文摘

实现安全的病人治疗,无血清细胞培养条件建立细胞疗法。在先前的研究中,我们表明,血清培养青睐MSCA-1扩散⁺osteoprogenitors来自下颌骨膜。在这项研究中,由MSCA-1体外特异性形成矩阵⁺下颌骨膜细胞(JPCs 3捐助者)评估和比较血清和血清媒体条件下使用不需要拉曼光谱。基于标准的荧光测定,JPCs从一个病人血清培养条件下无法采集矿物,而其他细胞显示出类似的矿化水平在两个条件下。从成矿MSCA-1拉曼光谱⁺JPCs显示更高水平的羟磷灰石形成和矿物在血清培养条件下矩阵比例更高。高碳酸磷酸比率和高结晶度JPCs血清条件下培养表示不成熟骨形成。由于减少胶原蛋白生产无血清条件下,我们获得了显著差异在胶原成熟和脯氨酸羟脯氨酸比率相比无血清条件。我们得出这样的结论:拉曼光谱是一个有用的工具的评估和无创监测osteoprogenitor细胞的体外矿化。进一步的研究应该扩展这方面的知识,提高JPC矿化通过优化培养条件。

1。介绍

下巴periosteum-derived osteoprogenitor细胞(JPCs)代表一个最佳的干细胞来源为骨组织工程应用在口腔颌面外科手术。JPCs的详细描述,优化血清培养和分化条件必须建立许可病人研究这些细胞。从下颌骨膜组织中提取细胞群是异构的。我们之前显示,分组人口JPCs表达高水平的间充质干细胞antigen-1 (MSCA-1)中能增加成骨的潜力相比MSCA -细胞分数(1]。为了避免免疫反应在未来的临床研究,我们建立了血清培养条件和MSCA-1观察到的扩散⁺采用无血清细胞分数青睐(2]。同时,我们发现较早但弱矿化潜力的无血清培养JPCs,这可能显著对抗未来组织工程的成功应用。

为了评价磷酸钙沉淀形成的细胞,染色茜素红S等程序,冯Kossa, OsteoImage®是常用的2- - - - - -4]。这些方法能够量化矿物沉积但没有评估质量的矿化的物种。拉曼光谱可以克服这种缺陷通过检测分子的振动模式。指纹描述了拉曼光谱代表的非破坏性读出识别细胞的表型(5)、分级和评估恶性肿瘤(6- - - - - -8)和细胞外基质成分的分析9,10]。循环肿瘤细胞的检测和捕获了代表拉曼技术的进一步应用模式(11,12]。在矿化组织,拉曼光谱是敏感的磷酸盐和碳酸盐矿物晶格结构。此外,它可以检测振动源自于胶原基质。这项技术可以全面了解骨骼的生化成分和结构和各种矩阵的贡献蛋白在骨材料特性(13]。拉曼光谱在窗口从400厘米⁻¹约1800厘米⁻¹包括最特色的磷酸盐和碳酸盐乐队代表骨矿物质和骨基质成分(13]。检测到磷酸最著名的乐队在~ 961厘米⁻¹,即确切位置monohydrogen磷酸盐(HPO敏感₄)[13]。新形成的骨已被证明展览HPO很高₄内容导致拉曼乐队转移到低波数(13,14]。报告主要碳酸盐和磷灰石的峰值的位置变化的函数的年龄,健康状况,和人类样本(个人间存在差异13]。蛋白质的骨头在苯丙氨酸的拉曼光谱乐队在1005厘米⁻¹脯氨酸(856厘米⁻¹)、羟脯氨酸(881厘米⁻¹)和酰胺三世(1242 - 1280厘米⁻¹)以及酰胺我带1660至1690厘米⁻¹。基于这些拉曼峰以及磷酸盐和碳酸盐特定信号,定性的读数可以由计算矿物矿化矩阵的比率,碳酸盐磷酸盐比和结晶度13]。蛋白质胶原蛋白的生化特性,信号敏感光谱可以用来研究胶原成熟(13,15]。

在这项研究中,我们使用拉曼显微镜评估成骨分化和矿化的生化组成物种JPCs在不同介质条件下形成的。JPCs来源于三个男性患者的下颌骨膜MSCA-1磁分离⁺表达分化之前。我们在体外诱导骨生成细胞在血清和血清培养条件下(DMEM和MesenCult (MC)介质)和收集拉曼光谱后,从两种文化5和20天的区别。使用多变量方法,我们比较了矿化内容基于获得的光谱。此外,定性指标的体外矿化矩阵的形成来自两个媒体条件下的拉曼光谱和比较。

2。材料和方法

2.1。细胞隔离和文化

获得书面知情同意后,JPCs源自4捐助者(3男性:21岁(供体# 1复杂骨折中脸,称为健康),60岁,74年和81年(捐助# 2、癌的地板口;# 3,颊边的癌;# 4,癌的牙槽突)包含在本研究按照当地伦理委员会(批准文号:194/2008BO2)。下颌骨膜组织捐助者# 2、3和4是在安全的距离从一个区域中提取识别肿瘤。因此,下颌骨膜组织机械拆分,紧随其后的是一种酶消化使用XI胶原酶(1500 U /毫升,Sigma-Aldrich Steinheim,德国)90分钟。之后,JPCs被镀到75厘米²培养瓶。JPC扩张,细胞在DMEM培养/ F-12(显示Invitrogen-BioSource欧洲,比利时)含10% FCS (Sigma-Aldrich、Steinheim、德国)和1%的杀菌剂和青霉素和链霉素(Biochrom,柏林,德国)。DMEM-cultured细胞通过使用Trypsin-Versene EDTA(瑞士巴塞尔1 x, Lonza)。后逐步减少FCS内容的文化中切换到,xeno-free血清培养基MesenCult-XF (MC-XF,干细胞技术,加拿大温哥华)和细胞是通过使用MesenCult-ACF离解工具包。此外,MC-XF文化环境,文化的菜肴或烧瓶与MesenCult-XF附件基质涂层在一夜之间由同一家公司提供的。

拉曼分析、血清和血清MSCA-1⁺JPC文化(来自捐赠者# 1,# 2,# 3)都是评估在涂层(MesenCult-XF附件衬底)玻璃底菜(CELLview™细胞培养盘子从他一一Bio-One GmbH德国)。对于拉曼测量,使用JPCs不是固定的而是测量进行活细胞由细胞培养基。MSCA-1⁺JPC文化源自# 4是在其他三个捐助者用于基因表达分析(定量PCR)。

2.2。MSCA-1磁性细胞分离⁺细胞分数由苹果电脑

整个JPC人口进行了磁选以隔离MSCA-1⁺像之前描述的那样细胞分数(16]。总之,JPCs与货代阻塞试剂(400孵化µl)和anti-MSCA-1微(400µl, Miltenyi研究、Bergisch格拉德巴赫、德国)在4°C为20分钟。这种单克隆抗体与组织非特异性碱性磷酸酶反应(17]。洗后,样本用于preseparation过滤器,此后到女士列。的MSCA-1⁺细胞仍在磁场中的列。从磁场删除列后,MSCA-1⁺分数可以筛选了。

从血清血清媒体转换条件,MSCA-1^{+ / -}细胞分数进行了逐步减少和细胞培养在MesenCult-XF血清培养基(MC-XF,干细胞技术,法国格勒诺布尔)含有1%的谷氨酰胺和1%的杀菌剂和青霉素和链霉素,正如已经描述的其他地方(2]。拉曼光谱分析,MSCA-1⁺细胞分数下培养FCS-containing (DMEM)和动物任意培养条件(MC)。

2.3。成骨分化

的DMEM-cultured MSCA-1⁺细胞分数被播种密度的410⁴细胞和MC-cultured细胞分数被播种密度的610⁴细胞每CELLview与集成的玻璃培养皿底部(他一一Bio-One, Frickenhausen,德国)。拉曼分析,CELLview文化菜肴与MesenCult-XF附件预镀的基质细胞依从性更好。初步测试结果显示低细胞粘附有部分细胞分离没有预涂(图1)尤其是osteogenically诱导细胞。成骨分化,MSCA-1⁺细胞与成骨的分数被介质(ob DMEM / F12含有10% FCS 10毫米β甘油磷酸盐,100µM L-ascorbic酸2-phosphate, 4µ地塞米松,Sigma-Aldrich) 20天。

Xeno-free (MC)培养MSCA-1^{+ /- - - - - -}使用MesenCult细胞分数osteogenically诱导成骨的介质(ob),包含MesenCult MSC基础培养基,5%成骨的鼓舞人心的补充,和3.5毫米ß-glycerophosphate描述之前(2)为同一时期DMEM-cultured细胞。同时,无血清和血清培养条件,未经处理的和未分化的控制(co)同时讲究的。

2.4。拉曼显微镜和数据分析

如前所述,一个定制的拉曼显微分光镜是用于所有测量(18]。简单,系统是由商业荧光显微镜(IX71奥林巴斯、日本)。拉曼光谱被指导兴奋波长785纳米的激光光束(TOPTICA AG)、德国慕尼黑)通过一个100 x油浸物镜(NA 1.4,奥林巴斯)。系统校准基于硅达到522厘米⁻¹之前所有的测量。激光输出功率是光谱采集的85兆瓦。拉曼光谱收集从MSCA-1⁺JPCs与血清培养媒体(DMEM)或MSCA-1⁺JPCs培养的无血清条件下(MC) 5, 20天后成骨分化。所有细胞培养在镀膜玻璃底部细胞培养菜(他一一Bio-One GmbH,德国)。每个光谱总收购时间为100秒。背景光谱的玻璃盘包含细胞培养基是为每个数据集。所有获得的拉曼光谱background-subtracted使用特定的背景光谱然后baseline-corrected (rubber-band-method 64数据点)使用作品(美国力量光学、Billerica MA)。平滑算法(Savitzky-Golay二阶多项式7数据点)采用光谱。然后,多元PCA模型计算比较拉曼数据5和20天后分化为每个病人使用辨音器10.3(这种软件,奥斯陆,挪威)如前所述[10]。所有主要组件(pc)筛查磷灰石信号在961厘米⁻¹。在每个主成分分析,电脑载荷显示磷灰石信号识别和选择。得分值选择电脑绘制,描绘成三维散点图使用OriginPro 2015。

拉曼光谱进一步用来比较的矿物成分DMEM和MC-cultured条件下形成的。下面的光谱比率的计算拉曼光谱:羟磷灰石(HA)苯丙氨酸(961/1005厘米⁻¹),HA酰胺III(961/1244厘米⁻¹)和碳酸盐岩公顷(1070/961厘米⁻¹)。作为衡量HA结晶度,半宽度的倒数(应用)计算的光谱范围从900到1000厘米⁻¹使用MATLAB (MathWorks,纳蒂克,美国)。范围被隔离和消除趋势。磷灰石峰值然后安装使用标准高斯曲线。拟合曲线的基础上,应用的倒数(1 /应用计算哈达到961厘米⁻¹。

2.5。基因表达分析在DMEM -和MC-XF-Cultured JPCs定量PCR

RNA隔绝MSCA-1⁺JPCs (= 4每组)血清和无血清条件下培养进行了使用NucleoSpin RNA x工具包(Macherey-Nagel Duren,德国)后,制造商的指示。在光度学的RNA浓度测定(GeneQuant职业;通用电气医疗集团),15 ng的RNA合成互补使用QuantiTect全转录组工具包(试剂盒、Venlo、荷兰)后,制造商的指示。

信使rna转录水平量化使用实时LightCycler系统(罗氏诊断,曼海姆,德国)。PCR反应,商业入门套件(搜索LC、海德堡、德国)和DNA大师SYBR绿色1(罗氏)。35周期被用于目标mrna的放大。I型胶原蛋白的比例(α1,α2链)记录数据到相应的管家glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)基因水平计算,见图7。

2.6。统计分析

从每个捐赠者是平均拉曼光谱。光谱从每个捐赠者被用来计算拉曼光谱比率意味着。小动物——一张长有采用方差分析(美国拉霍亚棱镜,GraphPad软件)来识别统计差异的骨形成在DMEM和血清MC条件的所有捐助者(= 3,所有的测试)。

PCR评估数据,意味着±标准差表示,统计分析,双尾测试。一个值< 0.05被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。识别合适的玻璃底板块的拉曼测量的性能

JPCs被播种到预镀或未经治疗或成骨的条件下裸玻璃底菜。如图1偶尔,尤其是osteogenically诱导细胞单层膜分离在裸玻璃碗。因此,我们决定为所有外套碗碟拉曼测量对于分析培养条件(血清和无血清条件)。

3.2。拉曼光谱表明在MSCA-1成骨分化⁺JPCs

拉曼光谱从MSCA-1⁺JPCs 5天后分化显示高病人可变性和低信号噪声比,这使得很难分配山峰(补充图在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/1651376)。经过20天的分化,拉曼光谱的JPCs病人# 1显示典型的羟磷灰石振动模式在430 (v₂ ),961 (v₁ ),1045厘米⁻¹(v₃ 在MC的媒介。相反,当这些细胞在DMEM媒体分化,清晰的羟磷灰石的贡献没有观察到基于均值光谱(图2(一个))。拉曼光谱从病人# 2,所有被检测出振动模式的羟磷灰石,包括590厘米⁻¹(v₄ ),更高程度的指示矿物沉积相比MC-cultured JPCs从病人# 1。在DMEM-cultured JPCs从病人# 2,磷灰石的形成也被检测到。羟磷灰石的强度信号DMEM-cultured JPCs从患者# 2低光谱相比,从同一病人在MC条件下培养(图2 (b))。由于覆盖与v₃ 峰,碳酸盐振动v₁ 在1070厘米⁻¹检测作为光谱峰的肩膀从病人病人# 1和# 2两个媒体条件下。病人# 3拉曼光谱显示低信号强度,从而降低信号噪声比的条件比光谱从病人JPCs病人# 1和# 2。从这个病人在MC-cultured JPCs, v₁ 在961厘米⁻¹被检测到,而更加突出酰胺振动和CH变形的蛋白质检测光谱DMEM条件下(图2 (c))。

3.3。荧光检测矿化和多变量分析的拉曼光谱

成骨分化从MSCA-1评估⁺JPCs细胞分数后20天DMEM或MC媒体荧光染色的羟磷灰石(OsteoImage)。羟磷灰石MSCA-1没有检测到⁺JPCs从病人# 1在DMEM培养媒体(数字3(一个)和3 (b)从病人),而细胞# 2和# 3羟磷灰石形成的存款在DMEM培养条件(数据3 (d)和3 (g))。在MC媒体,MSCA-1⁺JPCs从所有病人形成羟磷灰石晶体(数字3 (b),3 (e),3 (h))。拉曼光谱分析异构数据集和可视化DMEM -矿化物种差异及MC-cultured JPCs, PCA采用光谱。PCA提取电脑评分值和加载谱描述数据集的光谱差异,证明单拉曼光谱的变化为每个细胞培养条件。方法可以识别不同的光谱由于矩阵成熟的不同阶段在DMEM和MC-cultured MSCA-1⁺JPCs。由于高捐赠者可变性,拉曼数据从DMEM -和MC-cultured MSCA-1⁺JPCs每个捐赠者的分析在一个单独的主成分分析模型。通过绘制PCA的PC, PC, PC 3,它被证实,拉曼光谱分化MC - DMEM-cultured MSCA-1⁺JPCs病人# 1可以被分离从无差别的文化。而更成熟的骨基质形成MC-conditions下,PCA成绩也表明早期(不成熟的)的矿化阶段DMEM-cultured JPCs后20天的区别(图3 (c))。载荷1 PC, PC 2, PC 3表现出很强的羟磷灰石(图峰值4(一)),这证实了PCA得分值反映不同程度的矿化。在MSCA-1⁺JPCs病人# 2,PCA分数差异MC - DMEM-cultured细胞分化(图20天后3 (f))。在这个主成分分析,拉曼信号从羟磷灰石主要反映在电脑1和PC 4载荷(图4 (b))。PCA的细胞来自患者# 2再次表明早期DMEM条件下(不成熟的)的分化阶段相比,MC条件(图3 (f))。在两个媒体条件下,从病人# 3分化细胞的拉曼光谱显示减少强度在羟磷灰石位置JPCs相比于其他病人。这一发现可能与分化MSCA1的事实⁺从病人JPCs # 3形成较小的羟磷灰石晶体(图3 (g))。PC, PC 2,和PC 3加载中羟磷灰石的强烈影响峰从病人# 3(图的数据4 (c))。JPCs DMEM和MC条件下分化为20天显示人口,这是稍微分开未分化的细胞;因此PCA表示下的矿化物种分化从JPCs光谱贡献DMEM和MC媒体。主成分分析表明,一些光谱MC-cultured JPCs病人# 3表现出强烈的矿化(图3 (f))。

3.4。骨质量的评估由体外分化MSCA-1⁺JPCs

拉曼峰值比率是用来比较MSCA1形成的矿化矩阵的质量⁺JPCs DMEM和MC条件下。通过分析拉曼光谱强度的比值羟磷灰石和苯丙氨酸(图5(一个)酰胺三峰(图)和羟磷灰石5 (b)),很明显,骨基质形成的JPCs展品显著降低矿物在DMEM条件下矩阵比率相比JPCs MC条件下分化。此外,发现矿物矩阵比的增加MC-cultured JPCs当比较文化从第五天,20天()。DMEM-cultured JPCs没有显著改变在矿物矩阵比文化时间(数字5(一个)和5 (b))。相比之下,碳酸盐磷酸比率明显高于在细胞在DMEM媒体条件下培养(图5 (c))。961厘米的逆的半最大值宽度⁻¹羟磷灰石峰值与晶粒大小或结晶度13,19]。DMEM-cultured JPCs细胞表现出更高的结晶度,从而形成更大的晶体与MC文化相比,表明一个更明显的羟磷灰石高峰DMEM-cultured JPCs(图5 (d))和一些不成熟的矿物成分的贡献如磷酸氢(20.]。

胶原蛋白网络,这是必要的磷灰石晶体形成的起始,进一步评估调查collagen-specific措施在整个数据集的拉曼光谱。酰胺我高峰,被描述为新成立的差异反映和成熟的胶原纤维19,21MSCA1),表明空泡形成⁺JPCs MC和DMEM条件下不同程度的成熟度(数字6(一)和6 (b))。脯氨酸羟脯氨酸比率显著降低在MC-cultured JPCs,加强无血清培养系统假设MC JPCs媒体支持通过成熟的矿化胶原蛋白。补充图代表的意思是拉曼光谱显示DMEM和MC-cultured JPCs从病人# 2,反映了胶原成熟检测差异有关。

3.5。I型胶原基因表达分析

基于I型胶原蛋白是骨的主要胶原成分,分析基因表达水平在无血清和血清培养JPCs条件。

正常化GAPDH的管家mRNA水平后,显著更高的水平α1链的I型胶原蛋白被发现在血清培养MSCA-1⁺JPCs相比,细胞培养的无血清条件下(未经处理的:110.4±44.8和29.7±26.4;osteogenically诱导(10 d): 219.2±81.7和96.5±25.8;,)。

更高的mRNA水平α2 I型胶原链中也检测到治疗DMEM-cultured JPCs相比无血清培养MSCA-1⁺JPCs (49.810³±1710³和22.110³±14.310³;,)。差异基因表达水平的科尔1 (α2)没有达到显著值osteogenically诱导JPCs但发现了类似的趋势(62.710³±24.510³和34.210³±4.310³)。

4所示。讨论

JPCs代表一个理想的细胞来源组织工程方法的治疗和再生口腔颌面骨的缺陷。为临床应用证明这些细胞,建立动物任意文化条件必须得到解决。以前,我们描述JPCs显示较高的扩散率和更高的表达osteoprogenitor标记MSCA-1扩张后血清培养条件下(2]。获得更深的见解骨生成的生化特性在无血清条件下,我们比较了在MSCA-1产生的细胞外基质矿物组成⁺通过拉曼光谱分析JPCs独立媒体的条件。

分析骨质量和骨形成,体外拉曼显微镜已被描述为是一个强大的技术(13]。使用拉曼显微镜,表明骨改变的生化成分在绝经后骨质疏松症和成骨不全症等病理状态(19,21- - - - - -24]。此外,相关的生物力学属性喇曼光谱信息显示(25,26]。之前,埃文斯和他的同事利用拉曼显微镜比较骨结节的生化成分形成的胚胎干细胞,间充质干细胞、成骨细胞(27]。我们所知,这是第一个研究比较细胞矿化标准和媒体无血清条件下采用拉曼显微镜。在我们的研究中,在拉曼光谱信号碳酸磷灰石和信号不同捐赠者的细胞之间变化强烈。这些个人间的生化特征的矿化物种可能反映了矩阵的成熟程度。洪等人发现,羟磷灰石的拉曼信号增加而逐步分化的间充质细胞向骨,可以确定羟磷灰石,octacalcium磷酸盐、磷酸和ß-tricalcium拉曼信号从矿化物种在不同的阶段14]。在我们的数据中,羟磷灰石的不同信号强度后20天的区别可能反映供体特异性矿物沉积动力学。磷酸和胶原蛋白峰的强度是高度依赖极化效应(28,29日]。因此不同媒体条件下可能导致不同的矿物晶体的取向和胶原纤维。极化效应没有调查,由于体外形成的磷灰石晶体的取向是将两种条件下可比。

主成分分析是广泛用于拉曼光谱的分析。PCA的使用简化了高度复杂的生物拉曼光谱的解释,解决个人生化成分(30.]。Kunstar等人表明,PC得分值可以用于分离光谱从光谱邻股骨软骨内骨软骨组织(31日]。在他们的方法中,最突出的磷酸乐队在~ 961厘米⁻¹在PC载荷谱中被确定为骨组织的一项指标。以类似的方式,我们的电脑磷酸载荷显示明显的信号。PCA得分值这些电脑被用来分离光谱从JPCs分化DMEM条件下无血清条件下的分化。除了MC-cultured JPCs从病人# 3,光谱形成明确的种群内的分数情节,显示一个相对较低的一个细胞培养皿内光谱信号的变化。分数情节描绘一个渐进变化的光谱第五天到20天媒体条件和建议更不成熟程度的矿化JPCs血清条件下培养。

如很多人所述19,32),我们评估矿产矩阵比率,碳酸盐磷酸比率,和矿物结晶度基于拉曼数据比较矿化文化在血清和血清培养条件下后20天。符合我们的PCA分析光谱,结果矿物矩阵比率serum-cultured MSCA-1⁺JPCs显示相似的价值观分化5和20天之后,表明nonmineralized(胶原蛋白和蛋白质)而非矿化矩阵组件(磷酸盐)沉积serum-treated JPCs。然而,我们以前以及其他组织的研究表明,细胞采集矿物在更高程度上血清条件下比在无血清培养条件下(2,33]。相比之下,在最近的研究中,拉曼光谱,PCA,矿物矩阵比率显示出更成熟的骨形成在无血清细胞培养。这些结果可以解释为我们PCR(图数据7)此前公布的数据,未分离的无血清培养JPCs表达水平显著下降的I型胶原蛋白相比,标准的文化JPCs [2]。虽然碳酸v峰值部分重叠₃ 在1045厘米⁻¹在我们的拉曼数据,发现碳酸盐磷酸比率明显高于血清培养条件下,表明更多的碳酸盐岩被羟磷灰石晶格。最近的一次工作检查骨组织构成和粘弹特性在人类骨小梁(老化34),表明成矿随年龄和碳酸盐替换增加(34]。考虑到这方面的知识,提高碳酸盐岩磷酸盐比和较低的矿物矩阵比,检测血清分化的条件下,可以指示性骨质量差。相比之下,麦克马纳斯和合作者采用拉曼光谱比较骨肉瘤细胞的成骨分化主要造骨细胞(35]。他们发现明显高于碳酸磷酸比率和更低的矿物在骨肉瘤细胞矩阵比率,这可能形成有缺陷的骨骼结构相比,主要的成骨细胞。Roschger矿物和合作者报道一个线性相关性矩阵比测量拉曼光谱和人类健康osteonal骨钙含量(36]。然而,我们处理一个人工体外细胞培养模型很可能不准确可比osteonal骨头。

提出了矿物结晶度与晶体的大小和与碳酸盐磷酸盐比(19,32]。在我们的研究中,矿化在无血清条件下表现出较低的碳酸盐和较小的羟磷灰石晶体磷酸水平。较大的矿物晶体表明更高的矿化能力被发现在血清成骨分化。牛血清含有很多活性成分,加速描述自由磷酸盐和钙的结晶37]。在这方面,它是不足为奇的碳酸盐血清培养条件下磷比率较低。我们的研究,我们可以得出这样的结论:无血清培养MSCA-1⁺JPCs形式异构磷灰石晶体导致更广泛的生成的羟磷灰石峰从成熟的晶体结构32]。类似的现象被描述为成骨不全症(19),显示出更小但更丰富的矿物晶体和说明这些结构性变化可能导致更高的组织矿物质密度较低的杨氏模量(19]。在未来的研究中,我们的目标是探讨血清的影响在媒体体外形成骨的弹性模量和硬度,将这些数据关联到拉曼措施。生物力学特征的骨骼组织主要是由胶原纤维的取向和结构(38]。作为显示在这项研究中,胶原蛋白表达在无血清培养JPCs标准不同的文化。一个可能的解释可能是,显著降低胶原蛋白表达无血清培养JPCs相关矿物矩阵比率高,结晶度低,之前见成骨不全症(19]。这些结构性胶原纤维的变化可能会影响结晶的磷酸胶原原纤维和可能是一个引发矿化进行有效的控制和引导。

之前,它已经表明,基体刚度可能会影响细胞分化[39]。在我们的研究中,JPC粘附在玻璃底菜不是最优,由于这种观察,预涂板的表现(图1)。然而,MSCA-1⁺JPCs捐赠# 1没有存款血清条件下羟磷灰石涂层玻璃盘子,而相同的细胞能够采集矿物在6-well板块没有预涂。细胞矿化在不同程度上从不同的病人。对于媒体条件下,从病人的细胞# 3拉曼光谱表现出更低的信号噪声比。特定的矩阵特征可能会影响光谱特性。这个假设需要在将来的研究中得到证实,一些文化盘子从一个病人应该调查。我们的研究强调了拉曼光谱分析的能力矩阵形成和比较矿物组成不同的文化条件。单点拉曼测量是执行在这个研究并不代表矿化的内容在整个细胞培养皿,发生,而在本地。自动扫描区域内定义的更大的单层细胞可以提供拉曼图片,这可能更代表矿化内容的量化(40]。

最佳基质为拉曼测量由石英玻璃或氟化钙和产生的背景信号相比,拉曼测量标准的玻璃。另一方面,由于其吸湿特性,氟化钙在水中不稳定,因此可能不适合分化实验至少需要20天的细胞培养/分化。拉曼兼容CaF₂幻灯片是更适合石蜡包埋部分或短细胞培养和/或固定。在未来的研究中,我们将基于测试石英的适用性和附件基质菜2 d JPC分化和成像。将来我们可以规避这些问题通过监测3 d TE的结构,在细胞生长在3 d结构,而不是玻璃下表面。

总之,我们发现显著差异在矿化的生化组成物种MSCA-1形成的⁺JPCs在血清和血清培养条件。更成熟的骨基质形成下无血清培养可能拥有更少的弹性胶原蛋白表达减少。光谱包含强大的数据,它可以支持建立成骨分化的协议和文化媒体无血清条件的适应。矿化组织的生化特性可以提供结构和功能的信息,这可能有助于分类和辨别劣质骨组织的形成。此外,拉曼显微镜适用于比较体外开发工程组织与真正的自然组织在全球molecular-sensitive方式。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

补充材料