文摘

人牙髓细胞已经知道干细胞的自我更新和multipotency等特性。这些细胞分化成硬组织通过添加适当的细胞因子和生物材料。Hydroxyapatite-tricalcium磷酸盐(HA-TCPs)是至关重要的组件的硬组织,通常用作生物相容性材料在组织工程骨。软化牙本质矩阵(DDM)据报道,增加骨诱导的效率。我们比较成骨分化的效率和体内骨形成HA-TCP DDM在人牙髓干细胞(hDPSCs)。DDM包含无机组件与HA-TCP一样,如胶原蛋白1型和有机组件。由于这些组件,hDPSCs osteoinduction DDM的潜力是显著高于HA-TCP。然而,体内骨形成的效率在HA-TCP和DDM是相似的。尽管成骨基因表达和免疫功能不全的裸体小鼠的骨形成类似的水平在这两种情况下,dentinogenic DDM移植的基因表达水平略高于HA-TCP。这些结果表明,体内成骨的潜力在hDPSCs诱导HA-TCP和DDM osteoconduction和osteoinduction分别。 In addition, transplantation of hDPSCs/DDM might be more effective for differentiation into dentin.

1。介绍

牙周病、龋齿引起牙周骨缺损,这将导致牙齿脱落。治疗牙周骨缺损的最佳方法是通过整形外科手术诱导骨生成。最近,骨组织工程技术是一种很有前途的临床应用为替换受伤的牙齿组织(1- - - - - -5]。骨再生需要三个组件:干细胞,生物因素,可以接受,提高成骨分化,和脚手架材料应该生物相容性和生物可降解的3]。间充质干细胞(msc)被认为是一种很有前途的来源scaffold-based骨组织工程由于其自我更新和成骨分化潜能(6- - - - - -8]。各种牙科组织含有msc的人群,和牙齿干细胞是确定从牙髓组织,牙周韧带,顶端的乳头,和牙科毛囊(9- - - - - -12]。不像其他msc、牙齿干细胞包括人类牙髓干细胞的优势(hDPSCs)非手术组织收集和简单的文化,这对成人干细胞扩增是必不可少的。其中,hDPSCs包含能力的扩散和多个变异,他们已经申请牙质的再生,牙周韧带,在口腔颌面部骨组织地区(13- - - - - -16]。在成骨分化的早期阶段,DPSCs显示高碱性磷酸酶活动相比,骨骨髓来源msc在成骨的介质17]。DPSCs可以通过论述骨分化因素如骨形成蛋白在体外和体内研究[18- - - - - -22]。然而,使用干细胞技术成熟的骨形成大缺陷没有额外的细胞因子或生长因子仍然是有争议的,尽管他们的成骨分化潜能。冲突可能原因在干细胞疗法和组织工程可能是一个遗弃的干细胞移植后分化及其异构特性。Inorganic-based支架或载体材料如软化骨基质,磷酸钙支架,hydroxyapatite-tricalcium磷酸盐(HA-TCP)用作细胞平台由于其osteoconductivity交付。此外,他们可以作为生物活性分子的水库。HA-TCP具有良好的生物相容性,因为他们的化学和结构组成类似于自然骨组织inorganic-based组件。这些inorganic-based支架osteoconductivity和bone-bonding亲和力租用增强成骨细胞分化和骨细胞招聘。然而,inorganic-based支架有一定局限性,他们有较低的机械过程,他们缺乏生物活性分子的成骨分化组织完整的主机(23- - - - - -29日]。已经有越来越多的兴趣同时软化或脱细胞自然材料的发展具有生物活性作为解决这些问题。许多研究已开展调查生物骨或牙质矩阵是否具有优良的生物相容性和osteoconductivity可以用作干细胞生物材料附件,增殖和成骨分化。之前的研究表明,软化牙本质矩阵(DDM)是由大约55%无机矿物和45%有机材料,如生长因子和细胞因子。基于生化成分,DDM起源于动物诱发骨形成潜在的在皮下和肌肉的钱伯斯在啮齿动物30.),已经被增强的用于治疗骨缺损骨形成(31日,32]。DDM搪瓷矩阵的导数已被成功地用于诊所为几十年来植骨修复材料(33- - - - - -36]。生物相容性和生物活性材料为骨组织再生研究的目的。在这里,我们将展示一种方法来隔离和文化人类DPSCs和用于原位分化使用无机支架进行异位骨再生,而无需额外的刺激。这次调查的第一个目的是评估的综合分析活动HA-TCP或与hDPSCs论述人类DDM体外。第二个目的是确定hDPSCs HA-TCP或人类的能力DDM移植后诱发异位骨形成皮下注射到无胸腺的小鼠体内。

2。材料和方法

2.1。人牙髓干细胞和移植的文化准备

小学文化的人牙髓干细胞(hDPSCs),人类的第三臼齿收集患者15到27岁以下的指导方针批准的机构审查委员会(IRB) Dankook牙科医院(DKUDH IRB 2016-12-005)。人类牙髓组织从内部获得牙齿的一部分,碎成小片段,和酶消化3毫克/毫升胶原酶I型(微孔)和4毫克/毫升dispase(σ)37°C 1 h。细胞悬液中孵化αmem (HyClone)含20%胎牛血清(抗生素的边后卫,HyClone)和1% (Lonza) 37°C调湿大气中补充公司为5%₂。观察体外osteoinduction效率,每口井的40000个细胞培养有0.8克HA-TCP(0.5 - 1毫米,Q-Oss + OSSTEM植入)或DDM(0.5 - 1毫米,韩国牙银行、韩国)在一个挂插入细胞培养皿(SPL生命科学)。移植,1×10⁶细胞被resuspended在100年μL的凝血酶,40毫克HA-TCP或DDM的颗粒是补充道。然后,100年μL(纤维蛋白原(TISSEEL,巴克斯特AG)和混合添加了立即允许在室温下聚合。纤维蛋白hDPSCs块/ HA-TCP或DDM在文化孵化37°C调湿大气中补充公司为5%₂直到移植。

2.2。HA-TCP和DDM的表征

HA-TCP和DDM的晶体性质调查使用x射线衍射(XRD、UltimaIV Rigaku,东京,日本)测量。XRD激活在40 kV和40 mA铜K_α1辐射()。模式的XRD测定step-scan 0.02°,每分钟速度为3°2θ从20到80°。表面形态HA-TCP和DDM检查通过扫描电子显微镜(SEM、地产- 6510,JEOL有限公司东京,日本)。HA-TCP和DDM sputter-coated(溅射涂布机108汽车,Cressington,沃特福德,英国)与铂和切片厚度5 nm之前扫描电镜测量。DDM在SEM图像的孔隙大小是评估使用ImageJ软件(贝塞斯达国立卫生研究院,医学博士,美国)。

2.3。DDM提取和西方分析做准备

每个HA-TCP(0.7克)和DDM (0.7 g)颗粒被孵化αmem (HyClone)没有的边后卫在37°C 3天提取他们的组件。提取被集中。检测细胞因子和生长因子释放每一个无机颗粒,在提取分离蛋白sds - page,转移到PVDF膜和探测anti-collagen 1型抗体(圣克鲁斯生物技术)其次是孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体。蛋白信号被使用可视化ECL™试剂(通用电气医疗集团)。

2.4。生活/死细胞生存分析

细胞生存能力是决定使用calcein-AM染色解决方案(热科学)。的纤维蛋白块hDPSCs / HA-TCP和hDPSCs / DDM在文化媒体4天,孵化与PBS洗,孵化与4μM EthD-1和2μ在PBS M calcein-AM在黑暗中在室温下了45分钟。用共焦显微镜荧光信号检测(LSM700,卡尔蔡司)。

2.5。在免疫功能不全的裸鼠皮下植入纤维蛋白的结构异位矿化组织的形成

二十免疫功能不全的裸小鼠(女,4周大,东方生物、韩国)被用于这项研究。动物研究协议是机构批准的动物保健和使用委员会Dankook大学。两组实验被用于这项研究。每组有10的动物。组1与HA-TCP用于纤维蛋白凝胶颗粒有或没有hDPSCs。组2与DDM用于纤维蛋白凝胶颗粒有或没有hDPSCs。移植的小鼠的腹腔内注射麻醉的混合物tiletamine / zolazepam(30毫克/公斤,Zoletil 50®, Virbac)和甲苯噻嗪(10毫克/公斤,Rompun®,拜耳韩国有限公司)。两个皮下1厘米的切口是在侧面的口袋背中线的老鼠。准备与纤维蛋白凝胶颗粒有或没有hDPSCs被放置到每个口袋里。1周,8周后,动物被牺牲和植入物被进一步研究。

2.6。微型计算机断层扫描检查(ct机)

矿化和骨形成由ct机进行评估。微ct图像获得使用微ct扫描仪(Skyscan Skyscan - 1176)分辨率为15μm像素和一个0.5毫米的铝过滤器和一个旋转步骤0.4。获得三个读数为每个样本。骨体积确定使用CT分析程序(CT-An Skyscan)。3 d图像获得使用3维可视化程序。统计分析三个读数进行使用学生的t以及。统计学意义是考虑是小于0.05。数据表示为意味着误差代表平均数标准误差(SEM)。学生的t以及使用GraphPad棱镜6程序执行。

2.7。定量实时逆转录聚合酶链反应(存在)

hDPSCs和冰冻组织的总RNA提取利用Easy-spin™总RNA提取工具包(基因内区、韩国)和RNA容易迷你提取工具包(试剂盒)。总RNA的互补脱氧核糖核酸合成利用ReverTra Ace™qPCR RT工具包(Toyobo公司),和存在是由使用iTaq™普遍SYBR™绿色Supermix (Bio-Rad)系统。使用引物在表列出1。的循环参数qPCR随访;周期为30秒95°C, 95°C,周期为15秒和1分钟55°C - 64°C。在PCR,解离曲线构造在65°C到95°C。

GAPDH是作为内部控制规范化目标基因表达的变化。统计分析在三个读数进行使用学生的t以及和小于0.05被认为是具有统计学意义。数据表示为手段()和误差代表平均数标准误差(SEM)。学生的t以及使用GraphPad棱镜6程序执行。

2.8。组织学分析

8周后,获取样本背中线无胸腺的裸体小鼠固定在4%多聚甲醛(PFA)一夜之间。固定样本与PBS冲洗去除残余PFA和使用70%酒精脱水。然后,脱水样本脱钙使用除去石灰质solution-Lite (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)16小时和嵌入在石蜡。嵌入式样本横向切获得不同横断面图像。样本与厚度6μ徕卡m×切片机(RM2255, Bensheim,德国)。切片样本deparaffinized二甲苯,水化与一系列的分级乙醇,并与苏木精和伊红染色和高德的三色的染色。一个光学显微镜(CKX41,奥林巴斯,东京,日本)被用来获取的彩色图像样本确认新HA-TCP和DDM的沉积矿化。

2.9。免疫组织化学分析

分段随机选取样本(每组)和沉浸在二甲苯和之前的预处理过程的双重免疫荧光染色法成骨和dentinogenic标记与人类核抗原(海航集团)。样本孵化为1小时在室温下阻断缓冲区。阻塞后,样品被染了16小时了。主要人类特定的抗体;1:100稀释antibone唾液蛋白抗体(Abcam), 1: 200稀释的反人类的核抗原(Abcam)和antiosteocalcin抗体(Abcam), 1: 500稀释antiosteopontin抗体(Abcam), 1: 1000稀释antiosteonectin抗体(微孔),和1:100稀释antidentin sialophosphoprotein抗体(Abcam)。异硫氰酸荧光素共轭二次抗体(美国杰克逊免疫研究实验室,PA)和4′,6′-diamidino-2-phenylindole (DAPI,矢量实验室、伯林盖姆、钙、美国)被用来可视化主要抗体和核的信号,分别。样本测量用共焦显微镜(LSM700,卡尔蔡司,耶拿,德国)。

3所示。结果

3.1。表面分析HA-TCP和DDM支架

软化牙本质矩阵(DDM)在这项研究中的应用是一个同类的生物材料生产从人类牙质的研究。这是由磨、脱脂和脱钙作用(由韩国牙银行,首尔,韩国)。两个不同的标本被随机选择确定其孔隙大小和表面形态的扫描电镜分析。SEM分析结果如图所示1。HA-TCP衬底被观察羟磷灰石颗粒完全覆盖HA-TCP表面没有孔隙或超小型电子管(图结构1(一)上半部分),而DDM的表面涂抹一层搪瓷展出与连续均匀的微孔直径2.08±0.37μm(图1(一)较低的面板)。XRD分析显示几个HA-TCP的羟磷灰石(图产生的衍射峰1 (b)上面的图)。衍射峰2⊖= 25.8 (Ca), 31.9 (P), 37.2 (Ca), 45.5 (Ca)和47.7 (P)与期望的羟磷灰石光谱。一般来说,牙齿上的牙釉质层由纯羟基磷灰石复合。因为搪瓷没有完全从样例牙去矿化作用期间,羟磷灰石组件(如磷酸和钙在这项研究中使用的DDM探测到。DDM的峰值显示一个典型的XRD合成羟磷灰石的模式,类似于HA-TCP样本。XRD分析Ca和P的DDM透露许多山峰,DDM表面的釉质(图1 (b)较低的面板)。除了无机成分,象牙质包含有机生物分子。检测蛋白质成分材料,免疫印迹分析使用DDM和HA-TCP提取物。事实上,胶原蛋白1型中检测出DDM提取(图1 (c),通道4)。然而,他们不是HA-TCP提取(图中发现1 (c)车道3)。虽然很弱信号的这些蛋白质也发现在正常培养基含有10%的边后卫(图1 (c)道2),更高的DDM的胶原蛋白被释放。

3.2。体外Osteoinduction势HA-TCP hDPSCs DDM

确定osteoinduction HA-TCP或DDM的潜力,hDPSCs被培养在插入HA-TCP或DDM的800毫克。积极发展hDPSCs通常发现well-spreading和扁平形状(图2(一个)面板1)。细胞形态学改变了尖尖的,细长的表型,排列紧密,平行的支流文化(图10天后2(一个)面板4)。细胞培养与提取HA-TCP DDM的10天也显示类似的表型与融合性的文化条件下(图2(一个)板5和6)。的mRNA表达成骨的标记在这些细胞检查。表达水平的碱性磷酸酶(ALP)、骨sialophosphoprotein (BSP),骨桥蛋白(OPN),象牙质sialophosphoprotein (DSPP)和牙本质基质蛋白(DMP-1)显著增加细胞中培养10天后没有添加材料相比,那些积极增长细胞(图3天后文化2 (b)a e、酒吧1和2),表明hDPSCs可以分化为骨的/成自己长期的文化条件下。因为HA-TCP等合成材料没有osteoinduction潜力,骨的/ dentinogenic标记hDPSCs孵化HA-TCP没有多增加相比,那些在细胞培养(图10天2 (b)在a e、酒吧2和3)。HA-TCP不同,信使rna表达水平的成骨的标记,如高山、BSP、OPN在hDPSCs DDM提取分别为2.4,27.3,和1.6倍,分别比那些没有的DDM材料(图2 (b)、酒吧2和4 a - c)。关于成骨的标记,信使rna表达水平的两个牙原性的标记DMP-1和DSPP hDPSCs培养DDM高出2.0和1.9倍,分别比那些没有的DDM(图2 (b)、酒吧2和4 D和E)。这些结果表明,DDM的osteoinduction具有更好的潜力hDPSCs体外合成羟磷灰石材料如HA-TCP相比。

3.3。细胞的可行性hDPSCs培养与HA-TCP或DDM纤维蛋白凝胶块

移植,hDPSCs涨跌互现HA-TCP或DDM颗粒。保持细胞聚集在移植领域,促进细胞存活,需要封装细胞和生物材料在纤维蛋白凝胶颗粒。培养细胞在三维矩阵是组织工程的重要技术以及研究与生物材料在体外培养条件下细胞反应。hDPSCs封装了HA-TCP DDM-fibrin凝胶,类似大小的1厘米宽,0.4厘米高(数字3(一个),3 (b),3 (c)、上面板),所有样品都是在媒体文化孵化。细胞的可行性分析了hDPSCs生活和死亡化验后4天的文化。这些hDPSCs可行内纤维蛋白凝胶(数字3(一个),3 (b),3 (c))。不管是否HA-TCP DDM补充说,高表面观察细胞的异常(图3、中间板),在这些凝胶的内部构造(图3、较低的面板)。

3.4。异位成骨的效果与HA-TCP hDPSCs移植或DDM的皮下无胸腺的老鼠

确定的影响HA-TCP或DDM hDPSCs异位骨形成,细胞和材料封装在纤维蛋白块植入皮下注射到小鼠无胸腺的裸体。移植1周,8周后,样品植入背部分直接使用ct机进行了分析。在分析过程中麻醉下的老鼠。所有样本组HA-TCP hDPSC / HA-TCP DDM, hDPSC / DDM可以明显看到在背侧皮下注射区域。他们都保持最初的形状,和硬组织形成的矿化被检测到。微ct图像检索移植数据所示4(一)和4 (b)。骨形成的差异之间的1周和8周被评为矿物体积变化。在样品没有细胞,骨卷没有从1周增加到8周(图4 (c)、酒吧1和3)。hDPSCs封装时,骨头HA-TCP组和DDM的卷组增加高达1.24毫米³和2.91毫米³分别在8周相比1周(图4 (c)、酒吧2和4)。关于材料移植,基因表达BSP、OPN增强hDPSC / HA-TCP,移植的3.5和1.3倍,分别在移植相比hDPSC / DDM(图5、酒吧2 A和B)。相反,安大略省的表达式和OCN略增强hDPSCs / DDM移植,相比在hDPSC / HA-TCP移植(图5、酒吧2 C和D)。只有BSP表达水平明显增加HA-TCP移植(),但其他基因的表达HA-TCP和DDM之间没有明显不同。虽然比HA-TCP DDM osteoinduction潜力较高,osteoconduction HA-TCP能力也可以诱导体内移植后8周的实验。戈德纳的三色的染色结果显示几乎没有骨形成在植入HA-TCP或DDM hDPSCs 8周后小鼠的皮下移植。植入HA-TCP或DDM导致fibrous-like组织(数据的再生6(一)和6 (c))。然而,类骨质形成周围HA-TCP观察移植组与hDPSCs HA-TCP(图6 (b))。在新形成的骨(绿色指示矿化骨),骨细胞的腔隙形状观察组HA-TCP和DDM hDPSCs(数字6 (b)和6 (d))。异位骨形成进一步支持双immunofluorescent染色骨标记和人类核抗原(海航集团)作为标记的检测hDPSCs移植(图7)。大量的移植hDPSCs内壁表面上被发现的coencapsulated HA-TCP和DDM颗粒在矿化的网站。位于安大略省成骨的标记蛋白质OPN, OCN, BSP表示在重合区域内衬细胞(数字7(一),7 (b),7 (c),7 (d))。DSPP,有趣的是,象牙质标记之一,强烈中发现hDPSCs DDM的表面排列(图7 (e)比HA-TCP表面移植)。这些结果表明,HA-TCP和DDM hDPSCs移植体外诱导成骨分化潜能,增强组织异位骨形成。炎症并不是在任何组织切片观察植入网站。

4所示。讨论

一般来说,人类牙髓干细胞培养于牙髓组织提取智慧和乳牙。它们可以分化成各种血统类型如成牙质细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞(22,37- - - - - -43]。分析骨和牙发生hDPSCs,我们比较基于无机HA-TCP和人类DDM在体外和体内的条件下。主要的文化孤立hDPSCs执行可以使无机材料的生物相容性和用于体外研究。体内异位骨再生,无机材料和hDPSCs无胸腺的小鼠皮下移植。尽管描述osteoconductivity或osteoinductivity生物材料在组织工程领域仍然是一个挑战,论述DDM具有良好的有利于重建手术由于多个创伤和颅面畸形。也有利于肿瘤手术及牙周手术由于其论述属性。SEM分析在这项研究检查无机HA-TCP和DDM的表面特征。高度多孔表面的DDM由SEM分析显示,显示相似骨结构。morphometrically高多孔(孔隙大小:2.08±0.37μm) DDM也可能是有用的作为一个有前途的脚手架骨替换。此外,小型化毛孔预计能够有效地提供营养和氧气在体内(图1(一)较低的面板)。在分析矿物质通过XRD, HA-TCP和DDM含有大量的钙和磷酸盐(图1 (b))[44]。一般的想法,DDM组件不应含有矿物质,因为他们准备去矿化作用。然而,由于牙本质组织在本研究中用于制备DDM与搪瓷混合一定量,一部分钙和磷酸盐在DDM探测到即使去矿化作用[45]。成骨和dentinogenic标记的表达水平明显增加hDPSCs培养DDM的提取相比,那些在HA-TCP hDPSCs培养提取物,表明HA-TCP仅可能没有影响osteoinduction在体外细胞培养。DDM可以诱导成骨的dentinogenic分化由于其osoteoinduction属性(图2 (b))。hDPSCs移植和HA-TCP DDM表现出无与伦比的体内异位骨形成的功效。HA-TCP DDM在裸鼠移植后,两种生物材料未能显示明显的异位骨形成hDPSCs后8周。因为HA-TCP本身时间resorbability没有osteoinductivity [46),骨体积HA-TCP甚至与DDM相比略有下降。然而,矿物卷在移植HA-TCP / hDPSCs和DDM / hDPSCs分别增加了15.3%和28.7%,分别比无细胞的控制(数字4(一),4 (b),4 (c))。表达水平的成骨的标记如汽水和OCN移植的DDM / hDPSCs高于HA-TCP / hDPSCs(数据的移植5 (c)和5 (d))。相对地,表达水平在移植HA-TCP / hDPSCs早期成骨的标记是高于DDM / hDPSCs(数据的移植5(一个)和5 (b)),说明无机离子释放HA-TCP可能刺激边际成骨细胞的粘附和增殖由于osteoconduction能力(47,48]。事实上,更多的类骨质形成于移植HA-TCP / hDPSCs比DDM / hDPSCs基于组织学分析(图6 (b)),腔隙结构和不成熟骨形成在移植相似(数字6 (b)和6 (d))。最后,osteoconduction HA-TCP的潜力在体内移植的研究似乎DDM的那么好,也没有显著差异在钙沉积或骨之间的移植8周后两组。有趣的是,dentin-specific标记的表达水平DSPP高度检测DDM / hDPSCs移植,但不是在HA-TCP / hDPSCs移植(图7 (e)),这表明DDM可能有更好的效果比HA-TCP牙质再生。总之,与hDPSCs移植可以提高成骨的或/和dentinogenic生物材料的潜力。这项研究还显示,HA-TCP DDM可能也有类似的对异位骨形成的影响在体内动物模型中,尽管他们显示不同的效果在体外细胞分化。还需要更多的研究来确定hDPSC移植结合osteoconduction和osteoinduction材料,可用于牙本质再生。人类DDM的发展可能导致有效的干细胞治疗骨组织再生用最小的外科手术在临床试验中。此外,生物相容性和无机材料可能用于原位成骨分化和移植由当地交付hDPSCs不会造成不利影响。

5。结论

人牙髓干细胞已经知道能够通过骨的形成硬组织/牙质生成。在当前的研究中,HA-TCP和DDM用于牙质的再生或在组织工程骨。在这里,我们调查的影响骨的/ dentinogenic潜在的hDPSCs DDM相比HA-TCP体外和体内。Osteoinduction DDM的影响显然是观察体外,但成骨的潜力在这两种情况下在体内移植相类似。发现有趣的是,dentinogenic潜在高功效DDM / hDPSCs移植,这表明DDM可能是更有效的比HA-TCP牙质hDPSCs的再生。

的利益冲突

作者没有相关关系或财务参与任何组织或实体的经济利益或冲突与本文所讨论的主题或材料。

作者的贡献

Kyung-Jung康和最小Suk李的贡献同样这项工作。

确认

这项研究受到了NRF的生物与医学技术发展项目由韩国政府资助,MSIP (NRF - 2015 m3a9c6029130) (Young-Joo张成泽)和NRF的基础科学研究项目由韩国政府资助,教育部(2016 r1d1a1b03931163)(庆熙Seok杨)。