文摘

关节软骨损伤和缺陷造成的创伤和慢性关节炎多血管非常常见,而受伤的软骨的修复仍然是一个巨大的挑战,由于其有限的愈合能力。干细胞组织工程提供了一种有前途的治疗选择受伤的关节软骨,因为细胞潜在的多个分型。然而,其应用在很大程度上限制了干细胞类型、数量、来源、增殖和分化。我们假设(1)脂肪干细胞是关节软骨修复的理想种子细胞,因为他们的可访问性和丰富和(2)关节软骨的微环境诱导脂肪干细胞分化成软骨细胞(ADSCs)。为了测试我们的假设,我们从兔脂肪组织分离出干细胞,cocultured这些ADSCs兔关节软骨软骨细胞。我们发现当ADSCs cocultured软骨细胞,促进关节软骨软骨细胞的增殖,抑制软骨细胞的凋亡,ADSCs成骨和chondrogenic分化的增强。这个coculture系统的研究机制表明,这个coculture系统的作用类似于TGF -的功能β1促进软骨细胞。

1。介绍

关节软骨中扮演一个重要的角色在关节活动。关节软骨缺乏血管、淋巴管和神经虽然受到严厉的生物力学环境。随着老龄化的发展和高能源、高速度的增加创伤、关节软骨损伤和退行性变患者增加(1]。关节软骨主要由软骨细胞和大量的细胞外基质(ECM),胶原蛋白和蛋白多糖组成。软骨细胞是居民在关节软骨细胞类型。软骨细胞是高度专业化的,新陈代谢活跃的细胞在发展发挥独特作用,ECM的维护和修理。不幸的是,软骨细胞复制潜力有限,一个因素的内在疗愈能力有限导致软骨受伤的反应。因此,自我修复的能力是很有限的(2]。

关节软骨损伤可分为部分完整的软骨厚度的缺陷和缺陷的完整的软骨厚度根据损伤的程度。当关节软骨损伤超过身体的自我修复能力,损伤区域将被纤维软骨的组织取代,这是不同的生化组成和生物力学性能与关节软骨相比。纤维软骨的组织不能满足需求的联合演习,导致病变的范围扩大引起关节炎和导致的疼痛和功能障碍。因此,关节软骨损伤的修复一直是一个困难和热点领域的骨科研究[3- - - - - -6]。

治疗受伤的软骨常用今天不能恢复软骨的组织结构和生物力学特性。组织工程的发展是交替更换或支持的功能有缺陷的或受伤的身体部位使用细胞生物学和工程学的原则。它提供了一个新的概念和技术来处理组织缺陷和功能残疾。

作为软骨组织工程的主要因素,种子细胞的选择和收购是最重要的。自体软骨细胞是唯一的种子细胞已用于诊所,但它的应用程序是有限的,因为施主能级移动和困难的隔离和栽培。成体干细胞体内普遍存在,特别是脂肪干细胞(ADSCs)。ADSCs用于组织工程的理想种子细胞,因为他们的可访问性和丰富。

传统的方法诱导ADSCs分化成软骨细胞需要大量的细胞因子,它是昂贵的,不能广泛应用于临床实践。几项研究已经发现,关节软骨的微环境可以促使ADSCs分化成软骨细胞,但脂肪干细胞与关节软骨cocultured能否促进软骨细胞的生长并没有被研究过。

ADSCs成体干细胞来自中胚层,已成为理想的种子细胞来源,是搜索热点。ADSCs是方便,可以轻松买到,足够的干细胞来源只有最小损伤身体比其他成年干细胞来源相似的生物学特性和分化潜力如骨髓间质干细胞(bmsc)。不仅是ADSCs容易获得足够的数量,但也提供更好的bmsc增殖能力相比。

转化生长因子-β1 (TGF -β1)是一种多功能细胞生长和细胞外基质合成的调节器;它能促进软骨细胞的增殖,增加蛋白多糖和II型胶原蛋白的合成,并减少软骨胶原酶的表达和分泌。此外TGF -β1可以抑制炎症反应,促进金属蛋白酶组织抑制剂表达式(7]。

在我们目前的研究中,ADSCs和软骨细胞cocultured时,我们发现软骨细胞的增殖被提拔和软骨细胞的凋亡抑制。这个coculture系统促进软骨细胞产生更多的蛋白质合成代谢和抑制分解代谢的蛋白质。我们还发现,这些现象是TGF -密切相关β1通路。研究结果表明coculture ADSCs和软骨细胞可以刺激TGF -的促进效应β1,软骨损伤的治疗提供一种新的解决方案。

2。材料和方法

2.1。隔离的兔子ADSCs

ADSCs兔脂肪组织中分离的根据出版协议(8,9]。短暂,颈后皮下脂肪组织是收获的兔子(只是成熟女性新西兰白兔,重2.5到3.0公斤)和PBS洗。组织样本被切成小块,2 g脂肪组织增加了在每个25毫升的0.12% collagenase-PBS解决方案(表达载体)消化在37°C 45分钟。混合消化期间每15分钟动摇了。后立即反应完成后,杜尔贝科25毫升的修改鹰介质(DMEM)(表达载体)添加到中和胶原酶的活动。最终的解决方案是使用70过滤μ米尼龙膜。滤液离心机在1300 rpm 6分钟25°C,和上层的移除。的小球ADSCs resuspended在含10%胎牛血清的DMEM(的边后卫)表达载体和播种在60厘米2组织培养的菜肴的密度 细胞/厘米2并与培养基培养,DMEM含有10%的边后卫(表达载体),青霉素100单位/毫升和100μg / mL链霉素在37°C, 5%的公司2,95%的空气。

2.2。ADSCs纯化和表征

ADSCs纯化,以一个史诗XL流式细胞分析仪和免疫染色。流式细胞术测定,ADSCs被放置在一个离心管( 1 /管)和孵化μ克以下特定抗体包括鼠标anti-CD90抗体(http://www.antibodies-online.com/猫# ABIN118259),鼠标anti-CD44抗体(http://www.antibodies-online.com/、猫# ABIN2226505)山羊anti-CD73抗体(圣克鲁斯生物技术公司,猫# sc14684),鼠标anti-CD31抗体(http://www.antibodies-online.com/、猫# ABIN3024342)和鼠标anti-CD45抗体(http://www.antibodies-online.com/、猫# ABIN1449134)一夜之间在4°C。第二天早晨,每个样本中的细胞与PBS清洗三次。然后他们被孵化1小时在4°C 1μ克FITC-conjugated山羊anti-mouse IgG抗体(热费希尔科学、猫# F2761)测试CD90、CD44、CD31、CD45、或孵化与Cy3-conjugated驴抗体IgG抗体(Abcam,猫# ab6949)为CD73测试。CD34表达,细胞被孵化与1%的山羊血清在室温下30分钟和1的反应μg的兔子anti-CD34抗体(bios抗体,猫# bs - 2038 r)在一夜之间在4°C,然后用PBS洗3次,1μ克Cy3-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白(Abcam猫# 6939)1小时在4°C。ADSCs孵化与PBS代替主要抗体被用作控制样本。与PBS洗涤三次后,样本分析使用一个史诗XL流式细胞分析仪和积极染色细胞CD90、CD44, CD73和消极CD31染色,CD34、CD45收集下列实验。

免疫染色,ADSCs被播种在12-well板的密度 /好,培养3天的dmem - 10%的边后卫。这些细胞被洗一次PBS和PBS缓冲4%多聚甲醛固定30分钟。固定细胞孵化与抗体主要包括鼠标anti-rabbit CD90、CD44、CD31、CD45抗体(1:300稀释)和山羊anti-rabbit CD73抗体(1:200稀释)一夜之间在4°C。CD34染色,细胞被孵化与1%的山羊serum-PBS 30分钟,然后用兔子anti-CD34抗体反应(1:300稀释)在室温下2小时。ADSCs孵化与PBS代替主要抗体被用作控制样本。孵化后主要抗体,细胞都用PBS三次洗净,然后用Cy3-conjugated反应山羊anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 500稀释)在室温1小时。染色细胞的荧光图像得到在倒置荧光显微镜下观察(尼康Eclipse)和现货成像分析软件。

2.3。隔离和软骨细胞的文化

原发性软骨细胞分离从女兔子如前所述10]。简而言之,从股骨头软骨片,股骨髁部,然后胫骨平台被剥夺了,丁,胶原酶消化两次(3毫克/毫升的胶原酶1 h,然后0.5毫克/毫升的胶原酶在一夜之间在37°C)。未消化的软骨是通过70年μ米尼龙过滤器和滤液含有软骨细胞在1200转离心5分钟,上层的丢弃,小球是resuspended培养基和培养与95%的空气和5%的孵化器有限公司2在37°C和用于以下实验。ADSCs是cocultured与软骨细胞(1:1)在transwell钱伯斯(11]。

2.4。细胞培养

为了研究coculture ADSCs对软骨细胞的增殖的影响,我们培养的软骨细胞使用小说transwell室(图1(一)有四个不同的条件12天。组1(软骨细胞组):软骨细胞被播种在直接(众议院)1×10的密度5在24-well板(图/好1(b))和培养培养基的边后卫(dmem - 10%)。组2 (coculture组):软骨细胞被播种在直接的密度(众议院) /好,ADSCs被播种在up-chamber的密度 /在24-well板。细胞和培养基培养(图1(c))。组3 (TGF -β1组):软骨细胞被播种在直接的密度(众议院) / 24-well板和培养在培养基TGF - 5 ng / mLβ1(图1(d)、最终浓度、研发系统、明尼阿波利斯、锰)。组4 (coculture + TGF -β1抑制剂组):软骨细胞被播种在直接的密度(众议院) /好,ADSCs被播种在up-chamber的密度 /在24-well板。这些细胞被培养在培养基15μTGF - Mβ美国莱克1抑制剂(Galunisertib LY2157299)(图1(e))。细胞增殖和分化的能力是衡量形态、MTT测定和组织化学染色。


图1
实验模型。(一)transwell室的照片。((b) - (e))的原理图四组,分别为正常培养基培养的软骨细胞(b),软骨细胞与ADSCs cocultured (c),软骨细胞培养与TGF -β第一媒介(d),软骨细胞cocultured ADSCs和TGF -β1抑制剂(e)。
2.5。细胞凋亡分析使用赫斯特33258染色

在不同条件下培养的软骨细胞的凋亡是由赫斯特33258年分析染色。软骨细胞在培养5天与PBS和孵化1洗两次μ33258克/毫升赫斯特在室温下5分钟。细胞和核形态使用阶段和荧光显微镜检查。

2.6。细胞增殖实验

软骨细胞的增殖培养MTT比色在不同条件下测定。软骨细胞培养与不同条件下24-well板如上所述为0,3、6、9、12天。在每个时间点的结束,每个50μL 5毫克/毫升的MTT被添加到每个在37°C,孵化4小时。这些细胞被定期在倒置显微镜下观察。当紫色沉淀在显微镜下清晰可见,500年μL(洗涤剂轻轻试剂添加到每个好,传得沸沸扬扬。板是在黑暗中离开4个小时在室温下,然后200年μL的反应混合物从每个24-well板被转移到一个新的96孔板。光学密度在96 - 570纳米孔板测量使用标(BIO-RAD)。

2.7。在软骨细胞组织化学染色三种培养条件

与不同条件下培养9天后细胞被阿尔新蓝染色,甲苯胺蓝和红色染料O通过协议。短暂,最终文化,媒介被从每个和PBS的细胞被洗一次。细胞与中性10%福尔马林固定在PBS室温20分钟,然后冲洗3次PBS。固定细胞治疗与阿尔新蓝溶液(1 g的阿尔新蓝GX 100毫升的3%乙酸)在室温下2小时,或0.1%甲苯胺蓝染色解决方案5分钟,或0.1%的番红精O 5分钟。然后用水洗了三次,细胞图像的彩色细胞在显微镜下进行分析。

2.8。粘多糖(GAG)测定培养基

GAG生产在中软骨细胞的培养与不同条件分析了5天使用GAG分析工具包(Beyotime,中国)根据制造商的规格(12]。所有测量规范化细胞总数在每个文化条件。

2.9。定量实时逆转录聚合酶链反应(存在)

总RNA分离软骨细胞与不同条件下培养5天后的试剂盒工具包(英杰公司)根据生产的协议(13]。互补DNA合成总RNA使用RT的逆转录反应工具包(Promega)。实时PCR进行使用Mx3000P实时PCR系统(应用生物系统公司)根据制造商的指示和SYBR预混料Taq交货(豆类)作为DNA-specific荧光染料。信使rna表达的检测的引物序列见表1。

表1
引物序列基因表达的检测。

所有的反应都至少重复三次。基因表达水平相对于计算β肌动蛋白通过Stratagene Mx3000P软件。

2.10。免疫印迹分析

确定蛋白的表达在不同条件下培养的软骨细胞5天,整个细胞提取物(溶菌产物)准备 细胞裂解缓冲(Beyotime,中国)。蛋白质样品(30μ克/每)受到12% SDS-polyacrylamide凝胶和转移到硝化纤维膜。探讨了目标蛋白与特定antibodies-Cyclin D1, caspase-3, mmp3, mmp13 TGF -β1、SOX9,胶原蛋白II型α1链(col2α1)、过氧物酶体proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1α(PGC-1α),和3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)规范化。所有抗体都来自圣克鲁斯。

2.11。统计分析

所有的实验进行了一式三份,学生的所有数据进行了分析t以及和均值±SD。一个 值< 0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。ADSCs纯化和表征

ADSCs从兔脂肪组织分离,纯化流式细胞术。免疫染色和流式细胞仪测定(FCA)表明,ADSCs隔绝兔脂肪组织表达高水平的CD44(89.15%,数据2 (c)和3(一个)),CD90(94.6.15%数字2 (e)和3 (c))和CD73(63.67%,数据2(我)和3 (e))。相比之下,只有一小部分的兔子ADSCs展出造血标记CD31(0.5%,数据2 (b)和3 (b))、CD34(1.5%,数据2 (g)和3 (d))和CD45(19.67%,数据2 (d)和3 (f))。这些发现表明,ADSCs已经从兔脂肪组织分离,可以用于进一步的实验。

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图2
ADSCs被流式细胞术的特征。(一)从ADSCs FITC -控制获得的结果是( )孵化FITC-conjugated山羊anti-mouse IgG抗体。(b) CD31表达ADSCs孵化和CD31抗体检测到FITC-conjugated第二抗体。(c) CD44表达ADSCs孵化和CD44抗体被FITC-conjugated第二抗体。(d) CD45表达ADSCs孵化与CD45 FITC-conjugated第二抗体抗体和测试。(e) CD90表达ADSCs孵化CD90抗体和由FITC-conjugated第二抗体。(f)负控制的结果ADSCs孵化与Cy3-conjugated山羊anti-rabbit IgG抗体。(g) CD34表达ADSCs孵化与CD34抗体被Cy3-conjugated山羊anti-rabbit IgG抗体。(h) -控制的结果ADSCs孵化与Cy3-conjugated驴抗体IgG抗体。(i) CD73表达ADSCs孵化anti-CD73抗体和被Cy3-conjugated驴抗体IgG抗体。
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图3
在ADSCs干细胞标记表达式。干细胞标记ADSCs被确定通过特定的抗体反应CD44 (a), CD31 (b), CD90 (c), CD34 (d), CD73 (e)和CD45 (f),分别。超过90%的ADSCs被CD44 (a)和积极彩色CD90 (c),但只有不到70%的ADSCs表示CD73 (e)和不到20%的ADSCs展出CD45 (f)。另一方面,很少ADSCs被CD31积极染色(b)和CD34 (d),获得的图像是一个倒置荧光显微镜。酒吧:100μm。
3.2。通过TGF - ADSCs促进软骨细胞的增殖β1通道

为了研究ADSCs对软骨细胞的增殖的影响,我们孤立的两种不同的细胞。ADSCs孤立从兔脂肪组织和软骨细胞软骨组织。的机制ADSCs对软骨细胞的增殖的影响也进行了研究。从兔软骨软骨细胞分离培养和ADSCs一起使用小说transwell室(图1(a))。形态分析表明,与正常培养基培养的软骨细胞(对照组)5天表现出梭形的细胞凋亡细胞(图4(一))。与ADSCs当软骨细胞培养,软骨细胞仍在纺锤形状减少凋亡细胞,增加细胞的数量(图4 (b))。添加TGF-1β软骨细胞培养基的细胞数量明显增加,在很大程度上抑制细胞凋亡的细胞(图4 (c))。这些结果进一步证明了MTT试验。软骨细胞的增殖被提拔当软骨细胞与ADSCs cocultured(图4 (d))。此外,软骨细胞5增长快得多μTGF - g / Lβ第一媒介比对照组( ,图4 (d))和ADSCs-chondrocytes coculture集团( ,图4 (d))。软骨细胞生长增殖率的三个条件是TGF -β1 > ADSCs >控制。

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图4
软骨细胞的增殖培养与三个不同的条件5天。软骨细胞的形态文化与控制介质(a), ADSCs coculture条件(b)和TGF -β第一媒介(c)。在三种不同条件下培养的软骨细胞的生长曲线显示((d)、(e))。软骨细胞,软骨细胞在正常培养基培养。Coculture:软骨细胞与ADSCs cocultured。TGF -β1:软骨细胞培养了TGF -β第一媒介。MTT比色都是试验。细胞周期蛋白D1蛋白表达在三种不同条件下培养的软骨细胞5天由免疫印迹(f)。基因表达在三种不同条件下培养的软骨细胞周期蛋白D1的5天由实时PCR。数据显示为±SEM。 与对照组(软骨细胞)。

这些结果进一步证实了实时PCR(图4 (g))和免疫印迹(数字4 (e)和4 (f))。基因表达的细胞周期蛋白D1 TGF-1β集团被发现比对照组高出三倍(图4 (g))和ADSCs-chondrocytes coculture组表现出高1.98倍比对照组的细胞周期蛋白D1基因(图4 (g))。同样,细胞周期蛋白D1蛋白表达的调节与TGF-1软骨细胞培养β和ADSCs-chondrocytes coculture系统(数据4 (e)和4 (f))。结果表明,软骨细胞的semiquantifying cocultured ADSCs生产30%比对照组细胞周期蛋白D1和培养TGF -β1(数据4 (e)和4 (f))生产82%比对照组的细胞周期蛋白D1。

ADSCs的coculture影响软骨细胞的增殖也调查了组织化学染色chondrocyte-related蛋白质的表达。结果表明,软骨细胞在TGF -增长快得多β第一介质(数据5 (c),5 (f),5(我))比那些生长在ADSCs coculture条件(数据5 (b),5 (e),5 (h))和对照组(数字5(一个),5 (d),5 (g))。

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图5
软骨形成标记表达式与三个不同的软骨细胞培养条件9天检测到gus检测((a) -(我))和ELISA (j)。阿尔新蓝染色显示在((一)——(c))。甲苯胺蓝染色显示在((d) - (f))。番红精O染色显示在((g) -(我))。软骨细胞培养在控制介质((a)、(d)和(g)),或ADSCs cocultured系统((b)、(e)和(h)),或TGF -β第一介质((c)、(f)和(我)),上述三个标记染色。粘多糖的生产(呕吐)分析了使用酶联免疫试剂盒(j)。数据显示为±SEM。 与对照组。控制:软骨细胞在正常培养基培养。Coculture:软骨细胞与ADSCs cocultured在一起。TGF -β1:软骨细胞培养了TGF -β第一媒介。

5天后的细胞培养在中包含TGF -β1是彩色的速度超过95%与所有三个污点,阿尔新蓝(图5 (c)),甲苯胺蓝(图5 (f)),红色染料O(图5(我))。类似的细胞与ADSCs cocultured积极阿尔新蓝染85%以上的时间了。(图5 (b)),甲苯胺蓝(图5 (e)),红色染料O(图5 (h))。对照组细胞积极彩色约70%的时间与三种污渍阿尔新蓝(图5(一个)),甲苯胺蓝(图5 (d)),红色染料O(图5 (g))。

粘多糖的生产(GAG)在三种不同条件下培养的软骨细胞介质的决心使用酶联免疫试剂盒。结果表明,软骨细胞产生更多的呕吐时要么培养和TGF -β第一媒介控制样品(3.36倍)或cocultured ADSCs比对照样品(1.42倍)(图5 (j))。

免疫印迹结果表明,更高的TGF -表达式β1被发现在软骨细胞培养与TGF -β第一介质(数据6(一)和6 (b))或coculture系统(数据6(一)和6 (b))。此外,三个chondrocyte-related蛋白质,SOX-9,胶原蛋白II型(第二列α1)、PGC-1α,是调节软骨细胞培养与TGF -β第一中等或者ADSCs coculture系统(数据6(一)和6 (b))。这些研究结果进一步证实了实时PCR(图6 (c))。然而,当我们添加Galunisertib, TGF -β1抑制剂,媒介ADSCs cocultured软骨细胞,呕吐释放软骨细胞的数量明显减少(图6 (d))。此外,当这些细胞被cocultured TGF -β1抑制剂,TGF -β1,所有三个chondrocyte-related蛋白质SOX9, Col2α1,PGC-1α表达下调(数据6 (e),6 (f),6 (g))。

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图6
促进ADSCs对软骨细胞的影响机制进行免疫印迹((a)、(b)、(e)和(f)),实时PCR ((c)、(g))和酶联免疫试剂盒(d),软骨细胞培养在控制介质(软骨细胞),ADSCs cocultured系统(coculture), TGF -β第一媒介(TGF -β1),ADSCs cocultured系统+ TGF -β1抑制剂(coculture +)为5天。免疫印迹((a)、(b)、(e)和(f))和实时PCR ((c)、(g))结果表明,TGF -β1在软骨细胞与ADSCs cocultured或培养TGF -β第一是调节。此外,软骨细胞产生更多的蛋白质和基因包括SOX-9后,胶原蛋白II型(α1)、PGC-1α当他们与TGF -培养β第一中等或者ADSCs cocultured系统。此外,粘多糖的生产(GAG)软骨细胞与ADSCs cocultured也增加。然而,在添加TGF -β1抑制剂ADSCs cocultured系统,生产的呕吐在软骨细胞(d)下降。此外,所有上述蛋白质和基因减少软骨细胞培养与ADSCs + TGF -β1抑制剂((e), (f)和(g))。数据显示为±SEM。 与软骨细胞组。
3.3。通过TGF - ADSCs抑制软骨细胞的凋亡β1通道

我们接下来研究的影响ADSCs cocultured与软骨细胞细胞凋亡。软骨细胞培养与控制中显示多膜起泡以及核凝结和碎片(数字7(一),7 (d),7 (g);见箭头)。然而,这些细胞凋亡特征功能被抑制在软骨细胞培养与ADSCs coculture组和5 ng / mL的TGF -β1文化集团(数字7 (e),7 (f),7 (h),7(我))。

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图7
形态学((一)——(c))和细胞凋亡测定((d) - (i))的软骨细胞培养和控制介质((a)、(d)和(g)), ADSCs cocultured系统((b)、(e)和(h)),和TGF -β第一介质((c)、(f)和(我))为5天。形态分析显示软骨细胞培养的一些膜起泡控制介质(a),而细胞起泡的人数降低了软骨细胞培养与ADSCs cocultured系统(b)和TGF -β第一媒介(c)。赫斯特33258年染色显示许多染色质密集的软骨细胞培养与控制介质((d) (g)),和更少的细胞凋亡的细胞被发现在软骨细胞培养与ADSCs cocultured系统(e)、(h)和TGF -β第一媒介((f),(我))。(g)的图片,(h), (i)和(d)的相应更高的放大图像,(e)和(f)。

据报道,caspase-3是蛋白质发挥了重要作用在细胞的凋亡14]。为了找出ADSCs抑制软骨细胞的凋亡,我们用免疫印迹和实时PCR检测软骨细胞文化caspase-3水平在三种不同条件下(数字8(一个),8 (b),8 (c))。结果表明,caspase-3的表达被抑制软骨细胞cocultured ADSCs组和TGF -β第一培养基组(数字8(一个),8 (b),8 (c))。一些研究表明,基质金属蛋白酶(MMP)如MMP3和MMP13会损害软骨细胞(15,16]。我们的研究结果表明,ADSCs减少软骨细胞基质金属蛋白酶的破坏。类似的结果也发现TGF -培养的软骨细胞β第一介质(数据8 (c),8 (d),8 (e))。

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图8
表达异化的标记与三个不同的软骨细胞培养条件5天,由免疫印迹((a)、(b) (d)和(e))和实时PCR ((c)、(f))。Caspase-3蛋白质表达下调与软骨细胞培养时ADSCs cocultured系统和TGF -β第一媒介((a)、(b))。caspase-3的mRNA水平也降低了软骨细胞培养与ADSCs cocultured系统和TGF -β第一媒介(c)。此外,MMP3和MMP13都镇压在软骨细胞培养ADSCs cocultured系统和TGF -β第一介质测试通过免疫印迹((d)、(e))和实时PCR (f)。数据显示为±SEM。 与软骨细胞组。

然而,促进ADSCs对软骨细胞增殖的影响被TGF -抑制β1抑制剂。MTT试验表明,TGF -β1抑制剂下调TGF -软骨细胞的增殖β1抑制剂添加在软骨细胞与ADSCs cocultured(图9(一个))。免疫印迹和实时PCR表明TGF -β1抑制剂降低了细胞周期蛋白D1表达式由ADSCs提升(数字9 (b),9 (c),9 (d))。赫斯特33258年很多细胞染色质凝集试验表明,染色观察软骨细胞组(数字10 ()和10 (d)),而软骨细胞的染色质凝集减少cocultured ADSCs集团(数据10 (b)和10 (e))。的TGF -β1抑制剂软骨细胞cocultured ADSCs系统诱导细胞凋亡细胞(数字10 (c)和10 (f))比ADSCs-chondrocytes coculture集团(数字10 (b)和10 (e))。不同的文化系统的细胞凋亡率是按照以下顺序:控制> ADSCs coculture + TGF -β1抑制剂> ADSCs coculture(数字10 ()- - - - - -10 (f))。

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TGF - - -的影响β1抑制剂的软骨细胞MTT比色与不同条件下培养5天测定(a),免疫印迹((b)、(c))和实时PCR (d)。试验表明,软骨细胞增长更快ADSCs coculture系统控制中;然而,当TGF -β1抑制剂添加到软骨细胞与ADSCs cocultured系统,他们的增殖抑制。免疫印迹和实时PCR表明基因表达和蛋白表达在培养的软骨细胞周期蛋白D1的增加ADSCs coculture系统,但细胞周期蛋白D1不高与TGF -软骨细胞培养时β1抑制剂ADSCs cocultured系统((b)、(c)和(d))。软骨细胞,软骨细胞在正常培养基培养。Coculture:软骨细胞与ADSCs cocultured。Cocultured +: ADSCs Cocultured系统TGF -β1抑制剂补充道。数据显示为±SEM。 与对照组。
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图10
TGF - - -的影响β1抑制剂在三种不同条件下培养的软骨细胞凋亡分析5天由赫斯特33258染色。(一)、(d))在正常培养基培养软骨细胞(软骨细胞)。((b)、(e))软骨细胞与ADSCs cocultured (coculture)。((f) (c))与ADSCs和TGF -软骨细胞培养β1抑制剂(coculture +)。许多凋亡细胞被发现在正常软骨细胞培养介质((一),(d));然而,ADSCs coculture系统抑制软骨细胞的凋亡((b)、(e))。ADSCs对细胞凋亡的抑制效应被TGF -β1抑制剂((c)、(f))。

接下来,进一步检测到凋亡蛋白质免疫印迹和实时PCR。数据显示,caspase-3的表达在软骨细胞减少cocultured ADSCs集团(数据(11日)和11 (b));然而通过添加TGF - caspase-3水平调节β1抑制剂软骨细胞cocultured ADSCs集团(数据(11日),11 (b),11 (c))。研究是否TGF -β1参与生产基质金属蛋白酶抑制剂如MMP3 MMP13,免疫印迹和实时PCR进行。结果表明,TGF -β1抑制剂显著恢复MMP3的表达下调,MMP13通过ADSCs软骨细胞(数字11 (d),11 (e),11 (f))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
图11
TGF - - -的影响β1抑制剂对分解蛋白质和基因的表达在不同条件下培养的软骨细胞5天由免疫印迹((a)、(b) (d)和(e))和实时PCR ((c)、(f))。免疫印迹和实时PCR显示一些分解标记蛋白质和基因如caspase-3 MMP3, MMP13表达下调与软骨细胞培养时ADSCs coculture系统和TGF -时恢复到原来的水平β1抑制剂添加在软骨细胞与ADSCs cocultured测试通过免疫印迹((a)、(b) (d)和(e))和实时PCR ((c)、(f))。数据显示为±SEM。 与对照组。 意味着 与软骨细胞。

上述结果表明,ADSCs促进软骨细胞增殖和抑制细胞凋亡和削弱了蛋白表达可能损伤软骨细胞的生长,通过激活TGF -β1通路。

4所示。讨论

创伤、骨关节炎和骨软化,可能导致软骨损伤在临床实践中非常常见。关节软骨修复的传统方法主要是通过动员软骨细胞在促进软骨愈合的治疗潜力。然而软骨组织没有血液供应;它只能依靠关节液提供营养;因此一旦软骨组织受损,很难修复。再生医学的发展,组织修复软骨再生功能提供了一种新的方法。

组织工程技术需要大量的种子细胞。干细胞来源于脂肪组织有广泛的来源。ADSCs容易获得干细胞含量高和当供体损伤小。同时ADSCs有多向分化的潜能,可以逃避免疫识别。此外,ADSCs还能分泌功能细胞因子诱导软骨形成,如TGF -β1、BMP4和FGF和其他人,这能促进软骨细胞的再生。研究表明,TGF -β1可以诱导ADSCs分化成软骨细胞转染后ADSCs。目前,大量的研究表明,当cocultured ADSCs和软骨细胞,软骨细胞可以提示ADSCs分化成软骨细胞。然而很少有报告显示是否cocultured ADSCs和软骨细胞可以促进软骨细胞的再生。TGF -β1长期以来一直被作为主要的监管机构软骨形成和骨生成17,18]。也有研究发现,TGF -β1在软骨细胞成熟总是扮演了一个至关重要的角色。TGF -β1刺激软骨细胞增殖,但抑制软骨细胞分化[19]。最近为了诱导软骨细胞修复受损的软骨几个调查主要集中在如何交付TGF -β1体内受损的关节软骨(20.]。TGF -β1信号被发现调整等蛋白质细胞周期蛋白D1和caspase-3促进软骨细胞的生长21]。II型胶原蛋白的表达SOX9, PGC-1α,所有的,都是著名的软骨成分(22- - - - - -24),可以调节TGF -β1。据报道,我们知道ADSCs和TGF -β1能促进软骨细胞的生长,但目前没有报道关于ADSCs促进软骨细胞的生长,如果这种机制与TGF -有任何关系β1信号当ADSCs cocultured软骨细胞。

在我们的研究中提取脂肪中提取干细胞和软骨细胞后从新西兰白兔,我们使用transwell钱伯斯coculture ADSCs和软骨细胞(细胞比率为1:1)。我们使用TGF -β1被认为是一个促进软骨细胞的增殖是一个积极的控制(25]。软骨细胞的增殖是发现在不同的时间点,我们发现ADSCs和TGF -β1能促进软骨细胞的增殖。为了研究ADSCs促进软骨细胞的增殖,我们检查了细胞周期蛋白D1的变化是一个重要的蛋白质在控制细胞周期,导致软骨细胞的增殖实验(26,27]。结果表明,可促进细胞周期蛋白D1 ADSCs和TGF -β1。然后我们发现ADSCs也可以抑制软骨细胞的凋亡通过调整caspase-3的表达,这表明ADSCs可以从另一个角度促进软骨细胞的增殖。一些研究显示,基质金属蛋白酶可以损伤再生的软骨细胞在某种程度上(28),我们测试的影响ADSCs MMP3和MMP13。结果证实,ADSCs和TGF -β1可以抑制这两种蛋白的表达在一定程度上,这也可以说明ADSCs扮演一个角色在促进软骨的再生。在目前的研究中,我们证实ADSCs能促进呕吐的释放,和SOX9, PGC-1α,和一系列的软骨再生标记蛋白29日- - - - - -32]表达可促进软骨细胞与ADSCs coculture。这进一步表明,ADSCs不仅能促进软骨细胞的增殖,但也有保护作用的再生软骨细胞,这种效果是类似于TGF -β1。

为了证实ADSCs对软骨细胞的作用的具体机制,我们确定了TGF -β1的表达在不同条件下培养的软骨细胞。我们发现TGF -β1级增加的软骨细胞与ADSCs cocultured相比只软骨细胞(图6(一),6 (b),6 (c))。然而,当TGF -β1抑制剂添加到软骨细胞与ADSCs cocultured TGF -β1水平明显下降(数字6 (e),6 (f),6 (g))。此外,外加TGF -β1抑制剂cocultured软骨细胞,发现TGF -β1抑制剂可以抑制ADSCs促进软骨细胞的增殖,表明ADSCs可以通过TGF -促进软骨细胞的再生β1通路。

我们确认ADSCs能促进软骨细胞的增殖和再生在体外通过一系列实验。这种促进效应TGF -密切相关β1通路。虽然我们仍然需要动物实验进一步证实了我们的推论,本研究仍然可以提供一些新的想法治疗软骨损伤修复。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

杰施、九龙梁和郭Bingyu贡献同样这项工作。