同种异体脐Cord-Derived间充质干细胞作为软骨和骨再生的潜在来源:一个在体外研究

文摘

脐带(UC)可能代表一个有吸引力的同种异体细胞来源间充质干细胞(MSC)治疗。的目的在体外研究探讨chondrogenic UC-MSCs发展到立体的支架和成骨的潜力,识别可能的临床意义的同种异体软骨和骨重建手术中使用。Chondrogenic分化支架被确认在4周sox-9和II型胶原蛋白的表达;低氧张力提高这些chondrogenic标记的表达。类似的趋势是观察到颗粒文化矩阵(蛋白聚糖)的生产。成骨分化bone-graft-substitute也确认后30天文化骨钙素的表达和RunX-2。细胞生长在肥厚性介质显示在5周红色染料染色的好心人和增加CbFa1表达,证实这些细胞接受肥大的能力。这些结果表明,UC-MSCs隔绝切碎的脐带可能代表有价值的同种异体细胞群,这可能有一个潜在等骨科组织工程细胞按需交付使用chondrogenic成骨和软骨内支架。这项研究可能有临床意义作为一个未来的假设选择同种异体单级软骨修复和骨再生。

1。介绍

软骨和骨骼病变代表骨科实践的一个常见问题,并组织工程不断提出创新的方法来改善他们的修复。目前的治疗软骨缺损骨髓刺激(裂隙)、自体骨软骨移植,自体软骨细胞移植。然而,这些选项有特定的限制和缺点:修复组织的质量差,施主能级发病率和有限的可用性的组织(1]。骨修复,骨替代品可用非细胞,不拥有任何成骨的潜力,代表简单的“填空式脚手架”被居民密集的细胞。

为了克服这些问题,使用自体间充质干细胞(msc)已经得到普及,因为这些细胞分化的能力向chondrogenic或成骨的途径。一般来说,msc来源于骨髓的愿望或从lipoaspirates,含有一个未分化的前兆,CD34⁺和CD34⁻随着大量血液单核细胞:这些细胞集中目前用于单程治疗软骨或骨缺损2- - - - - -7]。这种方法的主要缺点是有限数量的msc在最终产品8]。因此,使用选择和precultured msc正在调查中9]。在这个角度看,同种异体细胞消除收获过程和成本的发病率与这些程序。事实上,一个细胞工厂可能举办大量的从不同的捐赠者选择同种异体干细胞系,随时可供临床使用。

除了众所周知的骨髓和脂肪来源,新的同种异体细胞来源正在崛起,如脐带基质(加州大学)8,10- - - - - -12]。来自加州大学的应用细胞结构有一些不可忽视的优势相比其他来源;这些细胞确实是孤立的从以前丢弃的材料有一个虚拟无限的可用性(12]。此外,加州大学包含两个脐动脉和脐静脉和粘液proteoglycan-rich结缔组织,沃顿商学院的果冻、羊膜上皮所覆盖:干细胞可能是孤立的从这些结构与一个有前途的效率10,13]。这些细胞具有独特的属性相比其他干细胞类型隔胚胎干细胞(ESCs)和成人间充质干细胞(msc)发展地图,他们分享具备干细胞标记的ESCs msc,他们不诱导肿瘤发生,hypoimmunogenic [14]。当综上所述,不同UC-MSC亚型构成异构MSC人口“混合”,就是能向成骨分化,脂肪形成的,或者chondrogenic血统(15]。

因此,UC-MSCs可能代表一个吸引人的细胞来源与一个潜在的临床同种异体用于治疗关节软骨、骨软骨病变,和骨缺陷,作为一个可能的候选人的“普遍现成的”领域的干细胞产品骨科组织工程(13]。

的目标在体外研究旨在评估同种异体UC-MSCs区分的能力向chondrogenic或成骨的路径在一个立体的环境和测试可能解决这些细胞对肥厚性阶段,首先概括了软骨内成骨。

2。材料和方法

伦理委员会的批准了两个MBC(分子生物技术中心),都灵大学从Mauriziano医院伦理委员会,都灵(意大利);2016年1月11日,协议号码是CS792批准。

2.1。加州大学收集和处理

获得患者的知情同意后,15个新鲜UC样本检索在剖腹产Mauriziano医院的妇产科学系(意大利都灵)。加州大学样本收集在一个磷酸盐(PBS)转移中含有200毫克/ 100毫升环丙沙星500 IU肝素,他们立即处理。后将样品转移细胞培养无菌层流罩下,线的长度和重量估计和PBS的加州大学被移除污染物红细胞的痕迹。加州大学第一次被切成3厘米长的段,随后将纵向裂开,露出内表面。

加州大学段然后手工剁碎成小立方形的片段(4 - 7毫米长度)。60厘米的碎片被播种²培养皿的扩张中,他们被剁碎。这种扩张间充质干细胞中包含杜尔贝科的修改鹰中/ F-12 (DMEM)富含5%人类血小板溶解产物获得健康的捐赠者,10%胎牛血清的边后卫,1 x青霉素和链霉素,1 x丙酮酸钠,1 x不必要的氨基酸,500 IU肝素(Pharmatex)。小UC片段被分成6 - 7不同的60厘米²培养皿(约40 -片段/培养皿)和孵化在MSC扩张中37°C在湿润的气氛中公司为5%₂(天0)。加州大学剩下的碎片安静的在文化和监控2周允许识别MSC的菜肴。细胞隔离成功11样品15。

2.2。UC-MSC文化

2周(14天)后,加州大学的碎片被移除和贴壁细胞扩大额外2周;细胞扩张达到11样品15。百分之四十的媒介是改变每3 - 4天。2周后,贴壁细胞(P0)使胰蛋白酶化,在1200转离心10分钟,resuspended MSC的扩张中,和山肩一个连续扩张一步密度100 - 200细胞/厘米²,直到完全融合了(P1)。细胞融合在P1达成后约14天(42天)。P1段的末尾(42天),活细胞被台盼蓝染料排斥数。

2.3。端粒长度分析

端粒长度从4 UCs,评估在UC-MSCs P1和结果比较端粒长度相同的细胞系在连续的段落从P2到P5,之前报道的方法(后15]。

2.4。UC-MSC Immunophenotypic表征

Immunophenotyping UC-MSCs扩张是通过流式细胞术分析P1。1,5×10⁶UC-MSCs用于流式细胞术。以下使用抗体:CD90-peridinin叶绿素蛋白质——(PerCP)花青染料Cy5.5 (Biolegend,圣地亚哥,CA), CD105-fluorescein异硫氰酸酯(FITC) (Biolegend,圣地亚哥,CA), CD73-allophycocyanin (APC) (BD生物科学,圣何塞,CA) CD34-phycoerythrin (PE) (BD生物科学,圣何塞,CA) HLA-DR-FITC (BD生物科学,圣何塞,CA) HLA-PerCP (BD生物科学,圣何塞,CA) HLA-ABC-PE, CD29-APC (BD生物科学,圣何塞,CA) CD44-Alexa萤石(细胞信号技术,丹弗斯,MA), PE-conjugated antimouse免疫球蛋白G(免疫球蛋白)(生物技术协会南部,伯明翰,阿拉巴马州,美国),isotype-matched IgG-FITC (Biolegend,圣地亚哥,CA), IgG-PE (Biolegend,圣地亚哥,CA)和IgG-PE-Cy5 (Biolegend,圣地亚哥,CA)控制抗体。分析FACScan ((BD),正欲Buccinasco,意大利)至少10.000事件和使用CellQuest软件(BD、Buccinasco、意大利)。

2.5。第一节:UC-MSC分化Chondrogenic脚手架

在P1评估UC-MSCs chondrogenic分化在支架上。UC-MSCs被加载到两个不同的支架:Hyaff-11 (FIDIA先进的生物聚合物、意大利)或Chondro-gide (Geistlich生物材料、意大利开发)膜。Hyaff-11是非织造酯化HA导数膜。Chondro-gide是一个双层矩阵猪胶原蛋白I型和III型,与光滑紧凑和多孔、种子细胞。第一次通过细胞培养后,2×10⁶UC-MSCs resuspended 50μl chondrogenic分化培养基和播种到支架表面1厘米²(Hyaff-11或Chondro-gide)。支架是在37°C在湿润的气氛中有5%的公司₂3 - 4小时,允许UC-MSC粘附在支架上。然后,两滴商业纤维蛋白胶(Tissucol-Tisseel,巴克斯特)被添加作为一个表面密封,最后构造孵化在37°C,在湿润的气氛中1月的存在chondrogenic分化培养基(EUROMED chondrogenic分化装备,EuroClone,帕维亚,意大利)。文化既表现在常氧条件下(21%啊₂)或在低氧张力(8% O₂)。

1个月后,结构在福尔马林固定,石蜡中,分段。部分被苏木精和伊红染色,光学显微镜下检查。细胞计数,每构造三个不同区域在两个不同的部分在20 x放大光学显微镜下检查由两个独立的观察者。细胞数量为每个单独的区域被定义的算术平均细胞计数观察人士。意味着每个领域的迁移细胞的数量统计和画相比GraphPad棱镜®。番红精o染色也进行部分。

的软骨细胞标记物的表达,sox-9 (AB5535,默克密理博、米兰、意大利),和胶原蛋白II型(克隆6 b3, MAB8887,默克密理博,米兰,意大利)使用免疫荧光技术进行评估。主单克隆抗体在PBS-BSA1%稀释和孵化的部分在室温下2 h。二级染料光488抗体(美国马里兰州KPL,科克加德&佩里实验室),稀释1:100年,在室温下培养1 h。彩色部分是可视化Apotome荧光显微镜。我们收集的数字图像使用×20干镜头后0 - 5天内标签。

相同的文化条件用于UC-MSC颗粒文化。蛋白聚糖(PG): DNA比值计算的最佳逼近每细胞之前报道后ECM生产方法(16]。

2.6。第二节:UC-MSC分化成骨的脚手架

关于脚手架的成骨分化,我们使用了Orthoss®植骨(Geistlich生物材料、意大利开发),bovine-derived自然商业骨替代品。其无机骨基质有宏观和微孔结构类似于人类的松质骨。支架被切成方块的约1厘米³。数据集被涂以纤连蛋白通过浸泡在溶液中含有50毫克/毫升纤连蛋白4 h在室温下。数据集被风干一夜之间在无菌生物安全柜。的多维数据集被播种UC-MSCs resuspended纤维蛋白胶(6×10⁶细胞/支架)。然后通过加入成骨分化培养基(EUROMED成骨分化装备,EuroClone、帕维亚、意大利),和构造在37°C在湿润的气氛中孵化有限公司为5%₂10、20和30天。

的文化、结构最初脱钙,然后在福尔马林固定,石蜡中,分段。部分是苏木精和伊红染色茜素红和光学显微镜下检查。骨钙素的表达([Tyr28、Phe42, Phe46)骨质疏松蛋白质,凤凰制药公司,伯林盖姆,CA,美国)和亚基alpha - core-binding因素/ runt-related转录因子2 Cbfa1 / RunX-2 (Abcam Ab 114133年,剑桥,妈,美国)标记评估使用免疫荧光技术。彩色部分是可视化Apotome荧光显微镜。我们收集的数字图像使用×20干镜头后0 - 5天内标签。

2.7。第三节:UC-MSC肥厚性分化

验证UC-MSC潜力软骨内分化,细胞在P2被播种到Orthoss 3 g颗粒约4毫米³体积(浓度:25×10⁴细胞/粒)和孵化在37°C在湿润的气氛中有5%的公司₂在三种不同条件下:(我)肥厚性文化(3周+ 2周)(1)Chondrogenic介质(Chondrogenic分化工具包,EuroClone), 3周(2)肥厚性介质(DMEM 10毫米消息灵通的缓冲区,1毫米Na丙酮酸、青霉素、链霉素、1%谷氨酰胺,其1%,收于4.7点μg / ml亚油酸,1.25毫克/毫升人类血清白蛋白,抗坏血酸2-phosphate 0.1毫米,10⁻⁸M地塞米松,10毫米β甘油磷酸盐,0.05μM L-thyroxin)以下2周这种奇特的条件与其他两个培养条件:(2)成骨的文化(αMEM, 10%胎牛血清,抗坏血酸2-phosphate 0.1毫米,10⁻⁸M地塞米松,10毫米β甘油磷酸盐)3和5周(3)基底(控制)文化:胎牛血清的DMEM + 10%, 50 U /毫升青霉素和链霉素3和5周

文化的末尾(3和5周),他走时,红色染料进行染色,在制造商的协议(Bio-Optica米兰SpA、意大利米兰)。此外,完成了实时PCR分析来分析基因表达的主要chondrogenic和成骨的标记(sox-9 Cbfa1)。

2.7.1。rt - pcr分析

总RNA提取使用试剂盒从构造®(技术)和cDNA生成如前所述[17]。PCR的主人是基于混合AmpliTaq黄金DNA聚合酶(珀金埃尔默/应用生物系统公司)。TaqMan®基因表达或按需化验(技术)使用ABI 7900脂肪实时PCR系统(技术)40周期测量基因表达的sox-9 (Hs00165814_m1)和Cbfa1 (Hs00231692_m1)使用GAPDH (Hs99999905_m1)作为看家基因。

2.8。荧光强度的评估

荧光强度的差异之间的构造是评估使用ImageJ程序。该软件生成的数值对应的半定量的评估检查每个图像的平均荧光强度。十细胞领域迁移的软骨细胞的不同区域中随机选择每个幻灯片。简单地说,一个点工具支持位置的标记图像。与每个“点击”,马克的坐标(xx,yy)和亮度值(0 - 255)被记录在数据窗口。ImageJ亮度单位的规模,0 =纯黑色和255 =纯白色。每个图像的亮度值的算术平均计算所有值在各个领域的图像记录。对于每一个构造,意味着每一个标记的荧光强度计算和绘制图表。强度允许的不同评价指标的变化表达之间的不同的文化条件。

2.9。统计分析

提供所有数据以文本和数据的中位数。进行了统计分析与统计软件包GraphPad Prism 5.0。结果显示为框情节,横向线代表了中值,和盒子的宽度是由数据的最小和最大值。如果只有两个条件进行比较,我们使用Mann-Whitney测试,我们不认为高斯分布;如果两个条件比较多,我们用单向方差分析和Bonferroni调整。

3所示。结果

3.1。UC-MSC形态学和Immunophenotypic表征

在主文化,典型的纺锤状附着细胞观察从加州大学组织碎片和启动迁移集落形成播种后约14天。在14天postseeding移除UC碎片后,细胞大约10天增加60%融合(图1(一)),而大约在28天postseeding观察完全融合。UC-MSC克隆(定义为通过P0)因此收集28天postseeding和山肩进一步扩张(定义为通过P1)。观察融合在P1大约14天后的文化(42 postseeding天)。

在P1段在42天(融合),我们得到一个平均的23.05×10⁶1.48 (SD)细胞从每个脐带。从最初播种(0),我们获得的P1(42天)0.80×10⁶0.28 (SD)细胞/ g UC播种(加州大学的平均体重30.65克−平均长度40.9厘米)(补充图可以在网上https://doi.org/10.1155/2017/1732094)。加州大学细胞的表型被流式细胞术分析。收集的大部分加州大学细胞表现出积极的表达主要MSC标记CD73 CD90、和CD105, CD44和CD29。此外,他们染色为阴性的典型CD34造血标志(补充图)。的数据也证明了存在HLA-ABC蛋白质和HLA-DR的缺失。此外,我们想象一个显著的存在(40%)-双细胞HLA-ABC和HLA-DR蛋白质。

端粒长度分析进行UC-MSCs通道在不同文化(从P1到P5)没有任何明显的差别(图1 (b))。

3.2。第一节:Chondrogenic分化在脚手架

在chondrogenic分化到Chondro-gide Hyaff-11支架,细胞显示chondrogenic承诺在常氧条件和低氧张力,尽管UC-MSCs培养低氧张力显示更积极的红色染料染色,符合增加硫酸粘多糖(s-GAG)生产(图2(一个)C和D)。此外,组织学分析表明,msc移植在Hyaff-11支架的三维结构,而他们仍几乎完全在多孔表面Chondro-gide膜(图2(一个)A和B),可能由于不同的支架组成。无显著差异的每个字段之间观察到的细胞数量常氧文化和低氧张力条件每个特定支架(图2 (b))。

Chondro-gide支架,积极的疣状sox-9在场在常氧文化和在低氧张力条件(图3(一个)A和B)。在构造观察荧光强度明显高于培养艺术低氧张力(值< 0.05)(图3(一个)C)。胶原蛋白II型表达Chondro-gide支架出现在低氧张力和常氧条件下(图3 (b)A和B);然而,荧光强度没有明显不同(值= 0.6926)(图3 (b)C)。-控制补充图所示 。

在Hyaff-11支架,我们注意到一个类似的趋势:积极sox-9疣状是注意到在低氧张力和常氧细胞培养(图4(一)A和B)。荧光强度造成的差异具有统计学意义(值< 0.05)(图3(一个)C)。胶原蛋白II型表达Hyaff-11支架也显著大于低氧张力(值< 0.05)(图4 (b)C)。-控制补充图所示 。

类似的趋势在UC-MSC颗粒文化当暴露于低氧张力文化时期。我们观察到红色染料o染色(数据走强5(一个)和5 (b)比例(图)和PG / DNA5 (c))在颗粒文化发展在低氧张力相比暴露在常氧条件(值< 0.05)。

3.3。第二节:成骨分化骨替代品

支架显示相当大的增加多孔性结构在不同的时间点(10、20和30天)(图6(一))。茜素红染色显示钙沉积逐渐增加从10、20、30天(图6 (b))。骨钙素免疫染色(图的半定量的分析7(一)a - c)显示,骨钙素的表达强度明显提高20天至30天;其他时间点,有一个表达增加,虽然没有达到显著差异(图7(一)D;值< 0.05)。类似的结果RunX-2转录因子的表达,(图7 (b),两者是一个关键的转录因子与成骨细胞分化(图有关7 (b)D) (值< 0.05)。负控制补充图所示 。

3.4。第三节:软骨内骨替代颗粒的分化

在文化3周,观察软骨基质的沉积样品与chondrogenic诱导培养基培养,虽然没有任何证据表明在特定分化成骨分化培养基(图8(一个))。在5周的文化,我们观察到较强的红色染料o染色的样品培养chondrogenic肥厚性介质,以及骨基质的生产样品在成骨分化培养基培养(图8 (b))。

实时PCR分析显示轻微upregulation sox-9表达样本中培养3周的chondrogenic媒介。同时,成骨的标记Cfba-1是调节在样品培养chondrogenic和成骨的媒介。5周后文化、sox-9表达下调与样品培养chondrogenic肥厚性介质,而Cfba-1调节。成骨的介质诱导强烈Cfba-1 upregulation(图9)。

4所示。讨论

本研究的主要发现是,UC-MSCs收集在一个简单的和简单的过程从切碎的脐带碎片可能承诺向chondrogenic和成骨的血统,在支架培养,他们也可以解决向肥大在骨替代培养chondrogenic的存在和肥厚性chondrogenic媒介。因此,UC-MCs可能代表一个同种异体细胞群与一个有前途的值按需细胞交货单级软骨修复和骨再生。

如今,使用同种异体软骨细胞和骨修复的前沿是由于细胞的增加需要更好的特定组织修复。

事实上,简单的使用骨髓刺激技术,如微裂缝,已经显示出一定的局限性限制有关耐久性修复和较小质量的组织,比通过更复杂的整形技术自体软骨细胞移植(18- - - - - -20.]或scaffold-driven修复浓缩自体骨髓msc (21]。甚至骨替代品的使用显示较小的结果相比,技术结合骨替代和生物刺激自体骨髓msc或自体干细胞动员通过生长因子g - csf(粒细胞集落刺激因子)22,23]。然而,有几个缺点使用自体的细胞来源的发病主要是由于收获过程,细胞数量的个体差异,可用的有限数量的细胞由每个收获过程。此外,使用选定的前体细胞(即。,precultured autologous stem cells, chondrocytes) is necessarily associated with multiple procedures to obtain the primary autologous source, to culture the cells and to reimplant the cells at the lesion site. An ongoing solution proposed in literature is the “one-step procedures” in which autologous unselected sources of cells, as bone marrow concentrate [24),软骨碎片(1,25),或从lipoaspirates基质血管分数(5)添加病变部位(软骨或骨缺损)获得有趣的结果,即使在这些情况下,noncommitted细胞群是用来提高修复。

符合“一步程序,”进化的概念在细胞存储和细胞培养技术允许假设使用同种异体细胞作为软骨和骨修复的一个有吸引力的选择,由于更大的生物利用度比自体的同种异体来源。因此,同种异体干细胞疗法的概念成为一个持续的现实。事实上,在一些临床领域,如神经学、胃肠病学,或血液学,这些原则是用于实验研究治疗不同脑瘫等疾病(26),自身免疫性脑脊髓炎(27),肛周瘘管在克罗恩病(28),肝功能衰竭(29日),再生障碍性贫血(30.]。使用同种异体细胞的主要优势在整形外科是一个更大的“按需”的可用性细胞前体,没有收获的发病率,可能获得一个选定的细胞群,甚至可能使用细胞年轻捐助者在年长的接受者,病变进一步优化修复的质量。最近发现了一个最新的方面研究的临床应用Bonasia et al。1),同种异体少年软骨碎片被用来改善软骨修复兔模型的质量获得积极的结果。这个研究表明可能使用少年新鲜同种异体组织移植修复来源。这个概念肯定是一个选择骨头和软骨重建,但这意味着几个缺点促使生物利用度的具体组织和组织保存的成本,造成一些担忧这些原则的广泛应用。

另一个解决方案是使用同种异体候选人来自不同解剖网站骨髓和脂肪组织。在在活的有机体内研究de Windt et al。31日),软骨缺陷治疗结合同种异体和自体骨髓msc chondrons通过消化切碎的软骨碎片。这个阶段我研究的结果看起来很有希望,但在这种情况下,整个过程(即的长度。,obtaining autologous chondrons + combination of the 2 sources of repair + surgical implantation) may represent a drawback, if compared to more “straightforward” procedures in which a cellularized scaffold is directly implanted at the lesion site. In preclinical rabbit and minipig models, allogeneic bone marrow-derived MSC implantation has been proposed for the treatment of knee osteochondral defects with promising results [32,33]。骨再生已经获得康等的研究。34)加载同种异体骨髓msc在同种异体松质骨颗粒在一只兔子径向缺陷模型,质量的修复与自体BM-MSCs。在一些临床研究中,同种异体脂肪msc(对asc)也有所改善骨骼和软骨修复。在这项研究中由温家宝et al。35),对asc一直结合软化骨基质(DBM)已被应用于尺骨骨缺陷有可喜的成果的老鼠。对asc甚至同种异体关节内注射、导致了令人满意的结果,当结合透明质酸在临床前模型的狗关节病(36,37)、羊骨关节炎(38]。

脐cord-derived msc (UC-MSCs)可能代表一个新颖有趣的选择在这个领域(39]。脐带被认为是一个废弃的材料,它的使用意味着更少的道德和法律问题比其他胚胎结构(即。胚胎干细胞)。此外,它有一个几乎无限的可用性,“最近由Kalaszczynska和Ferdyn8]。此外,低成本和缺乏相关的发病率收集过程是一个“不可忽视”的优势相比其他常见同种异体细胞来源,如骨髓和脂肪组织。

在文学,UC-MSCs显示良好在体外潜在的,他们可以区分向chondrogenic和成骨的血统类似于骨髓msc (40,41]。的确,像骨髓,UC-MSCs反应低氧张力条件下(42)或脉冲电磁场(43)展示一种改进chondrogenic承诺。承诺multidifferentiation潜在的可能是由于原产地特有的网站导致“胚胎”功能比骨髓(14,44,45]。事实上,他们最近使用在活的有机体内所描述的Sadlik et al。46)涉及的干燥的关节镜治疗软骨病变UC-MSCs嵌入在一个猪I / II型胶原蛋白矩阵。Dilogo et al。47)也使用UC-MSCs批评-大小的骨缺损的治疗;然而,文献表明谨慎广泛临床应用之前,声称对更好的理解这些细胞的功能特征10]。然而,最近的证据增加了进一步承诺UC-MSCs领域的机会。在最近的研究中,Mennan et al。48)和Hendijani et al。49]证明了混合处理整个脐带获得的细胞群似乎有相同的分化潜能细胞来源于单一区域的线(沃顿商学院的果冻、动脉、静脉或绳衬)。这些发现可能表明有可能获得最佳的前体细胞没有任何担忧的分离特定的人口,简化任何理论使用的线作为未来假想的细胞来源广泛的临床应用。

符合这些观点,我们研究分析了在体外chondrogenic混合UC-MSC人口和成骨的承诺,用一个非常简单的和经济协议没有任何酶消化。没有执行细胞选择在MSC从绳基质中提取,但UC-MSCs的附着性能和简单的装腔作势的绳片段代表我们的细胞分离方法的基本步骤。这个选择符合上述证据在文献[48,49),它可以极大地简化了细胞收获而不降低效率的协议,最近的Yoon et al。50]。

人类血小板溶解产物获得健康的捐赠者和胎牛血清(的边后卫)是用于文化、描述在先前发表的论文(15),为了优化细胞的肉汤条件。对于人类的假设应用程序,可能出现的边后卫伦理问题[51]。因此,仅用人类血小板溶解产物的选择似乎是更可取的未来的人体试验。该方法的进一步研究可能比较疗效有或没有的边后卫,确保足够数量的细胞在两种情况下可以获得。

的确,我们的协议导致每克组织细胞的数量一致,因此暗示未来可能的大规模nonexpensive细胞存储用于临床,Kalaszczynska和Ferdyn设想在最近的一个评论(8]。

UC-MSCs获得与我们方法具备干细胞显示属性标记和端粒保护而言,后者表明维护细胞的生存能力,最近中文学(8]。此外,UC-MSCs显示低表达HLA-I和没有HLA-II的表达式,符合安全使用同种异体。这一概念是最近的一项研究证实了刘et al。44]的作者证明immunoprivileged状态UC-MSCs似乎在分化过程中保持甚至向一个特定的间充质(即。chondrogenic)血统。此外,这一发现“HLA-I HLA-II双重否定”的细胞亚群特殊immunoprivileged这些细胞的性质表明,值得进一步的研究来验证可能孤立的细胞亚型,他们的特定的分化潜能,他们假设选择性使用优惠候选人同种异体疗法。

测试UC-MSC chondrogenic承诺在三度空间的环境中,两个广泛使用的支架(Chondro-gide和Hyaff)作了比较。我们已经观察到膜细胞生长,细胞分布的差异取决于立体的支架结构。然而,在这两个实验小组,细胞显示chondrogenic表型chondrogenic标记sox-9呈阳性,胶原蛋白II型。值得注意的是,低氧张力施加影响UC-MSCs,类似于骨骨髓来源msc (52]。具体来说,低氧张力不妨碍UC-MSC增殖潜力,但它导致增加矩阵在UC-MSC颗粒生产的文化和一个增强chondrogenic标记表达UC-MSC脚手架文化,与先前的研究一致(42]。增加chondrogenic分化可能是由于低氧诱导因子- 1α和因子2α稳定和随后sox-9感应(53- - - - - -56]。进一步的体外分析是必要的,以更好地阐明这个特定的方面。总的来说,一个清晰的chondrogenic承诺已经观察到与支架,略微提高生产胶原蛋白II的证据当UC-MSCs透明质酸膜生长。这是符合文学几个证据显示可能和高效chondrogenic分化的间充质干细胞来自沃顿商学院果冻在不同的条件下,随着高密度细胞培养在旋转系统(57),文化在胶原蛋白水凝胶(58),或细胞生长聚已酸内酯/胶原nanoscaffolds [40]。

像chondrogenic分化,成骨的承诺是可以使用商业有机骨替代物用于临床应用,临床应用紧密地模仿。事实上,常见bovine-derived骨基质在这项研究中的应用是广泛接受临床场景的填缝骨的存在缺陷。我们观察到一个成骨的潜在的类似于其他的研究,从脐带是生长在单层细胞15)或三维支架的胶原蛋白I / III凝胶(59]或即使装上骨支架和裸小鼠皮下植入60]。我们的结果,以及可用的文学,表明UC-MSCs可能代表一个可能的同种异体骨组织工程细胞来源。

这些观察结果进一步证实了我们实验的最后一节。这些实验的想法启发了Scotti et al。61年],他想出一个复杂的临床前模型来展示工程功能的可行性骨器官通过预处理骨骨髓来源msc、嵌入在I型胶原蛋白网格,对肥厚性chondrocytic表型和随后的支架植入背裸体小鼠的皮下组织。Scotti戏剧性的原创性的研究和潜在的骨头工程是毫无疑问的。事实上,骨修复主要通过软骨内骨化发生和可能概括这个过程可能允许怀孕“第二代”梗塞部位骨替代品与提高效率强烈促进骨修复和再生。在我们的研究中,我们验证在体外UC-MSC能力来执行一个软骨内程序类似于BM-MSCs之前和我们应用相同的条件被Scotti et al。61年]。我们播种UC-MSCs到前面提到的商业骨替代品,我们培养的梗塞部位构造chondrogenic条件和随后的肥厚性介质。我们获得了令人鼓舞的结果矩阵的合成和表达成骨的标记(Cbfa1)。这当然是我们研究的最原始的特性之一。此外,我们的工作是第一个研究描述使用UC-MSCs“发展工程”范式。事实上,积极的结果观察到“推动”UC-MSCs通过软骨内骨化可能利用未来实验验证这些细胞产生的态度类似松质骨的组织在活的有机体内在小动物临床植入,为了提供一个有效的使用同种异体骨梗塞部位的替代品。

本研究的主要限制在体外实验的性质。这当然要求进一步的研究来验证直觉来源于之前获得的数据在临床前动物模型移动到任何临床应用。虽然这个缺点是任何暗示在体外研究,临床前模型是必不可少的在处理同种异体细胞评估这类干细胞的免疫特权之前在活的有机体内人类使用。然而,文学提供了几个证据UC-MSC immunoprivileged地位。这些细胞表达HLA-G,怀孕期间参与免疫耐受il - 6和VEGF,与MSC免疫抑制功能。此外,UC-MSCs能够抑制t细胞增殖(14]。所有这些方面似乎证实了潜在的使用的同种异体UC-MSC骨科组织工程。

然而,一个关键问题在处理同种异体msc仍然是潜在的免疫反应引起的宿主组织。证据在文学存在概述msc的同种异体来源的免疫原性,这种反应可能会妨碍极大地在同一细胞组织再生过程应该是增强。Eliopoulos等人2005年的研究(62年)显示了惊人的同种异体msc移植小鼠皮下注射的拒绝。这些细胞已经被观察到的类似的命运黄等。63年在临床前大鼠心肌梗死模型)。在他们的研究中,作者表明,同种异体细胞被拒绝从主机心脏组织植入后5周。这可能部分解释为瞬态immunoprivileged地位的msc后获得免疫原性分化和营养过程中宿主环境,从而诱发免疫反应的免疫系统。免疫反应和移植时间短也被描述Tano et al。64年在同种异体MSC移植模型的老鼠心脏心外膜的表面。类似的模式已被证实最近奥利维拉et al。65年]在MSC移植的临床前模型小鼠肾脏。他们观察到淋巴细胞浸润和同种异体MSC移植后排斥不迟于28天。因此,他们建议的迷人的概念“preactivation”的细胞,通过治疗INF-gamma tnf,为了降低免疫原性,延长移植段和营养特性。一个潜在的免疫反应在人类被德最近假设Windt et al。31日)的临床试验通过同种异体软骨修复msc和chondrons。尽管他们令人鼓舞的结果,没有发现同种异体细胞在修复网站1年,msc,暗示有时限的营养效应逐渐被宿主的免疫系统在分化过程。这同意前一个体外观察Mukonoweshuro et al。66年),概述了同种异体的免疫抑制特性而不是immunoprivileged地位chondrogenic-committed msc在老鼠模型中。潜在的msc还可能引发的免疫反应导致的不利影响修复设置,如图所示的功能型Sbano et al。67年在移植的皮肤移植的小鼠模型和塞弗特et al。68年在一只老鼠的肾脏移植。总的来说,这些证据要求的谨慎态度的潜在临床应用同种异体msc,尽管近期文献概述,作为同行,安全性和一些不错的效果。事实上,研究Garcia-Sancho et al。69年)显示一个可能的应用程序在膝关节骨关节炎、退行性椎间盘疾病几个安全问题,可能由于特有的“绝缘”受体的细胞,和王et al。(70年)最近提议注入同种异体msc在ACl重建改善症状和结构的结果。更长的随访,公园等。71年)显示的承诺影响植入复合透明质酸水凝胶由同种异体UC血液msc和改善软骨治疗骨关节炎的患者。类似的证据提出了织女星et al。72年和Gupta et al。73年),治疗膝骨关节炎的患者直接关节内注射同种异体人类msc。在不同的环境中,莫里森et al。74年)最近演示了颅骨骨重建的可行性通过同种异体间充质基质细胞(msc)陶瓷载体和聚合物支架,同样的临床观察Todeschi et al。75年]关于UC-MSC移植小鼠颅顶的缺陷。到目前为止,同种异体MSC治疗的争议仍然是一个文学的讨论问题。然而,一个常见的元素似乎出现在所有这些研究中。事实上,不同角色的msc是新兴的最近的临床前和临床证据,可能导致重新考虑使用同种异体msc”补充细胞对受伤组织”,假设他们的免疫系统识别。远非一个“积木”提交给宿主的免疫系统(与有限的可行性,因此,2 - 4周),同种异体msc可能代表了瞬态催化剂旁分泌,适合短时间内“肇事逃逸效应”(65年]。这个新范式的缺乏意味着“需要持久化”在宿主组织,msc是独立的治疗效果的直接分化,但他们可以通过促进对当地居民人口加速修复过程在有限的一段时间,直到同种异体msc被宿主的免疫系统清除。在这个角度看,它可以很容易地理解植入同种异体msc的更大的影响在一个“封闭环境”(即。在联合或嵌入bioscaffold);在这些设置,免疫系统可能会阻碍迅速消除msc。此外,同种异体msc在文学的各种再生性质可能与降低共存的生存时间是因为他们依赖因素分泌的细胞在移植后第一天,也被称为检查参与组成分泌腺”。”的确,MSC的概念一起preactivation延长细胞存活时间,检查参与组成分泌腺的当然代表一个未来的同种异体MSC组织工程前沿研究。

总之,目前的研究证实了chondrogenic UC-MSCs和成骨的承诺,培养立体的脚手架,它表明可能参与的UC-MSCs代软骨内支架通过关键技术提高骨再生的软骨内骨化过程。这些观察提供了一个坚实的角度为未来的临床前研究旨在改善软骨和骨再生修复。此外,UC-MSCs来源于以前丢弃的材料作为脐带;因此,他们代表一个干细胞群与几个优势更大的生物利用度和更低的伦理问题比其他细胞来源。总之,UC-MSCs可能会合理地认为是一个有吸引力的骨科同种异体干细胞疗法的机会。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

补充材料

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