标(珀金埃尔默)。乳酸脱氢酶(LDH)测定了使用CytoTox 96®非放射性从Promega细胞毒性分析工具(猫。G1780)。45分钟执行试验之前,10μ每毫升10 x l细胞溶解的解决方案是添加到参与控制细胞和孵化37°C测量细胞LDH释放的最大数量。细胞溶解细胞被视为积极的控制分析。50μl整除的媒体的控制和测试在一式三份转移到一个全新的96孔板。50μl 96年CytoTox试剂添加到每个在室温下孵化30分钟,免受光。50μl停止的解决方案是添加到每个吸光度测量在490海里,一个小时内,使用M200 TECAN无限pro板读者。

2.8。TUNEL分析

终端原位脱氧尿苷三磷酸尼克结束标记(TUNEL)测定进行细胞保持在96孔板,使用tac®2 tdt-dab原位细胞凋亡检测设备从Trevigen(猫。号码4810 - 30 - k)。为肝分化,大约12000个细胞被播种/;而对于神经分化,细胞被播种在24小时内confluency postseeding达到100%。细胞被冲洗1 x PBS和固定缓冲3.7%甲醛溶液在室温下10分钟。细胞被洗1 x PBS和permeabilised 50μl蛋白酶K的解决方案(与去离子水稀释1:50),在室温下15分钟。与去离子水的细胞被洗两次,内源性过氧化物酶被孵化淬火淬30%过氧化氢溶液(Sigma-Aldrich H1009)在甲醇在室温下5分钟。清洗后的细胞1 x PBS 1分钟,细胞的平衡在1 x TdT标签缓冲区在室温下5分钟。细胞都采用适当TdT)进行标签标记反应混合在37°C 1小时湿度室。TUNEL负控制,参与细胞被贴上标签的主人没有混合的末端转移酶的酶。Antibiotics-treated细胞被贴上标签的反应混合组成的核苷酸,50 x锰阳离子,末端转移酶酶1 x TdT)标签缓冲区。TUNEL阳性控制,nonantibiotic-treated细胞被贴上标签的反应混合含有核酸酶的酶。标签的反应是停在孵化细胞1 x TdT挡车器在室温下5分钟。这些细胞被洗两次去离子水5分钟和50孵化μl (Strep-HRP抗体(1 x PBS稀释)在室温下30分钟。这些细胞被洗两次1 x PBS 2分钟和孵化民建联溶液在室温下7分钟。细胞与去离子水冲洗几次,和图像捕获使用20 x evo XL的阶段目标核心细胞成像系统(热费希尔科学)。

2.9。流仪结果

H9细胞培养在feeder-free条件Matrigel-coated 24-well组织培养板(康宁,猫。3527号)mTesR1媒体5天。细胞被沾anti-Oct4主要抗体(Abcam猫。ab19857)和可视化二次免疫球蛋白(山羊anti-Rabbit免疫球蛋白(H + L), Alexa萤石488共轭微孔(猫。AP132J44)。仪数据流染色的细胞收购FACSCanto II流血细胞计数器(美国BD生物科学)。10000细胞收集的数据进行了分析使用FACSDiva软件(BD生物科学)。

2.10。统计分析

所有的实验都在一式三份。结果显示平均值±标准偏差(SD)。统计分析了使用GraphPad软件(双尾未配对的学生的t以及)星号代表差异显著( , , )。

3所示。结果

3.1。庆大霉素和Penicillin-Streptomycin hESC扩散

为了了解抗生素的效果,庆大霉素和pen-strep增长和为其的可行性,使用最广泛的hESC线、H9细胞生长在feeder-free mTeSR1介质条件和不同浓度处理的庆大霉素从0,10、25、50、200μg / ml结合无民事行为能力人或者pen-strep (100 U /毫升- 100μg / ml) 2到5天测试对细胞活力的影响。MTT测定被播种表现在96年好板20000细胞/每个抗生素浓度在一式三份。没有区别在细胞生存能力观察庆大霉素治疗不同浓度的单独或结合pen-strep包括那些处理高浓度庆大霉素,也就是说,200年μg / ml单独或结合pen-strep(图1(一))。为了确定这些抗生素对多能性的影响或为其的集落形成,细胞被播种在1.9厘米²组织培养的菜肴和抗生素浓度处理如上所述的5天。相衬显微镜的图像捕获殖民地形象化。细胞被固定和染色为多能性使用抗体标记Oct4(数字1 (b)和1 (c))。没有区别的集落形成效率或Oct4表达的水平量化的流式细胞仪观察井的治疗。此外,如果有任何变化的表达多能性标记,Oct4、Sox2, Nanog在RNA水平,分析了存在,免疫印迹蛋白质水平。无显著差异表达的任何观察这些标记在核糖核酸或蛋白质水平antibiotic-treated样品相比,未经处理的控制(值> 0.05)(数据1 (d)和1 (e))。

在一起,这些结果表明,治疗为抗生素庆大霉素或pen-strep没有影响他们的生存能力,多能性、集落形成能力。

3.2。庆大霉素和Penicillin-Streptomycin对神经的影响命运规范

抗生素的神经毒性效应一直在报道一些先前的研究,包括使用抗生素的可能性的母亲在怀孕期间可能会影响中枢神经系统的发展,影响胚胎早期神经发生(审查,看14])。为了验证这一点,我们复制神经分化协议如前所使用的我们和其他人11,12,15,16]。短暂,H9细胞种植在feeder-free条件Matrigel-coated mTeSR1媒体组织培养的菜肴,直到细胞被完全汇合的。一旦汇合的,神经分化诱导神经感应开关mTeSR1媒体媒体使用双重SMAD抑制协议导致神经干细胞的分化皮质神经干细胞特异性标记物的表达,命运Pax6, Emx2, Pou3F2, Otx2,山峰days10-12分化的11]。疣状和存在的差别分析显示对这些多能性标记,Oct4 Nanog,和神经干细胞标记Pax6 upregulation Emx2, Pou3F2, day7 Otx2和day12神经感应确认确实向神经细胞分化的命运(数字2(一个)和2 (b))。证实了差异化协议后,我们使用相同的方法来区分H9在存在抗生素浓度正如上面所讨论的十佳保留细胞进行分析。总RNA被隔离和检查执行中存在神经干细胞标记物的表达。我们发现Pax6的表达、Emx2 Pou3f2, Otx2基因已知需要适当的神经发育(12,17)被不同的抗生素浓度(图不同的影响3(一个))。Pax6的表达随浓度增加而降低庆大霉素的50μ克/毫升和200年μg / ml庆大霉素显示最高的减少Pax6表达式。pen-strep治疗但并不影响Pax6的表达,而pen-strep的组合与不同浓度的庆大霉素显示类似Pax6的表达降低庆大霉素仅表明Pax6观察到的表达下降主要是由于庆大霉素。类似的其他神经干细胞标记物的表达减少,Emx2, Pou3f2, Otx2,也观察到。为了试验的特异性改变这些基因的表达,我们检查的表达Polr2g Rpb7亚基基因编码的RNA聚合酶II,广泛表达在神经分化过程中(12]。我们没有看到任何重大改变Polr2g基因的表达在抗生素治疗样品未经处理的控制相比,这表明这些基因的表达变化,因为抗生素治疗是特定的基因。此外,Pax6分析在蛋白质水平的表达蛋白免疫印迹显示类似antibiotic-treated减少样品在RNA水平存在(图3 (b))。

这些结果表明,庆大霉素专门和不利影响早期神经干细胞标记物的表达,因此它的使用可能会损害体外神经分化过程。

3.3。庆大霉素和Penicillin-Streptomycin对肝的影响命运规范

最近几个协议开发分化为成hepatocyte-like细胞可能是有用的在药物开发等研究和药物毒性测试(18,19]。hESC分化成肝细胞的主要步骤是诱导的细胞最终内胚层(DE)后肝祖细胞,然后通过分化为成熟肝细胞的年龄在18岁至25岁之间的天左右完成,因此需要添加抗生素的培养基。因此,作为检测神经分化,我们问抗生素的存在是否会影响内胚层的表达或肝标记可能最终影响自己的命运。过去在动物模型研究表明胎儿肝脏中庆大霉素的存在当母亲在怀孕期间服用治疗剂量庆大霉素(20.]。因此,任何影响抗生素在hepatogenesis指出我们的体外模型也会影响其效果在子宫内。我们适应了建立协议(10,13)和增长H9 feeder-free条件下细胞分化成肝细胞。收集细胞5天检查Foxa2和Sox17 endoderm-specific标记的表达。如图4(一),Oct4的表达已经明显减少了5天的分化,而Sox17的表达和Foxa2显著调节在每天5比0。媒体随后转向肝细胞祖5天。之后,这些细胞被收集和检查肝祖标记的表达,HNF4α,这被发现显著监管每天9比5(图4(一))。这些标记的分化进一步证实了存在(图4 (b))。在一起,这些结果证实肝分化协议的可行性。

使用这种方法,我们对H9细胞与不同浓度抗生素庆大霉素有或没有pen-strep分化之前和他们对肝的命运。总RNA分离每天5和9的区别,和执行中存在Foxa2和Sox17第五天样品。无显著差异( )观察RNA表达这些标记的样品在10到25μg / ml庆大霉素结合或不pen-strep比未经处理的样品。然而,细胞治疗50和200μg / ml庆大霉素结合pen-strep显示在2.0到2.9倍增加表达的基因与未经处理的样品相比。然而,这些差异并不一致(图5(一个))。因此我们得出结论,尽管Foxa2表达的增加和Sox17观察高剂量庆大霉素+ pen-strep治疗,这些差异并不显著。分化的RNA收集了9天检查肝祖HNF4标记α和GATA4。重要的是,经抗生素治疗后的细胞表现出显著水平的分化肝细胞死亡。抗生素浓度的细胞死亡,200μg / ml庆大霉素和50和200μg / ml庆大霉素结合pen-strep,是如此之高,以至于没有很多细胞离开从9天的区别进行进一步分析。HNF4 RNA表达水平α和GATA4但是没有任何显著差异表达的其他抗生素浓度与未经处理的样品相比(图5(一个))。此外,表达分析Sox17、Foxa2 HNF4α在蛋白质水平的免疫印迹每天5和9的样本分化显示类似的结果,观察到存在(图5 (b))。这些结果表明,抗生素庆大霉素和pen-strep不影响表达的内胚层和肝祖标记体外hepatogenesis过程中。

3.4。在体外细胞分化庆大霉素引起细胞凋亡

氨基糖甙类、庆大霉素和链霉素引起细胞凋亡在动物和细胞培养模型主要在肾小管和内耳的感觉细胞(2,21- - - - - -23]。如上所述,我们没有观察到任何重要的细胞死亡在H9细胞增殖mTeSR1媒体补充不同的抗生素浓度为5天。然而,在分化H9细胞对肝和神经的命运,我们观察细胞死亡的重要水平尤其是在更高浓度的庆大霉素和庆大霉素结合pen-strep(图S1网上https://doi.org/10.1155/2017/2451927)。尤其是在肝分化过程中,细胞死亡是如此严重,以至于我们无法收集细胞分化从第九天,样品处理50和200μg / ml庆大霉素单独或结合pen-strep进行进一步分析。因此,识别这些抗生素对细胞死亡的影响在分化,我们培养和分化H9细胞对神经系统和肝脏命运使用相同的协议如前所述96 -孔板和化验细胞生存能力。向肝细胞分化命运收集5天,和那些对神经命运收集10天的MTT测定分化。MTT试验的结果显示,减少细胞生存能力在25岁,50和200μg / ml庆大霉素和庆大霉素pen-strep总和。细胞生存能力稳步下降与庆大霉素浓度从25到200年μg / ml肝和神经H9细胞的分化。低浓度的庆大霉素(10μg / ml)单独或结合pen-strep或独自pen-strep没有造成显著减少细胞的生存能力与未经处理的控制(数据相比6(一)和6 (b))。进一步确认是否减少细胞生存能力由于抗生素治疗的结果增加了细胞的死亡,我们执行LDH测定。文化媒体的LDH释放量由于细胞膜受损是指示性的细胞死亡。我们发现用抗生素治疗会导致显著增加大量的LDH释放在肝和神经分化的数字6 (c)和6 (d))。甚至庆大霉素浓度最低的用于本研究(10μg / ml)显示在分化LDH释放含量严重超标。antibiotic-induced细胞死亡在肝和神经分化也评估了TUNEL检测用于检测受损DNA链通常与凋亡细胞死亡有关。我们发现从10开始TUNEL阳性细胞数量的增加μg / ml庆大霉素单独或结合pen-strep在肝分化;然而,对于神经分化,增加观察从25μg / ml庆大霉素单独或结合pen-strep(数字6 (e),6 (f),6 (g))与未经处理的控制。这些结果表明,死亡的原因可能由于抗生素apoptic自然。之前的研究表明,庆大霉素等氨基甙类抗生素引起细胞凋亡的激活半胱天冬酶级联(2,24]。测试是否还存在激活细胞死亡负责观察,我们分析了著名的表达凋亡标记pro -裂解caspase-3通过免疫印迹使用细胞溶解产物收集肝和神经分化细胞治疗不同的抗生素浓度如上所述。我们还检查通过免疫印迹完整的表达和裂解聚ADP-ribose聚合酶(PARP)在同一溶解产物,并与GAPDH控制确认细胞凋亡(25- - - - - -27]。procaspase-3的水平稳步下降,增加活动caspase-3表达的水平在治疗抗生素庆大霉素或庆大霉素结合pen-strep观察在神经系统和肝脏分化(数字6 (h)和6(我))。活跃的PARP的水平也增加了同样用抗生素治疗后比未经处理的控制。有趣的是,尽管低浓度庆大霉素(10μg / ml单独或结合pen-strep)没有显示显著水平的TUNEL阳性细胞在神经分化,水平的提高有积极的PARP和裂解caspase-3在这个抗生素浓度在肝和neural-differentiated细胞比未经处理的细胞。这表明,即便是低浓度的庆大霉素能够诱导细胞凋亡在H9细胞的分化。整体而言,这些结果表明,H9细胞的治疗与庆大霉素或结合pen-strep造成重大的诱导细胞凋亡caspase-3在分化对肝以及神经的命运。

4所示。讨论

尽管如此,许多研究已经测试了氨基苷类抗生素对离体培养和分化的影响(28- - - - - -31日]如骨髓的干细胞——或者脂肪tissue-derived干细胞以及小鼠的ESCs,根据我们的知识没有研究已经进行到目前为止测试氨基苷类抗生素对hESC增殖和分化的影响。这些早期的研究的共同结果是细胞毒性和缺陷谱系特定分化,两个重要的观察指出,在为我们的研究。我们的研究结果表明,用抗生素治疗H9细胞对细胞生存能力或不显示任何影响表达多能性标记,Oct4、Sox2,和Nanog在RNA和蛋白质水平。在与这相反,这些细胞的定向分化对神经以及肝的命运显示显著的细胞死亡在不同庆大霉素浓度逐渐增加建议剂量依赖性。问题出来了,为什么没有变化未分化的细胞的增殖和细胞生存能力的抗生素虽然在分化,细胞容易受到这些抗生素。其中一个可能性可能是H9细胞适应抗生素的多能性状态。尽管WiCell研究所报告从这些细胞获得维持这些细胞pen-strep的存在,没有报告接触庆大霉素。从WiCell获得细胞后,这些细胞没有任何类型的抗生素中培养我们的实验室除了本研究。因此,他们不能适应庆大霉素。然而,它是可能的,未分化的多能细胞有可能更好地适应畸胎原接触相比在分化。 Undifferentiated ESCs are pluripotent cells with the potential to be differentiated into all three germ layers. Therefore, cell survival mechanisms in undifferentiated ESCs might be more precise than differentiated cells to maintain genome integrity to avoid transfer of errors to differentiated progeny [32- - - - - -34]。因此,未分化的ESCs可能细胞生存机制不同于他们的分化后代33),可能更抗致畸剂的影响(35]。支持这一观点的研究在过去以后最初在小鼠和人类的ESCs显示细胞防御机制由于各种压力相比,未分化的ESCs上乘分化细胞(35,36]。认为是有效的在未分化的细胞,对压力的反应可能会从低水平的压力代在这些细胞以及高度活跃的压力防御机制(37]。另一个可能性是,DNA损伤积累或突变导致这些细胞致畸剂可能导致自发分化或凋亡影响的细胞的干细胞群。然而,H9细胞用抗生素治疗后,我们看到增加的细胞死亡和减少水平的多能性标记表明抗生素不导致这些细胞自发分化或凋亡。因此,未分化的ESCs公差对抗生素在我们实验可能是由于更高效率的细胞防御机制相比,这些细胞在分化。事实上,之前的结果在小鼠和人类的ESCs表明这些细胞都配备有高效抗氧化防御机制对抗活性氧(ROS)生产由于更高的抗氧化酶的表达水平以及更低的多的线粒体氧化磷酸化和更少的依赖,所有这些就会大大减小在分化(37,38]。氨基苷类抗生素诱导的分子机制之一,在哺乳动物细胞凋亡信号级联是通过过度代ROS (39,40]。它已经表明,庆大霉素与铁(Fe形式复杂^三世胞质,羽菲)^二世。这个铁^二世庆大霉素复杂关联与膜脂质如花生四烯酸导致其过氧化导致过度ROS生成氧气分子的存在。因此,增加活性氧的生产由于抗生素和抗氧化防御机制在区分ESCs的减少可能会导致增加了细胞死亡中观察到我们的研究对肝和神经分化谱系。此外,它也认为,更高的效率ESCs压力耐受性的差异可能是由于细胞的参与应激反应,热休克蛋白70 (HSP70)家族的蛋白表达在未分化的ESCs的高水平,但在分化细胞中表达下调(37,38,41]。休克蛋白是一组蛋白诱导的各种化学和生理压力保护细胞不受伤害的能力作为蛋白质监护人通过阻止蛋白质错误折叠和凋亡功能由于激活的抑制半胱天冬酶级联作为HSP70的报道(42,43]。为此,小鼠的研究表明,本构的超表达HSP70抑制aminoglycoside-induced头发细胞死亡(44]。检查是否在未分化的ESCs HSP70基因表达,他们的水平是否改变分化后,我们使用全基因组转录组数据发布的乔伊斯et al。([12),http://cortecon.neuralsci.org/)H9分化成神经元。我们发现确实HSP70-2的表达,HSP70-4,和HSC70 (HSP73)基因在神经分化相比大幅下调未分化的ESCs(数字S2A、B和C)。因为我们使用相同的方法所使用的神经分化的乔伊斯et al .,我们假定这些HSP70s会被下调的水平在神经分化我们的实验。因此,HSP70蛋白的高表达水平无差异的ESCs可能是一个机制,通过这些细胞能够对抗凋亡引发氨基苷类抗生素引起的。

另一个机制可能是通过直接互动与监护人蛋白质的氨基糖甙类,HSP73 calreticulin, climp - 63 (40),导致其失活。这些监护人蛋白质的功能是帮助内质网的蛋白质折叠和质量控制,和一个缺陷可能引起的蛋白质反应通路可能导致细胞凋亡。已经显示的女伴活动HSP73和calreticulin被庆大霉素(40]。此外,庆大霉素引起二聚和失活climp - 63在肾小管细胞造成gentamicin-induced细胞毒性(45]。尽管calreticulin和clipm - 63的表达水平并没有改变在神经分化,HSP73降低了超过两个的表达(图S2C)。因此,综合效应的低水平的HSP73以及antichaperone氨基糖甙类的活动可能导致aminoglycoside-mediated细胞毒性在分化细胞中观察到我们的研究。然而,由于calreticulin和剪辑- 63的水平是相同的未分化和为其神经分化,庆大霉素antichaperone活动由于不太可能与这两种蛋白质选择性会引起细胞毒性在分化但不是在未分化的细胞。

除了细胞内aminoglycoside-mediated细胞毒性机制作为未分化和差异化的ESCs上面所讨论的,其他机制可能在抗生素的吸收的差异在两种细胞类型。庆大霉素结合特定的表面蛋白在哺乳动物细胞和通过内吞作用进入细胞溶质(46]。在近端肾小管细胞中,庆大霉素结合multiligand绑定受体megalin或LRP2,导致内吞作用和肾积累庆大霉素(47]。有趣的是,我们发现LRP2未分化H9细胞中不表达;然而,在RNA表达水平调节几倍于神经分化(图S2D)表明另一种细胞毒性机制在我们的研究中观察到的差异可能是由于氨基甙类抗生素的吸收可能是更高的ESCs的区分。然而,这些蛋白参与细胞反应的水平氨基糖苷类抗生素如前所述需要检查在内胚层和肝分化也提出类似的监管机制是否在肝分化功能。尽管如此,从这些证据我们仍然可以得出这样的结论:一个或多个氨基糖苷类反应的机制可能涉及导致细胞毒性为其分化。

抗生素对细胞生存能力的影响,在我们的研究是通过激活半胱天冬酶介导的级联的水平的增加活跃caspase-3(凋亡通路刽子手半胱天冬酶)以及裂解PARP表明一个机制,这些抗生素影响区分hESC是通过细胞凋亡。然而,我们的研究结果也建议这些抗生素的浓度更高的可能性可能会引发不同的细胞死亡机制(50和200μg / ml庆大霉素结合或不pen-strep)水平procaspase-3和裂解caspase-3在这些浓度较低。进一步capspase-3裂解和裂解PARP更高的水平即使在低浓度的庆大霉素有或没有pen-strep没有明显的细胞死亡在哪里观察表明proapoptotic在这些浓度条件。相关的注意的是,早期的研究测试的影响对庆大霉素肾近端肾小管细胞有报道,更高浓度的庆大霉素引起细胞坏死而低浓度导致凋亡细胞死亡(5,48]。氨基糖苷类抗生素凋亡细胞死亡的机制包括磷酸化c-jun物途径,从线粒体细胞色素c的释放,激活caspase-9和caspase-35,21,22),而坏死细胞死亡报道由于缺乏TUNEL标记经典的细胞凋亡;相反,坏死的标记,如核酸内切酶G calpain易位和激活,合成和激活组织蛋白酶D被注意到的49]。因此,它是可能的,氨基糖苷类治疗可能会导致多种形式的细胞死亡的浓度和持续时间取决于治疗和可能不是完全依靠典型的凋亡通路(23]。因此,除了细胞死亡引起的激活的caspase-3观察到在我们的研究中,我们不排除其他细胞死亡机制的可能性,这可能是活跃在我们的实验中特别是在更高浓度的庆大霉素结合pen-strep值得进一步研究在分子水平上。

另一个重要的观察在我们的研究是在神经干细胞特异性标志物的表达变化由于抗生素的治疗。它已被证明在某些蛋白质的氨基糖苷类抗生素导致误译真核细胞通过减少翻译终止的效率(50,51]。这是通过阅读特定mrna的终止密码子,从而导致缺陷蛋白翻译。因此,可以推测的是误译的一些蛋白质在神经干细胞分化与重要作用可能导致缺陷的表达神经干细胞特异性标记在这项研究中观测到的。假设连接使用氨基糖苷类抗生素和敏感性神经发育障碍,如自闭症支持这种观点(52]。的机制需要进一步的研究来确定氨基苷类抗生素对胚胎神经发生的影响。

5。结论

从我们的结果,我们得出这样的结论:抗生素、庆大霉素、pen-strep组合影响细胞在分化的可行性为向肝和神经的命运。但是,没有效果出现在细胞生存能力或在未分化的多能性标记的ESCs的表情。我们的研究也没有表现出任何影响干细胞特异性标志物的表达在对肝的分化命运;然而,有趣的是神经干细胞特异性标志物的表达显著降低由于抗生素在神经分化。具体分化期间这些抗生素对细胞活力的影响以及它们对早期胚胎神经发生的影响需要进一步研究在分子水平上。

缩写

为:	人类胚胎干细胞
pen-strep:	Penicillin-streptomycin。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

迪夫s Varghese莎玛Parween,穆斯塔法·t·Ardah贡献同样这项工作。

确认

这项工作是支持的阿拉伯联合酋长国大学研究经费(UAEU),研究启动批准号31 m180和UPAR批准号31日m182 UAEU,医学和健康科学学院(不啻)教师研究批准号31 m207。

补充材料