文摘

客观的。人类脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)可能包括neuron-like细胞分化为各种类型的细胞。天然多酚白藜芦醇好处很多疾病患者包括缺血性脑损伤。我们假设白藜芦醇hUC-MSCs成neuron-like细胞的诱导分化。方法。流式细胞仪是用于确定hUC-MSCs的表面抗原在不同阶段(P2、P5和P10)。巢蛋白特异性神经元烯醇酶(研究)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)检测到免疫细胞化学、免疫印迹,实时RT-PCT。的培养hUC-MSCs服用白藜芦醇在不同浓度(0,7.5,15.0,和30.0 mg / L)。巢蛋白、GFAP和了无蛋白质和mRNA的后处理时间点测量2 h, 4 h, 6 h, 12 h, 24小时。结果。Neuron-like细胞被发现在hUC-MSCs白藜芦醇治疗浓度的15.0和30.0 mg / L,但不是在hUC-MSCs处理车辆和7.5 mg / L白藜芦醇。此外,采用免疫染色表明,巢蛋白和了无免疫反应性是积极的在resveratrol-treated hUC-MSCs浓度的15.0和30.0 mg / L。白藜芦醇治疗显著增加巢蛋白和了无蛋白质和mRNA水平4 h后治疗。然而,白藜芦醇治疗并没有改变GFAP免疫反应性和蛋白质,在培养hUC-MSCs mRNA表达水平。结论。综上所述,白藜芦醇治疗诱发hUC-MSCs成neuron-like细胞的分化相对较高的浓度。

1。介绍

间充质干细胞(msc),来源于中胚层在早期开发中,多能干细胞,有多行年龄分化的特性1,2]。这些msc能够分化为骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、神经细胞、上皮细胞(1,2]。msc可以发现在许多组织包括皮肤、脂肪、肌肉、胎盘、羊水、脐静脉内皮细胞层下,肝脏和血液(3]。虽然在骨髓msc是丰富,实际获得msc是胎儿脐血来源4]。最近的研究表明,人类脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)有很多优势包括优秀的潜在的分化,免疫原性低、方便的转染,来源丰富,和更少的创伤,没有道德约束,和相对简单的可访问性,当他们从其他来源与msc。因此,hUC-MSCs有很大的临床应用潜力。

最常用的方法诱导msc分化为neuron-like细胞包括(1)抗氧化制剂如巯基乙醇、二甲亚砜(DMSO)和β羟基酸(BHA);(2)亲神经的因素如维甲酸(RA),神经生长因子(神经生长因子)、表皮生长因子(EGF)、碱性纤维母细胞生长因子(bFGF),大脑(BDNF)派生的亲神经的因素;(3)中药及其有效成分如黄芪苷、小檗碱,tanshinone、枸杞多糖、刺五加;(4)文化方法;(5)基因转染:转染等特定基因的‘诺金’(5),切口hUC-MSCs neuron-like细胞。然而,这些分化方法的低效率。

白藜芦醇(3、5、4′三羟的对称二苯代乙烯)是一种从葡萄中提取的多酚类物质,,益脑脉制剂精液桂皮或花生。临床已用于治疗心血管疾病,减缓癌症的过程中,减少缺血性脑损伤,提高抗生素的作用,起到雌激素作用[6- - - - - -9]。此外,白藜芦醇调节免疫反应,减少过敏反应,延迟衰老过程和消除黄褐斑(10,11]。此外,白藜芦醇具有相对强劲的抗氧化效果通过清除自由基12]。白藜芦醇可以增加神经保护作用[13]。先前的研究的基础上,我们测试我们的假设,白藜芦醇hUC-MSCs成neuron-like细胞的诱导分化。在这项研究中,我们还确定优化浓度的白藜芦醇诱导分化hUC-MSCs成neuron-like细胞。

2。材料和方法

2.1。材料

白藜芦醇(纯度:99.2%)是购自南京Zelang药业有限公司有限公司(中国南京)。杜尔贝科修改鹰的介质(L-DMEM) / F-12和胎牛血清(的边后卫)从Gibco购买(美国纽约大岛屿)和胰蛋白酶是来自Amresco LLC(梭伦,哦,美国)。异硫氰酸荧光素(FITC) -CD19 FITC-CD34,藻红蛋白——(PE) CD11b PE-CD73, PE-CD90, PE-CD45, PE-CD105,胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)获得BD生物科学(美国新泽西富兰克林湖)。巢蛋白和特异性神经元烯醇酶(了无)从细胞信号技术有限公司购买(丹弗斯、马、美国)。Anti-rabbit免疫球蛋白G(免疫球蛋白)(1:2000)是购买的亲和力生物科学(美国辛辛那提,哦)。PS免疫组织化学设备购买从北京中山金桥生物技术有限公司(中国,北京)。聚合酶连锁反应(PCR)明星混合购买从北京GenStar Biosolutions有限公司(中国,北京);得到EasyScript合成第一链cDNA supermix TransGen生物科技有限公司有限公司(中国,北京)。

2.2。隔离和hUC-MSCs文化

脐带是彻底冲洗D-Hank的介质,然后存储在H-DMEM / F-12培养基在无菌条件下在4°C。血管包括动脉和静脉被移除。脐带间充质组织切成小块的大小是1毫米和消化利用0.2%胶原酶II。获得的主要细胞,消化组织在解决方案将被放置在一个培养瓶含有2.0 ng / ml EGF, 20%的边后卫,L-Glu 25.0毫米和100.0 U /毫升penicillin-streptomycin混合物在37°C公司为5%₂和饱和湿度。培养基是每24小时,然后half-changed补充每3天。80 - 90%融合实现时,细胞然后冲洗两次磷酸盐(PBS)含有胰蛋白酶(0.25%)和EDTA (0.2 g / l)为使进一步消化成单细胞的比率1:3。的培养基H-DMEM / F-12包含100 U /毫升penicillin-streptomycin混合物和10%的边后卫(14]。

2.3。hUC-MSCs分析细胞表型

hUC-MSCs对数期的增长,采用胰蛋白酶消化hUC-MCCs单个细胞,并暂停整除的试管中细胞/管。鼠标反人类单克隆抗体CD11-PE、CD105-PE CD73-PE, CD45-PE, CD90-PE, CD19-FITC,人类白细胞抗原(HLA) DR-PE,和CD34-FITC(每5μl),分别添加到8管。Anti-mouse IgG1-FITC和Anti-mouse IgG1-PE(每7μl)被应用于其他2管同形像控制。这些管子被混合和孵化为30分钟4°C。孤立的细胞用流式细胞仪进行分析。

2.4。hUC-MSCs成Neuron-Like细胞的分化

在P5阶段,hUC-MSCs传入six-well盘子和25厘米²细胞培养瓶的完全培养基。一个six-well板和三个25厘米²培养瓶随机选择到一个组当中。四组hUC-MSCs服用白藜芦醇含量的0.0,7.5,15.0,和30.0 mg / L L-DMEM培养基。GFAP的表达巢蛋白,分析了无被免疫组织化学染色法检测4 h治疗。巢蛋白mRNA和蛋白GFAP的表达,并分析了无rt - pcr和免疫印迹测定2 h, 4 h, 6 h, 12 h, 24小时后归纳。

2.5。分化细胞的鉴定

巢蛋白,分析了无,GFAP 4小时孵化后被免疫细胞化学检测和分析。简单来讲,培养细胞与PBS轻轻冲洗一次然后用4%多聚甲醛固定在室温20分钟。与PBS冲洗三次后,这些细胞被沉浸在PBS 0.5% Triton x - 100 15分钟后跟孵化H为3%₂O₂在室温下为5分钟。细胞与正常山羊血清阻断剂被封锁了15分钟,然后与初级抗体分析了无孵化,GFAP、巢蛋白在一夜之间在4°C。适当的生物素化的二次抗体被申请了15分钟,然后用辣根peroxidase-conjugated孵化链霉亲和素为1分钟。最后,这些细胞被染色和刚做好的民建联1分钟,用苏木精复染色。

2.6。免疫印迹分析

细胞溶解产物获得通过使用缓冲区里帕和phenylmethylsulfonyl氟化物(北京Solarbio科技有限公司)。蛋白质浓度是由一个超微量紫外可见光计量化(基因有限公司)。每个样本的16µg蛋白是加载和sds - page凝胶电泳在10%,这是转移到膜聚偏二氟乙烯(PVDF)(北京Solarbio科技有限公司)。与10%脱脂牛奶被屏蔽后2小时,孵化了PVDF膜主要抗体GFAP、巢蛋白,分析了无一夜之间在4°C。第二天,孵化了膜anti-rabbit免疫球蛋白g (1: 2000;亲和力生物科学)。图像被西方SuperSignal可视化Pico化学发光底物(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)和被使用图像AlphaEaseFC系统(αInnotech有限公司,圣莱安德罗、钙、美国)。

2.7。rt - pcr

总信使rna被TriPure提取试剂(Aidlab生物技术有限公司,北京,中国)和超微量紫外可见光计量化(基因有限公司、香港、中国)。总mRNA首次反向转录而cDNA利用EasyScript合成第一链cDNA supermix (TransGen生物技术有限公司)。然后下面的协议用于半定量PCR: 1 94°C的周期3分钟;30 94°C的周期为30秒,30秒和72°C;在72°C和最后一个扩展10分钟。PCR产物由电泳分离,和感兴趣的基因被GAPDH转录规范化。引物设计的引物5.0以下:巢蛋白转发:TCCAGAAACTCAAGCACCACT相反:TCCACCGTATCTTCCCACCT 342个基点;了无转发:GGCACTCTACCAGGACTTTG逆转:GCGATGACTCACCATAACCC 286个基点;GFAP转发:GTCCATGTGGAGCTTGAC逆转:CATTGAGCAGGTCCTGGTAC 406个基点;GAPDH转发:AGAAGGCTGGGGCTCATTTG逆转:AGGGGCCATCCACAGTCTTC 258个基点。

2.8。统计分析

所有的数据都表示为±SEM。统计分析是由SPSS 21.0。单向方差分析进行三个或更多组比较随后Student-Newman-Keuls方法(以及团体之间。如果数据分布不符合正常或方差的同质性,非参数秩和检验(知道测试)执行。被认为是显著性差异。

3所示。结果

3.1。白藜芦醇诱导hUC-MSCs成Neuron-Like细胞的形态学变化

主要培养细胞的比率是通过1:1的比率和hUC-MSCs通道1:3或1:2。在不断流逝,hUC-MSCs仍有较强的增殖能力。没有显著改变hUC-MSCs白藜芦醇处理为7.5 mg / L与控制条件。白藜芦醇(15.0 mg / L)治疗6 h hUC-MSCs的形状从圆形椭圆形或quasi-circular双极细胞。neuron-like细胞的比率大约是5%(图1)。然而,由于白藜芦醇(30.0 mg / L)治疗hUC-MSCs 1 h, neuron-like细胞的比例达到了50%。多级细胞的数量明显高于hUC-MSCs白藜芦醇处理的数字为15.0 mg / L。此外,细胞出现连接成一个呈网状模式(图1)。6 h与白藜芦醇治疗后(30毫克/升),85% ~ 90%的hUC-MSCs neuron-like形状(图显示1)。然而,neuron-like细胞的比率降低到70%和80%后24 h与白藜芦醇治疗。

3.2。细胞表面标记

我们分析了表面抗原在P2的阶段,P5, P10 hUC-MSCs流式细胞术。CD105、CD73 CD90阶段的表达在hUC-MSCs P2, P5, P10。P7阶段,P8显示增殖与P2的P5能力降低。因此,我们选择使用P5代表早期通道测试白藜芦醇在细胞表面标志物的影响。此外,没有明显的形态学变化阶段的观察hUC-MSCs P8 P5。CD11b、CD45、CD34、CD19和HLA-DR负在hUC-MSCs阶段的P2, P5, P10(图2)。

3.3。白藜芦醇诱导免疫反应性的巢蛋白,分析了无和GFAP

巢蛋白和了无专门表达在神经元和神经元标记作为公认的;我们确定巢蛋白的白藜芦醇对免疫反应性的影响和培养hUC-MSCs了无。hUC-MSCs是应用巢蛋白抗体和了无。棕色细胞体和紫色核巢蛋白-或NSE-positive细胞(图3)。巢蛋白或NSE-positive免疫反应性被发现在hUC-MSCs白藜芦醇处理浓度的15.0和30毫克/升。以确定白藜芦醇区分hUC-MSCs成神经胶质,GFAP免疫反应性也决定了使用GFAP抗体。GFAP免疫反应性在hUC-MSCs消极对待车辆和白藜芦醇浓度(图3)。白藜芦醇治疗浓度的巢蛋白和NSE-positive细胞数量增加15.0和30.0 mg / L与vehicle-treated细胞()。然而,7.5 mg / L白藜芦醇治疗并没有改变巢蛋白和NSE-positive细胞数()。

3.4。白藜芦醇的mRNA和蛋白水平增加巢蛋白和了无

然后我们GFAP的mRNA水平衡量,巢蛋白,分析了无vehicle-treated和resveratrol-treated培养hUC-MSCs。GFAP、巢蛋白,分析了无mRNA水平衡量rt - pcr和白藜芦醇治疗前后2 h(30毫克/升),4 h, 6 h, 12 h, 24小时。GFAP mRNA hUC-MSCs中没有检测到车辆和白藜芦醇处理浓度。巢蛋白mRNA水平逐渐增加,达到峰值后4 h白藜芦醇治疗。此外,分析了无mRNA水平也增加,达到峰值hUC-MSCs治疗时6 h(图4)。

坚持这些变化的巢蛋白或了无mRNA水平与白藜芦醇对治疗的反应,巢蛋白的蛋白质含量或了无白藜芦醇治疗反应有类似的变化。白藜芦醇治疗巢蛋白的蛋白质含量增加,达到峰值后4 h白藜芦醇治疗。同时,白藜芦醇治疗增加了无蛋白质水平,达到一个峰值后6 h白藜芦醇治疗(图4)。

4所示。讨论

骨髓间充质neuron-like许多代理商诱导分化的细胞通过不同的机制。例如,β巯基乙醇诱导msc分化成neuron-like细胞通过调节营浓度增加蛋白激酶A (PKA)活动(15]。已经直接表明EGF诱导msc分化和促进有丝分裂维持突触的生长和存活16]。刺五加抑制p65贩卖从细胞质到细胞核的我差别抑制对这些κBα。另外,刺五加抑制NF -κB来缓解梗阻促进分化的干细胞分化(17,18]。陈等人。19)表明,基因的激活GAP-43重要的是调节分化通过影响突触的增长和扩展,受伤的神经开始修复。吴et al。20.)已经证实,microrna - 128诱导分化的bmsc neuron-like细胞当Wnt3a基因表达下调。

白藜芦醇对许多anticardiovascular疾病等药理作用,抗肿瘤,抗炎,neuron-protection,延缓衰老的抗氧化作用。之前的研究表明,白藜芦醇影响proangiogenic相关因子的表达水平在缺血再灌注脑组织的复苏阶段和施加积极影响缺血性脑组织的血流动力学和血管再生(21]。此外,白藜芦醇抑制氧化应激通过SIRT1激活(22- - - - - -24]。它已经表明,白藜芦醇可能减少MMP-2的表达水平通过抑制NF -的活动κB和随后减少入侵神经胶质瘤(25,26]。此外,白藜芦醇可以减少巨噬细胞和中性粒细胞的数量,抑制H-thymidine,诱导肿瘤细胞分化成nonpropagative表型细胞。这些研究表明,白藜芦醇抑制肿瘤的发展27]。在不同剂量白藜芦醇可以减轻损伤的大鼠大脑皮层神经干细胞,它是由氧葡萄糖剥夺/复氧(OGD / R)在体外不同程度。此外,白藜芦醇可以促进大脑皮层神经干细胞的增殖28]。

这是第一个研究表明,白藜芦醇治疗hUC-MSCs成neuron-like细胞的诱导分化。在这项研究中,我们观察到的细胞标记CD 105, CD73, CD90而不是其他细胞和分子特征为细胞衰老。这些标记没有任何变化的应对白藜芦醇治疗与汽车相比。然而,我们不能排除其他的可能性细胞和分子特征改变对白藜芦醇治疗。是非常重要的考虑如果hUC-MSCs P5阶段表现出一些未来研究衰老的迹象。在这项研究中,我们检测到相应的神经标记巢蛋白,观察了无related-positive免疫组织化学染色和信使rna和蛋白质的表达水平。负hUC-MSCs GFAP的表达表明,白藜芦醇hUC-MSCs没有诱导分化为神经胶质细胞。我们也确定了最佳的治疗时间和浓度的白藜芦醇诱导hUC-MSCs区分成neuron-like细胞。我们发现,白藜芦醇治疗显著增加神经元标记的mRNA和蛋白表达水平巢蛋白和了无。此外,巢蛋白mRNA和蛋白表达水平达到高峰值与白藜芦醇治疗后4 h,而了无mRNA和蛋白表达水平达到高峰值与白藜芦醇治疗后6 h。 In addition, we found that the expression of GFAP was negative in both resveratrol-treated and vehicle-treated hUC-MSCs, indicating that resveratrol treatment did not induce hUC-MSCs differentiation into glia cells. Although previous studies have shown that hUC-MSCs induce themselves to express their associated neural markers partially [29日),我们发现神经标记巢蛋白的表达水平很低,分析了无vehicle-treated低resveratrol-treated hUC-MSCs在我们的准备。

在这项研究中,我们发现一个合适的浓度的白藜芦醇(30毫克/升)诱导hUC-MSCs分化成neuron-like细胞。尽管Epac1白藜芦醇激活信号通路包括营地和激活AMPK SIRT1间接广泛接受,白藜芦醇的有益作用是通过直接激活SIRT1 [30.- - - - - -32]。目前还不清楚哪些信号通路参与白藜芦醇hUC-MSCs成neuron-like细胞的诱导分化。因此,进一步的研究是必要的,以确定这些机制。

总之,我们的研究结果表明,白藜芦醇能有效诱导hUC-MSCs分化成neuron-like细胞在特定浓度。这项新奇的发现提供了详细信息白藜芦醇诱导hUC-MSCs分化成neuron-like细胞。这些信息可以帮助开发干细胞implantation-based治疗缺血性神经元损伤。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

李郭,梁王,王李co-first作者。