文摘
背景。钙调磷酸酶抑制剂(CNI)已大大改善了病人和移植肝的生存在小儿肝移植(pLT)。然而,CNI毒性导致重大的发病率。此外,公司不能预防长期的同种异体移植物损伤。间充质干细胞(MSC)(基质)细胞具有强大的免疫调节特性,这可能促进同种异体移植物宽容和改善高剂量毒性CNI。MYSTEP1试验旨在调查donor-derived msc在pLT的安全性和可行性。方法/设计。7到10个孩子接受活体供pLT将被包含在这个非盲、前瞻性试验试验。1×10的剂量6msc /公斤体重将在两个时间点:首先intraportal注入术和静脉输液在术后第二天2。此外,参与者将收到标准免疫抑制治疗。我们的主要目的是评估的安全intraportal pLT接受静脉注入MSC。我们的次要目标是评估疗效的MSC治疗以个人需要免疫抑制和biopsy-proven急性排斥反应的发生率。我们将执行详细的免疫监测调查免疫调节作用。讨论。我们的研究将提供信息donor-derived msc在小儿活体供肝移植的安全性及其对免疫调节的影响和移植物存活率。
1。背景
近几十年来,小儿肝移植已发展成为一个先进的程序改善预后和生活质量与晚期肝病儿童和青少年。免疫抑制药物治疗包括钙调磷酸酶抑制剂(cni)允许实体器官移植的移植与合理的患者和移植物存活率1- - - - - -3]。然而,长期连续暴露于免疫抑制药物,如参股,mTOR,类固醇,带有显著的临床副作用。这些包括肾功能障碍、动脉高血压,葡萄糖耐受不良,淋巴增殖性疾病,具有重要的意义和机会性感染4,5]。这些副作用肝移植术后(发病率占重要地位1,6,7]。孩子比成人更影响的慢性毒性免疫抑制药物,尤其是通过参股的毒性8]。此外,公司不能有效预防慢性新创肝炎在同种异体移植。这个长期移植物损伤与高风险发展进步的贪污纤维化10年后,和高达25%的患者需要再移植9]。最近,研究集中在免疫小儿肝移植后并发症,如体液移植排斥(10同种异体移植物衰竭)导致迟了。因此,我们需要新的immunomodulating方法限制免疫抑制治疗的风险,不断改善的结果,实现最佳的认知和身体发育,为liver-transplanted儿童和维护高质量的生活。
1.1。间充质干细胞
间充质干细胞,或者根据国际社会的细胞疗法的术语(ISCT),多能间充质基质细胞(11),是成人祖细胞起源于神经嵴和中胚层。骨髓msc可以隔绝和许多其他来源,包括脂肪组织和沃顿商学院的果冻。msc可以分化为间充质细胞成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞;此外,msc可能分化成细胞类型通常来源于外胚层和内胚层,如肝细胞(12]。根据ISCT标准,人类msc具有能力坚持塑料,其分化潜能,基质细胞标记物的存在,以及缺乏造血细胞标记(11]。msc可以使用文化后新鲜或冷冻保存后没有损失的表型或分化潜能13),支持简单的临床应用。
大量实验研究表明,msc在调制的免疫反应中发挥作用:在混合淋巴细胞培养,人类msc对t细胞增殖有显著的抑制效果通过信息交互和分泌的可溶性因子(14]。例如,介质由msc分泌包括galectin-1 [15];TGF -β1(转化生长因子);肝细胞生长因子(14];可溶性人类白细胞antigen-G5;TNF-stimulated基因6蛋白(16];和前列腺素E2。酶indoleamine-2, 3-dioxygenase (IDO)是另一个重要因素的免疫调控msc (17]。在一起,这些因素能够调节免疫激活的t细胞(18- - - - - -20.),b细胞(21),和巨噬细胞22),反过来,采用监管表型。此外,msc影响分化、成熟和功能的树突细胞(23]。
临床前模型证实这些有益的免疫调节效应的msc (18,24,25]。第一临床应用治疗紧密相联的,抗类固醇移植物抗宿主病(反应和自身免疫性疾病如26和克罗恩氏病27]。这些应用程序已被证明是安全的和非常有前途的临床疗效。
1.2。msc及实体器官移植
间充质干细胞(msc)(基质)细胞可能代表一个有吸引力的治疗选择在实体器官移植,因为他们调节免疫反应,促进再生(28]。系统应用程序显示病人非常良好的耐受性。临床研究关注于使用自体(29日- - - - - -31日)和同种异体msc (32,33在肾移植已经完成,展示安全性和可行性。这些研究显示低的急性排斥反应发生率、改善肾功能移植一年后,说明msc的免疫抑制特性。在成人肝移植,第一临床I / II期研究目前正在使用msc (NCT01841632 NCT01429038, NCT01844063)。初步报告显示,系统性和intraportal注入同种异体msc已故和活体供肝移植后被移植受者(安全和耐受性良好34,35]。没有一个先前的研究使用类似的细胞注入剂量MSC证明任何重大的副作用。
由于上述毒性CNI和肝移植术后长期不足的结果结果,孩子可能会受益于替代方法,免疫调节,将延长移植物存活,同时减少CNI毒性、提高生活质量和促进长期的同种异体移植物耐受。然而,在小儿活体供肝移植的上下文中,intraportal和静脉应用程序的安全性和可行性的msc仍有待证明。
2。方法和设计
2.1。目标和端点
这飞行员试验的主要目的是评估儿童donor-derived MSC输液的安全接受肝移植的。安全将由以下:(1)急性并发症的发生率、定时和严重程度与MSC输液,使用特定的毒性评分系统(MYSTEP得分,图1)(2)严重不良事件的发生率(节约)及其与临床实验的治疗(3)肝移植后移植物的完整性和功能,以转氨酶和伽马谷酰基转移酶活动,胆红素、白蛋白和印度卢比。
此外,本研究旨在评估如下:(1)功效(一)的可行性和安全性逐渐减少免疫抑制药物根据标准指南(36),根据步进式圆锥形协议,开始6个月后pLT(图2)(b)时间第一biopsy-proven急性排斥反应(BPAR)。(2)血液和免疫功能,以描述和量化单核细胞的数量,检测供体特异性抗体(DSA)和肝脏自身抗体,和分析协议的移植手术活检。(3)在病人和移植肝的生存posttransplantation 1和2年。
2.2。研究设计
MYSTEP1(小儿肝移植间充质干细胞)试验是24个月,非随机、非盲、前瞻性、单中心试验试验。总的来说,至少7新创肝脏受者,0 17岁,将招募图宾根大学医院。我们将招收他们在研究他们的法定代理人的同意和满足合格标准。研究小组可能会扩大到多达10个病人咨询后数据安全监测委员会(DSMB),将监测研究进展。董事会由儿科医生、移植外科医生,biometrician不参与审判。我们已获得监管批准德国图宾根大学的伦理委员会和德国联邦疫苗和共同参与研究所(Paul-Ehrlich-Institut;EudraCT号2014-003561-15)。这个试验是在Clinicaltrials.gov注册NCT02957552。
2.3。入选标准
病人符合纳入本研究必须满足以下所有条件:(1)耐心和父母或法定监护人必须给予书面知情同意。(2)患者将接受活体供肝移植肝衰竭慢性终端。(3)年龄≥8周和≤18年。(4)体重> 5公斤。
2.4。排除标准
病人满足下列标准不符合本研究:(1)活体供根据供体和受体标准不适合(2)怀孕或哺乳(3)不足够的避孕(如果合适的话)(4)急性肝衰竭或高度紧急的移植(5)接受任何形式的实体器官移植方面的(6)Multi-organ-transplantation(7)活跃的自身免疫性疾病(8)既存的肾功能衰竭与表皮生长因子受体< 50毫升/分钟/ 1.73米2或者需要血液透析(9)降低肺功能(肺功能测试在6岁以上儿童:FEV1和FVC < 70%的适龄标准)或肺病的临床怀疑影响病人的物理性能,需要侵入性或无创机械通气(10)肺栓塞的历史(11)肺动脉高压和右心室负荷超声心动图(12)减少心脏功能:左心室缩短分数< 25%(13)临床上重要的系统性感染(14)接受重症监护治疗像机械通风,透析,或血管加压的代理(15)血清阳性艾滋病毒,病毒有关,或肝炎B / C(16)肝胆的任何肝外恶性肿瘤的恶性肿瘤或历史(17)血栓形成倾向(18)Budd-Chiari综合症(19)既存的门静脉血栓形成(20)Doppler-sonographic证据相关门体静脉的分流术,例如,持续的静脉导管(21)冷缺血时间> 90分钟(22)滥用毒品或酒精(23)已知的过敏DMSO溶液。
2.5。MSC文化
Donor-derived间充质干细胞将前4周计划获得通过的骨髓穿刺活体供肝移植的。所有捐助者将进行常规检查和筛查包括广泛的传染病检查,根据我们的移植中心的捐赠者筛查协议(37,38]。捐助者还必须获得捐赠生活委员会的批准。骨髓MSC的准备,大约20毫升的将取自髂嵴下局部麻醉。处理和扩张的细胞将在良好生产规范(GMP)大学儿童医院的设备图。msc在细胞培养瓶使用动物任意细胞培养介质。MSC文化,我们使用白蛋白、血浆和血小板,获得健康献血者根据德国法律输血。通常,培养大约需要20天,需要2 - 3段。与我们的文化方法,我们获得约50×106骨髓细胞20毫升。只有在极少数情况下,需要更多的骨髓MSC治疗小儿接受者。
细胞产品只能被释放,如果以下条件满足:常规表面标记表达式(CD105 + CD73 + CD90 + CD45-HLA-DR-cells > 90%;CD3 +、CD19 +和CD14 +细胞< 0.5%);纺锤状形态;一种无色细胞悬液;生存能力的细胞> 80%;无微生物污染使用文化、支原体PCR和内毒素检测;和无细胞聚集。MSC产品低温贮藏有10% DMSO,直到指定的应用程序(存储在<−150°C的气态液态氮)。细胞输血,当天分配的剂量的间充质干细胞将解冻GMP干细胞实验室洗,悬浮在一个适当的等渗盐水的体积为0.5%白蛋白在细胞浓度介于1和1.5×106细胞/毫升。
2.6。研究治疗
试验性治疗将包括两个输血donor-derived间充质干细胞,每个剂量~ 1×106MSC /公斤体重,与第一注入术(0)和第二次术后输液,活体供肝移植后1 - 3天(图2)。进一步,研究参与者最初将继续标准basiliximab组成的免疫抑制方案,糖皮质激素,和他克莫司(他克莫司槽水平6个月后5 - 10 ng / ml),按照我们中心的儿科LT协议。如果协议肝活检6个月后LT是不起眼的,没有拒绝的历史,根据逐步逐渐减少免疫抑制药物治疗可以减少协议的目标他克莫司槽水平的2 - 4 ng / ml(图2)。在与负责监管机构密切合作,我们计划一个交错的方法:前三个病人将接受研究治疗一次,30天的安全间隔。咨询DSMB之前我们需要恢复病人招聘。
术后静脉血栓形成预防使用低剂量肝素是强制性的。大约10天后,应该转向预防阿司匹林和维持3个月后的高。预防细菌、真菌和病毒感染将坚持我们中心的pLT协议。
2.7。数据收集
孩子参加本研究将进行一个标准的移植前检查,包括基线临床数据(人口、病史、当前药物,体格检查,实验室检查,血栓形成倾向筛选试验,验尿,心电图,腹部超声、和胸透)。使用测试怀孕测试将被执行βhcg血清中所有女性参与者有生育潜力(9岁或以上)在筛选访问。
2.8。MSC输液
1×10的首届政府6细胞/公斤体重将处理通过门户网站进行输液后完成肝移植再灌注(第0天)。MSC悬架将通过一个小静脉导管管理进入门静脉20分钟,轻轻挥舞着注射器来保持细胞悬浮。除了使用多普勒超声,我们将测量流量测量门户由交通流时间(Medistim®)细胞输注(39,40]。细胞输注应停止如果门户流量显著降低(低于20毫升/分钟/ 100 g肝脏重量)。第二个MSC管理、计量1×106细胞/公斤体重,将通过系统进行静脉注射途径在术后第二天(时间窗口±1天)。MSC悬架将通过一个中央静脉导管或输血外周静脉导管在无菌条件下20分钟。细胞注入期间,我们将持续监测病人的脉搏、血压、血氧饱和度、呼吸频率和体温。
2.9。后续访问
我们将看到病人频繁后续访问在第一次移植后28天。研究将包括访问常规临床检查,多普勒超声,血液测试旨在治疗诱发事件的早期检测。我们将评估病人的MYSTEP毒性分数天0,2、4、7、10和28日之后的高。额外的研究访问将720天后进行肝移植评估同种异体移植物生存,拒绝,发病率(机会)感染的发生,肾功能,和个人需要免疫抑制药物(表1)。如果病人是一个不起眼的临床过程和正常协议肝脏活组织检查,免疫抑制药物将在六个月后逐渐降低(图2),针对他克莫司槽4 ng / ml的水平或低于后12个月。终止后的研究中,参与者将随后在我们另一个五年的门诊。我们将监控病人长期同种异体移植物功能,肝外器官功能,和长期并发症,尤其是恶性肿瘤的发生。
2.9.1。MYSTEP得分
为了评估和quantifiy MSC输液治疗诱发的不良事件,我们定义了一个儿科infusional毒性评分,采用MiSOT-I得分为成人(41]。分数集中在三个独立的形式反映损伤肺和肝脏移植,例如,通过thrombembolism,和系统反应,如过敏性反应(图1)。对于这三个模式,程度的0(无治疗诱发的不良事件)和3之间(治疗诱发的严重不良事件)被定义。临床数据、血气分析、胸部x光片,多普勒超声(表将在指定的研究获得访问1)。连续两个三年级事件的发生将报告严重不良事件。MYSTEP分数回顾性验证通过分析我们的群小儿肝移植受者没有临床实验的治疗(42]。
2.9.2。协议肝脏活组织检查
在这项研究中,我们将执行协议注入肝活检肝后6个月和MSC。经皮肝活检将超声控制analgosedation,根据建议的ESPGHAN肝脏病学委员会(43)和地方标准。此外,我们将执行协议肝活检通常每5年之后中尉肝组织免疫组织化学处理(苏木精和伊红染色;染色的CD3、CD4和CD20)。活检将得分根据班夫标准及异体肝纤维化评分系统(44]。此外,反和促炎细胞因子的表达来衡量实时rt - pcr在肝脏组织。
2.9.3。免疫监视
额外的血液样本将收集的调查参与者代理标记的免疫反应(表状态1)。此免疫监视将包括淋巴细胞增殖试验来评估antidonor反应活性,流式细胞术来描述收件人的白细胞表型和供体白细胞的存在(HLA嵌合)和血清分析为DSA屏幕,liver-directed自身抗体,和炎性细胞因子。进一步,我们将屏幕的血清学标记铁止血,也就是说,铁蛋白和hepcidin大概在运营发展中发挥作用宽容肝移植术后(45]。
2.10。风险-效益评估
msc可能支持诱导同种异体移植物宽容和帮助实现长期容忍25]。免疫抑制药物的患者可能需要少量与毒性的风险相关联,在很多情况下是不能防止同种异体移植物的长期损害。此外,msc移植器官的潜在促进再生,例如,在缺血再灌注损伤(46,47]。MSC治疗小儿肝移植受者的相关风险是未知的。实体器官移植以外的迹象,系统性msc在儿童中的应用已被证明是安全的,并且没有治疗诱发不良事件报告(26,48]。然而,潜在风险包括传染病的传播,血栓栓塞,门静脉血栓形成,过敏反应和致癌49]。这些风险需要预防措施和持续的监控。在我们自己的经验,超过100儿童应用msc治疗移植物抗宿主病和克罗恩病的设置显示msc的耐受性良好,没有发生严重的不良事件。此外,注入donor-derived msc贝尔理论被供体抗原致敏的风险,这可能导致新创地区体育会和拒绝的形成。然而,临床研究使用donor-derived msc在肾移植后(32,33)减少排斥反应和更好的同种异体移植物功能移植后一年。当前经验的基础上,我们认为潜在的有利影响肝移植术后MSC行政和有限的潜在风险的副作用证明参与这项研究。
3所示。讨论
介绍当前的标准免疫抑制疗法包括参股有重大影响减少小儿肝移植后的急性死亡率(2,50]。然而,终身暴露于慢性药物免疫抑制剂损害生活质量和减少长期生存。儿童尤其受到慢性药物毒性和长期的同种异体移植物衰竭(5]。这些限制激励我们寻找替代细胞治疗策略实现小儿肝移植后同种异体移植物耐受。间充质干细胞的免疫调节特性,测试了在体外和体内模型和早期临床试验中,可能使他们在pLT适用于改进的免疫调节。骨髓间充质当前免疫抑制的策略可以帮助减少有毒参股和限制缺血/再灌注损伤(47同时提高移植物的生存。临床数据表明,msc可能导致长期的同种异体移植物耐受诱导的耐受性调控t细胞(18- - - - - -20.和巨噬细胞22]。的第一个临床研究肾移植了MSC输液的安全并表示MSC在降低同种异体移植物排斥反应的疗效和间质纤维化30.,31日]。此外,疗效的临床研究同种异体肝移植msc是悬而未决。初步结果突显出有益的安全性在临床应用的细胞类型(34,35]。
据我们所知,这是第一个临床试验immunomodulating治疗小儿实体器官移植间充质干细胞。在本试验研究中,我们的目的主要是为了确定intraportal和静脉输液的安全性和可行性donor-derived MSC在儿童接受肝移植的。我们将评估安全基础上急性输注相关并发症的发生率以MYSTEP分数来衡量,对严重不良事件的发生率和pLT后同种异体移植物功能。我们设计我们的研究协议优化预防不良事件并识别任何出现的早期。例如,使用“交错的方法”病人招聘和保证术中贪污灌注的定量监测交通流量测量将有助于确保一个非常高水平的安全的孩子参与。在成人中,没有观察到毒性在静脉和intraportal注入到目前为止(51]。
以前的研究显示肾移植msc的相互矛盾的数据overimmunosuppression的风险,这可能导致机会性感染(30.,31日]。这个安全问题儿童肝脏受者可能发挥重要作用,因为它们更频繁地天真EBV或感染血巨细胞病毒相比,成人肝移植受者。因此,作为后续pLT和MSC输液后的一部分,必须频繁地和准确地监测感染性并发症和TAC槽水平。
很多细节msc在移植受者的免疫调节机制仍然未知。然而,很明显,Foxp3积极的调控t细胞的比例的增加是一个重要的MSC移植患者的行动方式(28,29日,35,52]。其他细胞类型应该调节树突细胞免疫调节和再生效果,单核细胞、巨噬细胞22],MDSCs [20.]。在MYSTEP1研究中,免疫监控将专注于白细胞亚种群的定量分析使用验证协议(35,53]。我们还将分析在肝组织,RNA的表达支持和抗炎细胞因子介导免疫调节作用。此外,最终体液alloreactive响应将被监控检测HLA和肝脏特异性抗体。
msc的最佳供体来源尚不清楚。在这个实验中,我们将使用骨骨髓来源从实体器官捐赠者获得msc。Donor-derived msc可能导致Donor-derived同种异体移植物耐受(54]。儿童活体供肝移植是一个标准的程序和提供的机会获得msc和移植组织捐赠一个完全相同的生活,经常一个家长。然而,敏感的接收者和新创的形成地区体育会可能构成同种异体msc的不利影响。肾移植的动物模型研究报告增加同种异体移植物排斥和增加地区体育会当donor-derived msc移植管理4天前55]。这支持的假设注入时机和初始伴随免疫抑制治疗是至关重要的(56]。在这方面,之前的临床研究管理同种异体,donor-derived msc在肾移植(32,33]显示减少排斥反应和更好的同种异体移植物功能移植后一年。在MYSTEP1试验,我们将定期筛查新创DSA的发生。
除了msc的来源,手机应用程序的时间和路线可能会影响msc的有效性。直接注入的细胞的移植可以利用msc治疗缺血再灌注损伤组织修复能力。此外,临床前模型表明,除了系统性影响,当地负责msc移植耐受的机制(19]。一个重要机制是衰减allostimulatory树突状细胞(23]。静脉应用程序后,最大的msc分数集中在肺(57)和淋巴结,没有达到肝脏。不过,大多数研究在实体器官移植应用静脉注入MSC。观察到的免疫调节效应可能被其他宿主细胞介导的长期58]。基于这些考虑,在MYSTEP1试验,我们将管理的第一剂量msc intraportally结束时肝移植过程和管理第二剂量静脉注射在术后第二天49]。
符合我们的关注安全性和可行性,所有参与者将结合中心的标准免疫抑制机制,由basiliximab,他克莫司和类固醇。临床前研究表明,参股和糖皮质激素可能影响MSC形态、迁移、和免疫调节的行为,可能会影响细胞疗法的成功(59,60]。然而,当前研究的成人肾移植受者,应用msc结合类固醇和有限公司(29日- - - - - -33)展示了潜在的有效性尽管伴随参股和类固醇的使用。解决问题协同或反抗免疫抑制药物对MSC的影响函数,计划第二阶段临床研究将集中在免疫抑制治疗方案的优化结合MSC注入。
总之,msc有潜力成为一系列的新治疗方案的一部分小儿肝移植受者旨在促进同种异体移植物耐受同种异体移植物长期生存和改善,同时减少慢性毒性是治疗。积极MYSTEP1审判结果的安全性和同种异体移植物生存将构成一个重大的进步小儿实体器官移植。随后,我们打算进行第二,大型多中心试验研究MSC治疗方案的免疫调节功效提高小儿肝移植受者的长期同种异体移植物耐受。
缩写
| 阿德: | 腺病毒 |
| 安娜: | 抗核抗体 |
| BPAR: | Biopsy-proven急性排斥反应 |
| DSA: | 供体特异性HLA-antibody |
| :血巨细胞病毒 | 人类巨细胞病毒 |
| DMSO溶液: | 二甲亚砜 |
| DSMB: | 数据安全监测委员会 |
| EBV: | 巴尔病毒 |
| 印度卢比: | 国际标准化比值 |
| 是: | 免疫抑制 |
| 加护病房: | 重症监护室 |
| ISCT: | 国际社会的细胞疗法 |
| 肝: | 活体供肝移植 |
| LKMA: | Anti-liver-kidney微粒体抗体 |
| LT: | 肝移植 |
| MDSC: | Myeloid-derived免疫抑制细胞 |
| 硕士: | 间充质干细胞细胞(基质) |
| pLT: | 小儿肝移植 |
| 国际扶轮: | 阻力指数 |
| rt - pcr: | 逆转录聚合酶链反应 |
| 助教Vmax: | 时间上最大速度 |
| SAE: | 严重不良事件 |
| SMA: | Anti-smooth肌肉抗体。 |
伦理批准
MYSTEP1研究是医学伦理委员会批准图宾根大学的(Ref 003/2016AMG1)。
信息披露
资金的身体也没有影响研究设计和收集、分析和解释数据。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
史蒂芬Hartleif埃克哈德•Sturm设计和研究,并将进行研究的主要研究人员。麦克拉多尔,阿尔弗雷德Konigsrainer西尔维奥Nadalin,马克·h·Dahlke和默多克Handgretinger导致的理念和设计研究。彼得朗,鲁珀特•迈克尔•Schumm Handgretinger建立和协调GMP的MSC文化和质量控制设备。麦克拉多尔,马库斯Mezger Steffen Hartleif导致免疫监控的设计与实现。阅读和批准所有的作者都最后的手稿。
确认
作者感谢凯西Shufro文本编辑。本研究支持的罕见疾病中心图宾根;图宾根大学的;欧洲基金会和阿斯特拉。