软组织修复Easy-Accessible自体新生儿胎盘和脐带血液严重畸形:主要评估gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

器官发生中断会导致永久性畸形,可能需要手术矫正。自体组织移植在严重缺乏原位组织可能需要,但包括施主能级发病率。出生后胎盘通常被丢弃,治疗的潜力。本研究的目的是确定从胎盘羊膜或等离子体丰富的生长因子(PRGF)和单核细胞(跨国公司)从脐带血(UCB),收集动物,可以用作自体移植作为bio-constructs easy-accessible没有细胞culture-required方法。人类羊膜和PRGF凝胶分离和保存在文化长达21天有或没有小肠粘膜下层(SIS)。细胞结构显示一个健壮的表型不诱导细胞增殖的增加(Ki67)或细胞凋亡(半胱天冬酶3),但构造显示减少的完整性amnion-epithelial层的文化。Amnion-residing SIS结构表示CD73或pan-cytokeratin,细胞和细胞PRGF-SIS构造CD45和CD34的表达。这项研究表明,羊膜和联合是自体移植的潜在来源生产为先天性软组织缺陷的修正。构造可以在出生后立即以最小的处理或细胞扩张需要。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

器官形成发生在胚胎早期发育,破坏正常的器官发生导致永久性的先天畸形(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。这些畸形影响多达3%的婴儿(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba),是新生儿死亡的主要原因之一(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。先天畸形也与发病率和相关负责儿科住院的重要组成部分和成本(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。纠正先天性软组织如脊髓脊膜突出(MMC),巨型脐膨出,腹裂、先天性膈疝(CDH)包括手术校正出生后短。影响新生儿没有多余的组织捐赠组织的依赖。由于世界性的围产期器官捐献者短缺(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba有时使用[],假体材料gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba),这可能与复发等并发症,贪污变位和/或拒绝,腐败的侵蚀,和感染(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。生物移植材料将是更可取的,由人类或动物组织的细胞外室。他们也与复发的风险,但相关组织重塑的优势,新血管形成和低利率的感染(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)和优势在高风险污染地区的情况,如先天性高风险腹壁缺陷(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

组织工程的进展(TE)为传统的另一种替代方法使用假体材料(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。最常见的方法是生物矩阵和细胞的结合。填充矩阵与细胞移植集成和提高宿主组织的修复,减少疤痕形成和细菌感染gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。猪小肠粘膜下层(SIS)由无细胞细胞外基质(ECM)(主要是胶原蛋白),一个含有生长因子和支持血管生成可吸收的生物材料,常用于外科软组织缺陷的修正(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

自体移植被认为是金标准,但他们通常包括捐赠站点发病率,身体的健康组织从一个站点来取代受伤或失踪组织(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba),限制取决于贪污面积大小。同种异体移植消除施主能级发病率在收件人(但可能诱发免疫反应gydF4y2Ba18gydF4y2Ba与后续坏死[],拒绝gydF4y2Ba19gydF4y2Ba],同种异体移植物清除或更换。gydF4y2Ba

胎盘是一个fetomaternal的器官组成的三层:外母体蜕膜,胎儿蛋壳膜和内胎儿羊膜膜周围的胎儿,羊水。人类胎盘自1500年代以来一直用于医学治疗,例如,小腿溃疡,伤口,而在皮肤移植gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。羊膜包含多功能细胞,上皮和间充质层,还具有抗炎和再生能力antifibrotic,抗菌,免疫抑制和血管生成属性(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。脐带血造血干细胞(UCB)包含和被用于移植治疗恶性肿瘤和其他严重的疾病超过30年gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。从联合,等离子体丰富生长因子(PRGF)可以被孤立的gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba]。两个实验和临床研究表明,PRGF在临床上安全、促进血管化,组织再生和伤口愈合gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

与施主能级发病率克服问题,同种异体的免疫反应,生产时间长,我们假设自体proangiogenic结构可能产生的衍生品项胎盘;羊膜和PRGF凝胶单核细胞(跨国公司)的联合。都是无创源的自体组织工程容易出生后没有使用的伦理道德方面的障碍。gydF4y2Ba

本研究的目的是分析羊膜和MNC-enriched PRGF凝胶对组织和细胞的完整性,形态和生存能力。此外,羊膜和PRGF凝胶结合SIS为了提高机械强度和建立一个持久的贪污。的组织和细胞完整性羊膜和PRGF-SIS构造如上分析,但另外细胞形态学和蛋白表达的变化。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。隔离的羊膜gydF4y2Ba

人类胎盘(gydF4y2Ba )得到通知后从健康的捐赠者选择性剖腹产后口头和书面同意根据民族地区伦理审查委员会的批准在斯德哥尔摩医嘱2012/480-31/1),符合《赫尔辛基宣言》。胎盘是放置在一个无菌环境与绳方运到实验室。羊膜是机械去皮从蛋壳膜从绳。羊膜部分转移到培养皿,洗了三次磷酸缓冲盐(PBS)(生活技术,佩斯利,英国)被进一步处理之前如下所述。gydF4y2Ba

2.2。比较羊膜的培养条件gydF4y2Ba

评估文化条件下,三种不同的培养基相比最初关于amnion-residing细胞形态、生存能力和扩散。文化媒体相比(1)间充质基质细胞培养基:鹰中α(MEM修改gydF4y2BaαgydF4y2Ba)(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)补充10%灭活胎牛血清(FCS) (PAA实验室GmbH,派斯克,奥地利);(2)上皮细胞培养基(DMEM-EC):杜尔贝科的修改鹰中葡萄糖(表达载体)补充10% FCS (PAA实验室),2毫米谷酰胺(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),不必要的氨基酸(Sigma-Aldrich) 1%, 55gydF4y2BaμgydF4y2BaM 2-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich), 1毫米丙酮酸钠(Sigma-Aldrich);和(3)内皮细胞培养基(DMEM-F12):杜尔贝科修改鹰介质/营养混合物F-12(表达载体)补充谷酰胺10% FCS实验室(PAA)和1% (Sigma-Aldrich)。所有文化媒体补充1% antibiotic-antimycotic解决方案(Anti-Anti,生活技术)。约3×2厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba块羊膜是孤立和放置在12-well细胞培养板(Becton & Dickinson,富兰克林湖,新泽西,美国)同样分为不同的文化条件。羊膜片都维持在37°C在湿润环境中含有5%的股份有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba每3 - 4天,媒体所取代。在天0、3、7、10、14和21,羊膜片洗两次在PBS和固定在4%多聚甲醛溶液(PFA) (Solveco AB, Rosersberg,瑞典)3天。此后,羊膜片各时间点和文化条件石蜡包埋,切片,和苏木精染色(HTX) (Meyers HTX HistoLab产品AB,哥德堡,瑞典)和伊红形态(0.2%,HistoLabs产品AB), Ki67扩散,(1:500年,生命技术)和激活半胱天冬酶3细胞凋亡(1:200年,英杰公司)。染色形象化,生物素化的二次anti-mouse使用免疫球蛋白抗体(向量实验室公司。1:500年,伯林盖姆,CA,美国)。Avidin-Biotin复杂(向量实验室Inc .)补充道,随后轻拍(Dako、斯特鲁普、丹麦)。的部分与HTX复染色(HistoLab产品AB)。gydF4y2Ba

2.3。描述迁移Amnion-Derived细胞不同的文化条件gydF4y2Ba

描述amnion-derived细胞迁移(ADC)从组织和细胞培养表面,坚持与流式细胞术分析了ADC 21天。细胞被治疗0.05%胰蛋白酶和收获0.53毫米EDTA(表达载体)和resuspended PBS。ADC是孵化与共轭单克隆抗体对CD31 CD73(正),和PCK (Dako) 30分钟在黑暗中在4°C。抗体是共轭荧光素(FITC),藻红蛋白(PE),或青蓝3 (Cy3)。此后,这些细胞被洗和resuspended PBS。分析了细胞用流式细胞分析仪488海里激发和发射过滤器(FACSCalibur,正欲),和数据分析使用软件Flow-Jo (v . 10,树明星Inc .)、亚什兰,或者,美国)。gydF4y2Ba

2.4。描述与SIS Amnion-Residing细胞结构gydF4y2Ba

分析amnion-residing细胞构造的属性与SIS (amnion-SIS), 2×2厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba块羊膜是放置在干燥层SIS(生物设计®组织移植,库克生物科技股份有限公司,在美国),让坚持5分钟。增加接触,羊膜缝合到SIS矩阵(美国新泽西州缝线6 - 0,Ethicon Inc .)(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba),构造是保存在文化长达21天DMEM-EC媒介。天0、3、7、10、14和21 amnion-SIS块洗两次,转移到4% PFA (Solveco AB)固定,石蜡包埋,切片。部分是沾HTX /伊红(AB) HistoLab产品形态或pan-cytokeratin (PCK上皮1:500年,Dako), CD31 (endothel, 1: 500年,Dako)和CD73 (Abcam常见的基质标志,1:500年,剑桥,英国)表面抗原决定基的表情,和Ki67(1: 500年,生命技术)和激活半胱天冬酶3(1:200年,英杰公司)。彩色的部分没有SIS培养羊膜DMEM-EC作为控制。gydF4y2Ba

2.5。制备的富含凝胶浆富含生长因子gydF4y2Ba

术语UCB收集出生后,在交付的胎盘,通过刺穿脐静脉使用无菌收集系统(Macopharma MSC1206DU脐带血收集装备,图尔昆,法国)包含21毫升抗凝剂(柠檬酸磷酸葡萄糖溶液)。收集的联合是重力,直到停止流动。新鲜的方式(因为过低的细胞计数)的联合单位(gydF4y2Ba ,意思是总量109±15毫升)从瑞典国家脐带血银行获得卡罗林斯卡大学医院,瑞典,之后告知口头和书面同意根据民族地区伦理审查委员会的批准在斯德哥尔摩医嘱2012/480-31/1),符合《赫尔辛基宣言》。gydF4y2Ba

从PRGF产生凝胶,45毫升UCB离心机在500gydF4y2BaggydF4y2Ba在室温下10分钟。UCB分为红细胞底部的管,中间PRGF层,等离子体在生长因子(PPGF)可怜的顶层。10毫升PPGF层被丢弃,和其余PRGF,包括3 - 4毫米的红细胞分数最大化血小板恢复(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba),被转移到一个新管。丰富的PRGF高浓度的细胞,剩下的药和PBS稀释4倍和跨国公司通过密度梯度分离孤立(Lymphoprep,密度1.077克/毫升,Axis-Shield PoC,奥斯陆,挪威)。跨国公司统计在土耳其的解决方案(默克公司,达姆施塔特,德国)和resuspended 60×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞在PRGF /毫升。42gydF4y2BaμgydF4y2BaL 10%的CaClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba每毫升蒸馏水PRGF添加对凝胶的形成。gydF4y2Ba

2.6。描述与SIS PRGF-Residing细胞结构gydF4y2Ba

评估的耐久性产生凝胶的蛋白质表达和分析跨国公司PRGF, SIS(0.9厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)被放置在8-chamber幻灯片(默克密理博、软木、爱尔兰)和350年gydF4y2BaμgydF4y2BaL PRGF之上添加在室温和孵化30 - 45分钟直到凝胶形成(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。PRGF(1毫升)没有SIS是生产控制。凝胶块和PRGF-SIS构造被转移到12-well盘子(becton dickinson)和350gydF4y2BaμgydF4y2BaL RPMI 1640介质(技术)补充10%汇集人类AB血清灭活,100 U /毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升(HyClone实验室、南洛根,UT,美国),和20毫米谷酰胺(表达载体)添加/。天0、3、7、10、14,PRGF凝胶和收集PRGF-SIS构造,PFA在PBS洗,转移到4%之后3天,石蜡包埋,切片。上面的部分被染色和HTX /伊红形态、CD34、CD45(造血表面标记,1:100年,Dako)表面抗原决定基的表情,Ki67(1: 500年,生命技术),以及激活半胱天冬酶3(1:250年,英杰公司)。gydF4y2Ba

2.7。统计分析gydF4y2Ba

流式细胞术分析的数据进行了分析使用一个因素方差分析(方差分析)和成对的学生gydF4y2BatgydF4y2Ba以及,假设不平等的样本之间的差异。结果被认为是显著时gydF4y2Ba值< 0.05。gydF4y2Ba

3所示。结果gydF4y2Ba

3.1。隔离和羊膜的文化gydF4y2Ba

从胎盘羊膜可以很容易地分离和保存在文化的端点21天。评估不同的文化媒体,羊膜片在MEM培养gydF4y2BaαgydF4y2Ba、DMEM-EC DMEM-F12。羊膜片进行评估形态与HTX /伊红,表明,间充质细胞保持在文化形态在整个时间,但有一个减少上皮的完整性层的文化在所有条件(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。没有amnion-residing细胞的增殖和生存能力的差异在测试不同的培养基。统一Ki67的低表达在所有时间点检测到天21时没有发现(图表达gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。半胱天冬酶3的表达很低,但略有增加(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。ADC的MEMgydF4y2BaαgydF4y2Ba和DMEM-EC显示纤维母细胞形态而DMEM-F12既没有典型epithelial-like形态也不呈形态(图gydF4y2Ba3(一个)gydF4y2Ba)。ADC进一步研究了表面抗原决定基表达通过流式细胞术,和大多数的细胞从CD73表达的不同文化条件下的表达明显高于DMEM-EC相比其他细胞培养基(MEM DMEM-F12 66.7%gydF4y2BaαgydF4y2Ba87.8%,DMEM-EC 96.6%,gydF4y2Ba 和0.008,分别地)(图gydF4y2Ba3 (b)gydF4y2Ba)。没有表达CD31或PCK的ADC的培养条件(数据没有显示)。基于这些结果,DMEM-EC被选为剩下的实验。gydF4y2Ba

3.2。Amnion-SIS构造的性质gydF4y2Ba

调查amnion-residing细胞是否会迁移,融入SIS和分析蛋白表达,羊膜片结合SIS和保存在文化0-21天,此后染色蛋白表达。羊膜没有SIS作为控制。HTX /伊红染色显示没有形态的差异相比,羊膜片没有姐姐,也没有在SIS细胞被发现。细胞在上皮和间充质层CD73表示,和上皮细胞层PCK表示。有一个低Ki67的表达;不到3%的细胞在所有时间点。在第0天,一些细胞内间充质层内Ki67表示,在以后的时间点,未发现Ki67-positive间充质细胞。日0时,上皮细胞层中不含Ki67-positive细胞,但是Ki67的表达增加高峰在7天。在21天,没有Ki67-positive细胞中发现任何样品。总的来说,有一个低表达的细胞凋亡蛋白酶3间叶细胞和上皮细胞,但它略增加上皮细胞。 There was no CD31 expression at any time points (data not shown). There were no differences in protein expression between amnion-SIS and amnion without SIS (Figure4gydF4y2Ba和补充图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3.3。PRGF-SIS构造的性质gydF4y2Ba

PRGF凝胶有或没有姐姐可以保存在文化长达14天持续形态,但与细胞的数量减少和增加凝胶的降解。在第14天,凝胶完全溶解,只剩下SIS。因此,第14天被排除在进一步分析。没有蛋白质表达的差异如果PRGF凝胶结合SIS。CD45表达的细胞,少数可以在所有时间点检测cd34多细胞。细胞阳性Ki67,但随着时间的推移减少数量。半胱天冬酶3表达很低,但随着时间的推移增加(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和补充图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

4所示。讨论gydF4y2Ba

传统的自体生物原料收获TE包括至少一个入侵施主能级,导致至少两个站点的外科干预。绕过施主能级发病率,非侵入性技术,集合是可取的。在这项研究中,我们研究了两种高度proangiogenic自体结构由无创源项胎盘:(1)羊膜和(2)MNC-enriched PRGF凝胶联合。gydF4y2Ba

据我们所知,这是第一个研究新鲜羊膜和PRGF结合生物移植物。我们的结果表明,胎盘和UCB可以很容易地收集直接出生后,可以分开绒毛膜和羊膜是准备用在出生后不到一个小时。PRGF可以产生UCB检索后30分钟内,所以隔离跨国公司花了一小时以最小的(Lymphoprep和CaCl兼容的产品gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)和凝胶的形成发生在45分钟。总的来说,一个完整的MNC-enriched PRGF构造可以在出生后2 - 3小时内做好准备。此时,结构可用于手术纠正缺陷。gydF4y2Ba

我们想调查如果羊膜的属性维护后保存在文化。细胞培养条件培养基本身有选择性等不同的亚种的细胞,因此,我们比较三种不同培养基对羊膜在形态学方面(可视化HTX /伊红)和生存能力的细胞(细胞凋亡Ki67扩散和半胱天冬酶3)。HTX /伊红染色显示没有amnion-residing细胞形态学差异尽管不同的文化媒体,并没有明显的细胞生存能力差异在任何时间点。当羊膜表面直接接触文化,从羊膜细胞(ADC)迁移,成倍增加。在DMEM-F12培养,ADC nonfibroblast, nonepithelial形态而在MEM培养gydF4y2BaαgydF4y2Ba和ADC DMEM-EC呈表型。我们接下来研究ADC流仪分析表面标记表达式。我们选择建立上皮标记(PCK)间充质(CD73)和内皮细胞(CD31)。所有ADC CD73表达,但没有PCK或CD31表达检测,表明间充质,而不是从羊膜上皮或内皮细胞迁移。ADC培养在DMEM-EC CD73-expressing比例最高的细胞,成纤维细胞的形态和无差异蛋白表达之间的amnion-residing细胞培养基,和DMEM-EC用于即将到来的分析。gydF4y2Ba

羊膜和MNC-enriched PRGF凝胶之后加上一个矩阵和分析。传统商用生物移植通常由脱细胞基质蛋白质,主要是胶原蛋白,皮肤等从不同组织来源(人类、牛和猪)和心包(马和牛)(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。其中最常用的移植是SIS(猪)gydF4y2Ba36gydF4y2Ba),因为它是目前应用于临床,研究,non-cross-linked,具有良好的机械强度,我们决定使用层SIS在这项研究中。我们想调查amnion-residing细胞的属性是否随时间变化时加上姐姐,因此,我们保留了结构在文化分析前21天。我们彩色PCK的构造,CD73 CD31, Ki67,半胱天冬酶3。经过21天的文化、羊膜仍高度可行的低凋亡的环境的一些半胱天冬酶3-positive细胞,激活的细胞增殖,表明Ki67-positive细胞。同时,细胞在羊膜当结合SIS并未改变其表型,上皮细胞和基质细胞有一个稳定的蛋白表达在整个分析周期。然而,形态调查显示减少的上皮细胞层完整性随着时间的推移,这意味着长期存储是不可能的或需要进一步优化。gydF4y2Ba

amnion-SIS构造,amnion-residing细胞没有迁移或融入SIS矩阵。这可能是生产过程的一种解释SIS严厉脱细胞组织的消毒,这可能影响胶原蛋白,从而改变蛋白质的性质和影响生物相容性和主机集成。所需的处理贪污持续快速降解内源性胶原酶(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。Spelzini等人可以显示大鼠间充质基质细胞整合到姐姐,但他们孤立的单个细胞悬浮,而不是从组织细胞迁移gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。在我们的建设中,姐姐只作为支持和随着时间的推移会逐渐降低内源性细胞外的组织形式和取代了姐姐。通过这些方式,细胞迁移到SIS不是主要的意义。总之,这些结果表明,在延迟修正缺陷的情况下,amnion-SIS构造可能是保存在文化21天,表明潜在的短期存储结构。gydF4y2Ba

PRGF-SIS构造特征,表明,跨国公司在PRGF凝胶,有或没有姐姐,维护一个健壮的蛋白质CD45和CD34的表达。没有增加扩散(Ki67)被发现但增加少量半胱天冬酶3表达观察。凋亡细胞数量的增加可能是由于失去PRGF-derived生长因子和细胞因子在介质变化通过降解过程。PRGF-SIS的凝胶结构慢慢退化,在第14天完全溶解。PRGF释放生长因子和细胞因子;促进细胞招聘、组织再生、血管生成和受损组织的再灌注;减少细胞凋亡(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba42gydF4y2Ba),属性,促进组织形成和伤口愈合;,减少细菌的风险colonialization [gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]。由于这些原因,14天内凝胶的降解可能不是一个问题在临床设置。gydF4y2Ba

当准备PRGF凝胶,这是引起凝血,我们允许一小部分包括红细胞,遵循一个既定协议(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。即使红细胞可能有毒的细胞,其他研究已经表明,血小板和白血球的最大恢复时的一小部分红细胞部分包含在platelet-enriched血液制品(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

Platelet-enriched衍生品从血液之前一直表现为血小板浓度和生长因子和细胞因子的内容(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。在我们的研究中,PRGF也富含跨国公司,同样的,细胞内容UCB是众所周知的gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。因此,我们认为没有必要等特征。gydF4y2Ba

5。结论gydF4y2Ba

这项研究表明羊膜和MNC-enriched PRGF凝胶,最小的处理后,作为非侵入性自体移植物来源有前途的候选人在先天性软组织缺陷的修正。还需要进一步的研究来评估这些构造的全部潜力。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

作者感谢妇女捐赠组织和员工在瑞典国家脐带血库的血和胎盘脐带。这项研究得到了瑞典医疗社会,素描基础,常见的BB基金会,卡罗林斯卡医学院。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

补充图1。amnion-residing细胞的蛋白表达。在DMEM-EC羊膜培养分析蛋白表达在第0天21。所有细胞表达CD73和上皮细胞表达PCK时间点。Ki67的有一个低表达和半胱天冬酶3到14天,在21天没有发现Ki67的表情但略有增加半胱天冬酶3表达。阳性细胞染色棕色。放大20 x (HTX /伊红),40 x (CD73和PCK)和60 (Ki67和半胱天冬酶3)。图2补充。跨国公司在PRGF凝胶形态和蛋白的表达。MNC-enriched PRGF凝胶是保存在文化长达14天,此后进行了分析。HTX /伊红染色显示细胞的数量减少和退化的凝胶在第14天总共缺席。 The cells expressed CD45 and few CD34 positive cells were detected throughout the time points. Cells positive for Ki67 were detected, but with decreasing number over time. The caspase 3 expression was also low but increased over time. Positive cells stain brown. Magnification 60x.(gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba)gydF4y2Ba

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