胰岛素样生长因子结合Protein-6改变骨骼肌人类间充质干细胞的分化

文摘

胰岛素样生长因子结合protein-6 (IGFBP-6)、胰岛素样生长因子2的主要监管机构(IGF-2),是一个组件的发展中肌肉细胞的干细胞利基。然而,它的作用在肌肉发育还没有明确定义。在这项研究中,我们调查的角色IGFBP-6肌肉承诺和分化的人类间充质干细胞来源于胎盘。我们表明,胎盘间充质干细胞(PMSCs)有能力分化成肌细胞暴露在一个特定的培养基表示肌肉标记Pax3/7 MyoD, myogenin, stage-dependent方式和肌凝蛋白重链的最终形成多核纤维和失去pluripotency-associated标记,OCT4 SOX2。添加IGFBP-6显著增加pluripotency-associated标记以及肌肉分化标记在更早的时间点,但后者随时间减少。另一方面,沉默IGFBP-6减少多能和分化标记在早期的时间点。这些标记物的水平增加IGFBP-6水平恢复。这些发现表明IGFBP-6影响MSC多能性和肌原性的分化,更加突出的影响在分化过程的开始观察肌肉的承诺。

1。介绍

与胚胎干细胞是来源于胚胎早期,胎盘间充质干细胞(PMSCs)是源自人类胎盘通常被丢弃后交付,因此一个现成的和不具争议性的成体干细胞来源可能使用在组织再生疗法在人类患者(1- - - - - -3]。胎盘间充质干细胞可在大量和有能力区分成三个生殖细胞层根据细分因素的类型和浓度的细胞接触在体外。通路激活这些细胞在分化成特定类型的中胚层细胞说明这些细胞分化的机制在体外和在活的有机体内并可能提供重要的信息组织和器官在胚胎的发育过程和成人。

骨骼肌是一个高度协调的逐步发展过程利用一系列的转录因子,和结构和酶蛋白表达骨骼肌发育的不同阶段。在肌细胞生成,承诺祖细胞分化成肌肉血统移植肌原性的监管因素(mrf)以及肌肉承诺转录因子(Pax3和Pax7),其次是早期肌细胞标记物的表达(MyoD和myogenin) (4]。承诺后,细胞开始融合在一起,形成多核纤维和蛋白质表达阳性,如肌球蛋白重链(MHC) (4]。相信在恢复和再生在成人肌肉拉伤后,这个过程又一次重复。

间充质干细胞与骨髓有能力分化成细胞(5,6]。然而,这些细胞是有限的可用性和没有能力形成熔融骨骼肌在体外(7,8]。脂肪干细胞的另一个来源的干细胞可以分化成骨骼肌(9]。虽然这些细胞是现成的,他们有有限的肌肉恢复(10]。因此,需要找到一个干细胞群,消除其他干细胞相关的问题是我们的首要任务。

胰岛素样生长因子(IGF)家族的肽调节细胞生长,分化,维持细胞生存通过一些信号转导途径(11]。这个家庭包括两个IGF肽,IGF - 1和IGF-2,三个细胞表面受体,1型和2型IGF受体,胰岛素和混合受体,和六个IGF结合蛋白(IGFBPs) [4]。igf - 1和IGF-2循环和细胞间肽作为强有力的有丝分裂原对许多不同的细胞类型,由绑定IGF-1R,膜受体酪氨酸激酶(12]。IGFBPs运营商为igf的循环和细胞外液舱(13从退化,保护它们12,14),交付给特定的组织,以及调制igf的生物学行为。IGFBP-6 30 kDa分泌蛋白,与其他IGFBPs不同,有一个更高的亲和力(~ 70 - 100折)IGF-2比igf - 1 (15,16]。IGFBP-6已被证实能调节通过抑制IGF-2 IGF-2活动绑定IGF-2 IGF-1R或直接独立的绑定受体(17,18]。IGF结合蛋白,包括IGFBP-6,分泌到细胞外的环境中,他们与IGF交互。他们也本地化细胞表明IGFBPs可能的生物学行为独立igf (19]。

IGF家族之前的研究已经证实,在肌肉发展发挥重要作用。IGF-1R基因敲除小鼠出生后不久即死亡由于呼吸困难由于缺乏功能呼吸肌肉(20.,21]。IGF-2表达丰富发展中骨骼肌肌肉生长的主要因素,分化和再生22]。当IGF-2撞倒,肌细胞生成不发生(22]。在开发期间,IGFBP-6表达在发展肌肉细胞和肌细胞生成(也需要22]。先前的研究在我们的实验室已经描述了IGF-independent IGFBP-6的功能与骨蛋白质相互作用在调节细胞命运在骨骼肌细胞线(23]。另外,另一项研究表明,IGFBP-6抑制血管生成但IGF-independent地促进迁移(17]。

据我们所知,IGFBP-6生物作用的干细胞分化成肌肉血统没有被报道。在这项研究中,我们确定如果PMSCs能分化成骨骼肌当暴露于肌肉分化促进条件然后IGFBP-6的影响特征的分化PMSCs骨骼肌。

2。材料和方法

2.1。隔离PMSCs

PMSC隔离和实验按照批准的西方大学的健康科学研究伦理委员会。知情同意是获得健康女性接受治疗终止怀孕,和本研究中使用的PMSCs隔绝15周早产胎盘组织。手术后,绒膜绒毛被割开,洗净,剁碎并与手术剪刀和镊子,然后用胶原酶进行酶消化四世(369 IU /毫克)、透明质酸酶(999 IU / mg) (Sigma-Aldrich,奥克维尔),我DNase (2000 IU / mg) (Hoffmann-LaRoche,米西索加)在室温下10分钟,其次是0.05%胰蛋白酶(Gibco /表达载体,米西索加)在室温下5分钟。样本然后洗10分钟以10%的边后卫在DMEM / F12培养基,以及由此产生的单个细胞悬液是由密度离心分离在Percoll (Sigma-Aldrich,奥克维尔)不连续梯度使用修改后的协议由Worton et al。24]。

2.2。细胞培养

细胞Percoll梯度分数3号和4号镀T75烧瓶血压得到较好的控制,培养,和维护使用血清DMEM / F12媒体补充15%的边后卫(Gibco /表达载体,米西索加)和FGF-2 (50 ng / mL) (Sigma-Aldrich,奥克维尔)含100 U / mL青霉素,100μ0.25 g / mL链霉素,μ克/毫升两性霉素b。不依从细胞被丢弃在媒体的变化,这是执行每72小时。贴壁细胞培养,直到他们达到90%融合。细胞通道1:2大约每周用0.05%胰蛋白酶10分钟37°C 3通道。第四段细胞被储存在−在媒体1毫升的冻结80°C(30%的边后卫和10% DMSO在DMEM / F12媒体)。在需要的时候,瓶被解冻和细胞resuspended在正常培养基(25 ng / mL的边后卫在DMEM / F12 FGF-2和15%)。只有PMSCs通道3或4被用于实验。

2.3。流式细胞术分析

使用胰蛋白酶重组细胞使胰蛋白酶化10分钟(TrypLE表达,Gibco /表达载体,米西索加)稀释1:1在PBS, 37°C。瓶的细胞分离后,胰蛋白酶中和10%的边后卫DMEMF / 12中,细胞被洗和孵化一小时fluorochrome-labeled主要抗体MSC标记。CD73(550256号)(BD Pharmingen,圣何塞,CA), PE-conjugated CD105 (12-1057-73) (eBioscience,圣地亚哥,CA)和cd - 117 / c - kit (sc - 13508)(圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX)(补充图使用1)。

2.4。肌肉分化

细胞被镀在肌肉增长的媒体(胎牛血清0.05毫升/ mL,胎球蛋白50μg / mL,表皮生长因子10 ng / mL,碱性纤维母细胞生长因子1 ng / mL,胰岛素10μ0.4 g / mL,地塞米松μg / mL) 48小时之前改变骨骼肌分化媒体,这是无血清培养基含有10μg / mL胰岛素(PromoCell,海德堡,德国)。细胞生长在six-well板在标准组织培养孵化器有限公司37°C的5%₂。

2.5。IGFBP-6

重组人类IGFBP-6 (ProSpec,东不伦瑞克,新泽西州)在无菌MilliQ-H resuspended₂O和添加到媒体集中375 ng / mL。IGFBP-6每3天添加媒体改变的时候。IGFBP-6浓度是由一个剂量反应实验中使用PMSCs肌肉分化媒体(补充图2每3天)。IGFBP-6添加媒体改变的时候因为这是时间IGFBP-6分泌水平低于控制(补充图2B)。

2.6。由核Downregulation IGFBP-6表达

沉默内生IGFBP-6表达式,IGFBP6核(h)池的3有针对性19-25 nt siRNAs使用(圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX)。8μL (Lipofectamine(表达载体,米西索加)8μL炒或IGFBP-6 siRNA添加到100μL DMEM / F12媒体(表达载体,米西索加)在室温下40分钟;核的浓度是80海里。核解决方案添加到60%汇合的细胞,然后孵化5小时37°C。肌肉的生长媒体(1.5毫升)添加到细胞48小时,然后取而代之的是2毫升的肌肉分化的媒体。增加了新的核每3天在媒体的变化,和实验进行了7天。

2.7。免疫细胞化学

PMSCs生长和分化在玻璃罩滑落,沾主要抗体,一夜之间在4°C的环境。主要的抗体洗使用0.1% Tween-20 PBS(3 * 5分钟),然后细胞孵化与二级抗体在黑暗中。二次抗体被PBS Tween-20 0.1%,核染色是7分钟,然后冲洗。封面都安装了2小时,使用蔡司共焦显微镜和图像拍摄。每个抗体进行了一式三份。

2.8。免疫印迹

实验完成后,每个细胞溶解产物含有20μg蛋白的添加到6 x SDS凝胶加载缓冲区(1%β巯基乙醇,1% SDS, 30%甘油、0.0012%溴酚蓝,Tris-HCl 0.28 M, pH值6.8)。样本煮5分钟在95°C,然后放在冰3分钟,在3000 rpm离心机在装货前20秒。样本解决分子量使用10% SDS聚丙烯酰胺凝胶,然后转移到polyvinyldenefluoride (PVDF)膜(Bio-Rad,赫拉克勒斯,加利福尼亚州)使用Trans-Blot涡轮(Bio-Rad,赫拉克勒斯,加州)和一个优化协议根据蛋白质的大小。膜被封锁5%脱脂奶粉,轻轻动了一下1小时在室温下Tris-HCl缓冲盐水中pH值8.0与0.1% Tween-20 (TBS-T)。然后洗屁股和TBS-T (3 x 10分钟)其次是孵化一夜之间在4°C与特定的主要BSA抗体在5%或5%脱脂奶粉后TBS-T制造商的协议。然后膜清洗和孵化了1小时在室温下与相应的二次合抗体。解决蛋白质乐队用化学发光检测,图像被使用VersaDoc成像仪(Bio-Rad,赫拉克勒斯,加州)。西方的屁股进行了一式三份。

2.9。量化IGFBP-6和IGF-2分泌的酶联免疫吸附试验(ELISA)

人类IGFBP-6 (RayBiotech®,伯灵顿)和IGF-2 (ALPCO,萨勒姆,NH) ELISA包被用来测量IGFBP-6 IGF-2分泌到不同处理条件下的媒体。标准和样本加载到井和固定化抗体绑定IGFBP-6或IGF-2出现在示例。洗井,生物素化的反抗体了。洗后,HRP-conjugated链霉亲和素添加;然后三甲衬底的解决方案是用于开发一个蓝色的数量比例IGFBP-6或IGF-2绑定。停止解决方案改变颜色从蓝色到黄色,而颜色强度为450 nm使用Multiskan提升分析软件。

2.10。乙醛脱氢酶(ALDH)活动

流式细胞术PMSC ALDH活动评估。一个Aldefluor™工具(干细胞技术、温哥华BC)按照制造商的使用协议。5μL的激活Aldefluor试剂/毫升补充道,和细胞培养45分钟。细胞离心5分钟,500年resuspendedμL的冰冷的Aldefluor分析缓冲区。ALDH活动用流式细胞仪测量。样本一式三份。

2.11。抗体

多能性标记,我们使用OCT4抗体(N-19: sc - 8628)(圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX)和SOX2 (2683 - 1) (Epitomics,伯灵顿,可以)。对肌肉分化标记,Pax3/7(平台以及:sc365613) MyoD (m - 318: sc - 760), myogenin (F5D: sc - 12732)和肌凝蛋白重链(h - 300: sc - 20641)(圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX)。加载控制,pan-actin Ab-5(热费希尔科学,Fremont, CA)使用。IGFBP-6,抗体(h - 70: sc - 13094)(圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX)使用。二次抗体用于免疫印迹是山羊anti-rabbit(170 - 6515)或anti-mouse (170 - 6516) HRP-conjugated抗体(Bio-Rad大力神,CA),或驴抗体抗体(圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX)。二次抗体用于免疫细胞化学green-Alexa 488或568 red-Alexa(表达载体,米西索加)。

2.12。统计分析

所有的实验都是运行在一式三份,特定的蛋白质水平量化和归一化加载每个车道的pan-actin水平。GraphPad Prism 5.0软件被用来生成所有图表和分析。双向方差分析后跟Bonferroni的多重比较检验或单向方差分析学生紧随其后t以及使用,显著差异被认为是当 。图形表示值提出了均值±SEM(显示为方差酒吧)。

3所示。结果

3.1。PMSCs可以分化成骨骼肌

确定如果PMSCs能分化成骨骼肌,PMSCs肌肉分化条件下种植长达14天。相比PMSCs生长在nondifferentiating条件的边后卫(10%),分化PMSCs显示肌肉形态早在第一天postdifferentiation(压实和细长的外形)(数据1(一)和1 (b)),细胞继续分化形成多核纤维在第14天(数字1 (c)和1 (d)和补充图3A和B)。与这些形态变化有关,pluripotency-associated标记(OCT4)免疫反应性出现低(数字1 (e)和1 (f)),和肌肉分化标记(MHC)免疫反应性高(数字1 (g)和1 (h))相比,控制细胞的边后卫(10%)。此外,PMSCs肌肉分化条件下表现出较低的细胞计数每领域相比,未分化的控制(补充图3C)。

在肌肉分化条件下,PMSCs OCT4和SOX2 pluripotency-associated蛋白质含量下降。OCT4水平相对较低,第一天相比,控制进一步减少14天postdifferentiation(图2(一个))。此外,SOX2水平降低,白天几乎减少14相比,细胞肌肉分化条件下控制(图2 (b))。肌肉承诺标志Pax3/7增加在第七天,其次是减少在第14天PMSCs肌肉分化条件下相比,控制(图2 (c)),这表明PMSCs肌肉分化条件下致力于肌肉血统并且正在肌肉分化。这证实了肌肉标记的蛋白质含量(MyoD MyoG, MHC)肌肉分化条件下随时间显著增加(数据2 (d),2 (e),2 (f))。总的来说,这些发现表明PMSCs骨骼肌分化成适当的培养条件下,和这个细胞分化模型可以用于研究肌肉发展在体外。

我们使用了Aldefluor试验来确定原始的祖细胞的频率高ALDH的活动。在这种背景下,高ALDH活动是守恒的特性多血统的增生性祖细胞(25,26]。当分化发生向更成熟的细胞表型,ALDH活动减少。相比PMSCs nondifferentiation条件下生长,减少细胞的频率高(ALDH ALDH活动⁺肌肉分化条件下细胞)在天1 - 14(图3和补充图4)。此外,ALDH活动也减少了随着时间的推移,当控制培养条件(10%的边后卫(图)3)。这些发现表明PMSCs组成的异构人口缓慢分化在标准培养条件和维护PMSCs刺激分化成骨骼肌立即减少ALDH活动在更早的时间点。

3.2。PMSCs表达IGFBP-6在肌原性的分化

PMSCs骨骼肌分化条件下研究了如果他们IGFBP-6表示。使用免疫细胞化学,PMSCs培养分化条件下显示细胞内高IGFBP-6 PMSCs相比,免疫反应性(数字控制培养条件4(一)和4 (b))。用免疫印迹在多个时间点,第二天2的区别,IGFBP-6水平逐渐减少PMSCs分化条件下培养,但仍高于time-matched控制(图4 (c))。用ELISA检测PMSC-conditioned媒体,有增加的水平IGFBP-6分泌到媒体,确认发展肌肉细胞表达IGFBP-6主动分泌到细胞外空间(图4 (d))。因此,合成IGFBP-6增加细胞变得更加分化向肌肉血统。

3.3。IGFBP-6 Multipotency发展中影响肌肉细胞从PMSCs肌肉之前的承诺

测试的影响细胞外IGFBP-6发展肌肉细胞、重组人类IGFBP-6添加到肌肉分化的媒体。细胞外IGFBP-6加到培养基检测细胞内IGFBP-6增加了西方的屁股,这表明重组人类IGFBP-6诱导的正反馈效应或被分化细胞(图5(一个))。此外,刺激IGFBP-6 OCT4和SOX2水平增加伴随IGFBP-6水平增加(数据5 (b)和5 (c))。有趣的是,IGFBP-6补充也增加了Pax3/7水平建议增强PMSC承诺向骨骼肌血统(图5 (d))。这两个事件同时发生的事实表明,IGFBP-6可能有这些影响在不同的细胞在文化。

最后,IGFBP-6治疗阳性标记的水平增加,MyoD, MyoG, MHC,在更早的时间点随时间下降的长期存在的增加细胞外IGFBP-6相比unsupplemented肌肉分化条件(数据5 (e),5 (f),5 (g))。总的来说,这些数据表明IGFBP-6提升PMSC承诺肌肉血统作为直接影响但保持pluripotency-associated标记和延迟在之后的时间点肌肉分化,如肌肉分化标记的蛋白质含量下降。

由于pluripotency-associated和分化标记增加IGFBP-6治疗时间的方式,我们测试了ALDH的细胞活动的频率来确定PMSCs保持高ALDH祖表现型。PMSCs下肌肉分化的IGFBP-6 ALDH活动增加而PMSCs下肌肉分化独自住在天1 - 14(图6和补充图5),这表明IGFBP-6除了长期原始祖表型PMSCs肌肉分化条件下培养。在第14天进一步免疫细胞化学分析显示unsupplemented条件相比,PMSCs IGFBP-6显示更多的肌肉压实处理(数据7(一),7 (b),7 (c),7 (d))。而且,MHC免疫反应性等价的有或没有出现IGFBP-6补充(数字7 (e)和7 (f)(图)用更少数量的细胞7 (g))。这些发现表明,pluripotency-associated和分化标记的增加导致改变培养条件的影响(细胞环境)的异构人口未分化和分化细胞。

3.4。内生的分化需要IGFBP-6 PMSCs骨骼肌

评估的影响IGFBP-6沉默在PMSCs pluripotency-associated和肌肉分化标记,IGFBP-6击倒了siRNA肌肉分化期间使用了7天。正如预测的那样,PMSC表达IGFBP-6降低1 - 2天后IGFBP-6击倒而炒核控制。然而,IGFBP-6水平相当于爬控制白天3。Readministration IGFBP-6 siRNA的第三天延长IGFBP-6减少,但IGFBP-6回到控制水平白天6(图8(一个))。这些发现表明,区分PMSCs高表达IGFBP-6和能力克服siRNA击倒在3天内文化。除了IGFBP-6击倒,我们观察到为OCT4 pluripotency-associated标记(图的减少8 (b))和SOX2(图8 (c))伴随IGFBP-6水平降低,这表明IGFBP-6可能是重要的维持能力需要进一步调查。与此同时,增加肌肉的承诺标志Pax3/7减少第三天(图8 (d))。同样,水平的肌肉谱系分化标记MyoD, MyoG, MHC都降低了早期IGFBP-6击倒后时间点(数据8 (e),8 (f),8 (g))。蛋白质含量的增加肌肉承诺标记和减少肌肉分化标记表明内生IGFBP-6击倒发起PMSCs承诺肌肉血统,但因肌肉分化。

与IGFBP-6 pluripotency-associated和分化标记都减少了沉默,ALDH活动确定。沉默的内生IGFBP-6 PMSCs表达,减少ALDH活动相比,控制时间的方式(炒siRNA)(图9和补充图6)。然而,并没有改变在细胞形态与IGFBP-6沉默(图10 ())相比,控制(图10 (b)在第七天postdifferentiation。另一方面,IGFBP-6击倒IGFBP-6降低生产和分泌IGFBP-6水平减少PMSC-conditioned媒体在所有时间点以ELISA(图10 (c))。

4所示。讨论

近年来干细胞的研究进展,并使用干细胞的承诺在组织再生和细胞疗法在诊所(接近成为现实27,28]。然而,之前他们可以使用安全可靠,在再生医学,有必要了解干细胞微环境中的因素影响家族承诺和分化干细胞命运改变的文化条件在体外(29日]。此外,目前大多数细胞疗法有望利用多能或多功能干细胞已经准备生成所需的血统的承诺祖细胞,培养他们在特定的文化条件下前治疗。先天性肌营养不良是一个潜在的遗传疾病,可能适合细胞疗法由于可访问性和可能的新功能移植后骨骼肌细胞到病变组织(30.,31日]。本研究的结果是第一个提供有关如何使用IGFBP-6调节肌肉从现成的PMSCs血统的承诺和分化体外。

能够使用干细胞治疗杜氏肌萎缩症和被批准用于临床试验,细胞需要从一个现成的资源,维护肌肉分化状态,避免宿主的免疫排斥反应,避免肿瘤发生,可以很容易地注入。人类胎盘间充质干细胞达到这些标准。

人类出生后胎盘通常是废弃的组织和代表一个成人的丰富来源间充质干细胞的发展组织再生疗法(2,3,32]。PMSCs有更大的细胞扩张和通道数量在体外比从骨髓间充质干细胞分离1]。他们还证明低致瘤性(33)和更高的免疫耐受能力减少引发免疫反应的可能性(34]。因此,胎盘干细胞可以提供一个道德和现成的干细胞来源为未来的实验和临床应用。

IGF家族中起着重要的作用肌肉发展,分化,增长,再生(20.- - - - - -22,35,36]。在杜氏肌萎缩症,igf - 1激活肌肉增长和肥大和似乎改善肌肉的损失37]。IGFBPs igf的航空公司是在循环7从退化,保护它们12,38),然后将它们传送给特定组织,从而调节igf的生物学行为。IGFBPs也提高IGF的半衰期肽的循环,控制访问IGF-1R,因此IGF-regulated细胞代谢中起着重要的作用,发展和增长。近年来,它已成为明显的IGFBPs可以表达和维护细胞内环境和功能独立的igf (14]。几个IGF结合蛋白已被证明是重要的肌细胞生成和发展中肌肉细胞的表达。任等人报道,在C2C12成肌细胞细胞主要在骨骼肌细胞,IGFBP-5徒IGF-dependent地促进肌细胞生成绑定IGF-2和促进其与IGF-1R交互(39]。击倒IGFBP-5受损肌原性的分化减少myogenin,肌凝蛋白重链,IGF-2表达式(39]。在L6E9骨骼成肌细胞,IGFBP-4和IGFBP-6积累在肌细胞生成,IGFBP-4,而不是IGFBP6,抑制igf - 1诱导肌肉分化(40]。这些发现暗示的重要作用IGFBPs肌肉分化的主要和骨骼肌血统的细胞系。我们的研究首次证明IGFBP-6的角色,这是一种特别的胚胎IGF,使用PMSCs IGF-2,肌肉发展。

本研究的目的是描述的影响IGFBP-6 PMSCs提交之前的早期分化阶段肌肉血统。如图所示,PMSCs肌肉differentiation-specific条件下培养时,他们表现出的能力分化成多核的肌肉纤维和肌肉血统。IGFBP-6的生物效应这分化的过程,由pluripotency-associated标记(OCT4和SOX2),肌肉的承诺(Pax3/7)和分化(MyoD MyoG, MHC),明显改变了之前的时间点。因此,IGFBP-6诱导肌肉分化和可能用于指导使用干细胞治疗骨骼肌再生。

IGFBP-6是发展肌肉细胞中高度表达41,42];然而,它的作用在肌肉发育尚不清楚。先前的研究使用人类胎儿组织从我们实验室已经证明IGFBP-6 mRNA表达在骨骼肌,心脏、皮肤和流行地区的活跃细胞分裂和分化,表明蛋白质合成在这些组织和发展中细胞自分泌/旁分泌的行为(43]。从我们的实验室在另一项研究中,我们报道了IGFBP-6 mRNA表达在低丰度胎盘绒毛膜绒毛的第二个和第三个三学期制(44),这表明这个IGFBP-6表达在特定的细胞组织(例如,间充质干细胞)和/或表达增加只有当PMSCs诱导分化成特定的谱系,如骨骼肌。

用PMSCs在当前研究结果表明干细胞发展中肌刀或msc发达肌肉组织表达IGFBP-6在分化显著水平,表明IGFBP-6作为整合蛋白在肌肉发展。事实上,肌肉分化的进展在体外,细胞内IGFBP-6逐渐减少由于增加分泌能力IGFBP-6培养基,指示IGFBP-6多个角色,细胞内和细胞外的肌肉发展。因此,IGFBP-6活动可能从细胞内IGF-independent行动更多的旁分泌IGF-dependent或IGF-independent动作肌肉发生分化。有趣的是,增加细胞外IGFBP-6通过向培养基添加IGFBP-6显著增加细胞IGFBP-6(相关的细胞内或细胞)并发增加pluripotency-associated标记OCT4 SOX2。增加细胞内IGFBP-6表明IGFBP-6可能内化或与细胞表面。从我们实验室以前的报告展示了细胞内的行为IGFBP-6细胞质和细胞核的骨骼肌细胞细胞系RD IGFBP-6(这可能是一个IGF-independent行动19]。

当细胞外IGFBP-6被补充进PMSC培养肌肉分化的条件下,肌肉承诺标志Pax3/7增加学习的时间点,而其他肌肉分化标记增加只有在更早的时间点。随着分化的进展,IGFBP-6治疗抑制完成肌原性的分化,减少肌肉分化标记MyoD, MyoG, MHC。这些发现与OCT4和SOX2水平越高表明IGFBP-6促进PMSCs的承诺向肌肉血统,而长期存在延迟分化过程。此外,增加了IGFBP-6 MSC微环境预计将减少的生物利用度IGF-2肽由于其高亲和力,证实了IGF-2 ELISA(补充图7A)。因此,很可能增加IGF-2区分肌肉细胞分泌的有生物的影响肌肉发展将进一步调查。

击倒IGFBP-6使用核细胞和分泌IGFBP-6下降。这knockdown-mediated OCT4下降和SOX2支持证据表明IGFBP-6提高PMSCs的多能性。相比之下,显著增加早期Pax3/7 IGFBP-6沉默支持早先承诺向肌原性的血统。Pax3/7的增加可能是由于的存在更大的可用性细胞外IGF-2(补充图7B),目前正在招募过程或承诺,可能是由于行动IGFBP-6独立的。相比之下,肌肉分化标记(MyoD MyoG, MHC)都减少IGFBP-6击倒后,表明IGFBP-6需要肌肉分化的过程。因此,IGFBP-6支持PMSC multipotency及其损失导致早期承诺向肌原性的血统,但推迟了分化。

各种细胞系的研究显示大部分IGFBP-6的抑制作用主要是通过IGF-2-dependent行动。在L6A1成肌细胞,IGFBP-6抑制肌肉分化诱导IGF-2但不是igf - 1 (45]。之前的报告igf对肌肉分化的影响使用鼠标细胞系(46- - - - - -49];因此,我们的研究是第一个显示IGFBP-6对人类间充质干细胞分化的影响骨骼肌在体外。

总的来说,我们已经在这项研究证实了IGFBP-6内生和外生的行动可以促进或抑制PMSC multipotency或分化。外生IGFBP-6暴露促进肌肉血统的承诺而长期暴露可以抑制晚期分化。因此,内生IGFBP-6需要维护multipotency推迟承诺和提高晚期分化。

总之,PMSCs能够分化成骨骼肌细胞在适当的环境或利基市场条件下,这一过程由增加细胞外IGFBP-6增强和延迟通过抑制内源性表达明显改变多能和肌肉分化标记(图11)。之间的平衡内生和外生IGFBP-6需要完整的肌肉分化的过程,由于IGFBP-6细胞内和细胞外的影响,反应是否发生相关或无关的igf(特别是IGF-2)将进一步划定。

信息披露

本文提出了一些数据作为海报内分泌学会第96届会议和博览会。提交数据也作为博士论文的一部分,(50]。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是111024年由CIHR格兰特。

补充材料

补充图1:PMSC隔绝15周早产胎盘。(一)解剖绒毛组织消化的酶学和细胞分离使用不连续Percoll梯度。5细胞分数通常是获得对应于五个不同的密度和细胞被隔绝层3、4、5所示。(B)相衬的孤立PMSCs从所有三层,4周后生长在文化。(C) PMSCs通道4的三层都是阳性CD73和CD105(> 98%),并为阴性CD117(< 1%)(通过流式细胞仪测定)。流式细胞术直方图代表所有3层从胎盘组织显示相同的结果。补充图2:IGFBP-6水平以应对IGFBP-6 PMSCs骨骼肌分化条件下的补充。(A) PMSCs培养肌肉分化条件下显示IGFBP-6蛋白质含量增加,使用西方的屁股,以应对不同剂量重组人类IGFBP-6补充蛋白质和375 ng / mL 450 ng / mL带强度最高。(B) IGFBP-6分泌到媒体增加人类IGFBP-6重组蛋白质的补充(375 ng / mL)相比,减少了时间和低控制在3天。数据表示为均值±SEM 3个独立的实验。 Two-way ANOVA with Bonferroni’s multiple comparison test was performed to determine 。补充图3:PMSCs培养肌肉分化条件下显示的形成multi-nucleated相比,低纤维和细胞计数控制。(A)在14天post-differentiation, PMSCs对MHC(568年Red-Alexa免疫反应性的λ-568海里)与细胞排列和multi-nucleated纤维形成(5倍)。核,与赫斯特染色染料(蓝色, )。(B) PMSCs生长在肌肉分化媒体显示multi-nucleated骨骼肌纤维的形成(40 x)。黑色箭头表示multi-nucleated肌肉。(C) PMSCs肌肉分化条件下表现出较低的细胞计数/现场与控制。数据提出了均值±SEM 15个不同领域的三个独立的实验。单向方差分析学生的紧随其后以及, 。补充图4:PMSCs培养的骨骼肌分化条件下显示细胞ALDH-activity高的频率下降。代表流式细胞术点块显示的频率高ALDH-activity PMSC Aldefluor和ALDH的抑制剂(DEAB)或ALDH单独培养时控制的边后卫(10%)或肌肉分化条件(一)第一天,(B)第三天,(C) 7天,(D)和14天。补充图5:IGFBP-6治疗PMSCs ALDH-activity高的频率增加。代表流式细胞术点阴谋Aldefluor和抑制剂(DEAB)单独或与ALDH PMSCs肌肉分化条件下培养有或没有IGFBP-6除了在一天(一)1、(B)第三天,(C) 7天,(D)和14天。补充图6:IGFBP-6 siRNA PMSCs肌肉分化条件下培养细胞ALDH-activity高的频率下降。代表流式细胞术点阴谋Aldefluor和ALDH的抑制剂(DEAB)单独或与ALDH PMSCs IGFBP-6 siRNA治疗(一)第一天,第三天(B)和(C)肌肉分化条件下7天。补充图7:IGF-2分泌PMSCs IGFBP-6对待或IGFBP-6肌肉分化条件下核。(A) IGF-2水平分泌到媒体显著减少在每个时间点后IGFBP-6之外而控制。(B)治疗后用siRNA IGFBP-6控制(炒siRNA)相比,IGF-2水平增加小干扰rna治疗应用在48小时内每3天。 Data is presented as the mean ± SEM of 3 independent experiments. Two-way ANOVA with Bonferroni’s multiple comparison test was performed to determine , 。(补充材料)

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