文摘
干细胞治疗严重依赖选择性细胞迁移对病理或受伤的区域。我们之前证明人类嗅觉间充质干细胞(OE-MSCs),源自一个成年人嗅觉固有层,迁移专门向受伤的移植后小鼠海马脑脊髓液,促进功能恢复。然而,控制招聘和归巢机制仍然是难以捉摸的。使用体外检查参与组成分泌腺的血脑屏障(BBB)和模型分析,我们发现OE-MSCs产生大量蛋白质允许他们穿过内皮墙。然后,pan-genomic DNA微阵列识别损伤小鼠海马中信号分子。最调节细胞因子,重组SPP1 /骨桥蛋白和CCL2 / MCP-1刺激OE-MSC迁移而只有CCL2产生趋化现象的效果。此外,OE-MSCs SPP1受体表达但无法CCL2同源受体,暗示CCR2-independent通路通过其他CCR受体。这些结果证实,可以吸引OE-MSCs趋化细胞因子在炎症区域和证明CCL2是一个重要因素,可以促进OE-MSC嫁接,建议改进未来的临床试验。
1。介绍
在急性损伤和神经退行性疾病的成人中枢神经系统(CNS),内在再生能力通常无法补偿神经损失。因此,外源细胞疗法作为一种新的治疗,移植细胞可能取代坏死细胞,作为神经营养或神经保护代理,或交付biotherapeutic分子(1]。移植细胞从胚胎干细胞,诱导多能干细胞,或神经干/祖细胞有各种脑病理模型中表现出巨大的承诺(2- - - - - -4]。然而,问题经常出现,包括伦理问题,电池可用性、移植排斥和肿瘤形成的风险5- - - - - -7]。因此,测试替代细胞类型仍然是极大的兴趣,尤其是成年外围干细胞(8]。
成体干细胞从人类鼻嗅黏膜,外围和永久自我更新的神经组织,是很有前途的候选人(9- - - - - -11]。我们具有多能间充质干细胞与神经源性属性,将其命名为嗅间充质干细胞(OE-MSCs) [11]。超出了他们的能力产生神经细胞,其他属性支持他们的潜在有用性自体干细胞疗法:方便的在每一个人12),他们在体外增殖速度高,虽然他们似乎并不形成肿瘤移植后(11,13]。在啮齿动物,OE-MSCs成功改善心肌梗死的模型(14),脊髓损伤(15- - - - - -17],耳蜗损伤[18,19),或帕金森病20.]。我们演示了他们的治疗潜力excitotoxically诱导神经元死亡的小鼠模型,模拟缺血/缺氧损伤在海马体(13]。我们表明,人类OE-MSCs颅内移植后存活,促进学习和记忆复苏。有趣的是,他们迁移专门向海马损伤后移植到controlateral unlesioned侧或脑脊液(CSF) (13]。此外,这种定向迁移和认知康复可以发生损伤后4周,推迟扩张所需的大量的OE-MSCs个体在自体移植的前景11]。
虽然是很有效的移植大量的细胞所需的大脑区域,移植到脑组织或脑脊液代表风险干预,尤其是年龄或脆弱的个体。系统移植到静脉或动脉,构成一个微创的方法(评论:21,22])。越来越多的研究,包括临床试验、报告静脉或动脉内的移植间充质干细胞对中枢神经系统损伤或疾病(23]。因此,对病理的选择性迁移或者创伤面积是一个关键的步骤,干细胞再生医学。有效疗法,干细胞归巢是必要的,以减少迁移到其他地区,同时允许交付通过微创路线和干细胞,可能,排除不必要的副作用24]。许多研究表明内生的取向和移植的干细胞/祖细胞组织发炎,缺血区域,包括神经胶质肿瘤和其他injury-associated区域神经炎症反应涉及组件的先天免疫系统25- - - - - -29日]。强烈上调炎症趋化细胞因子在脑病理领域,和这些分子与免疫细胞和干细胞的迁移这些网站(24]。识别分子途径指导干细胞迁移可能会改善一些神经系统疾病的治疗干预的关键(30.]。我们最近证明OE-MSCs强烈表达基质金属蛋白酶(MMPs)如MMP2、MMP9, MT1-MMP和显示其重要性OE-MSC迁移(31日]。然而,分子机制调节OE-MSC吸引力和自导受伤的大脑区域尚未研究。
目前的研究集中在如何嗅细胞移植到循环管理达到损伤大脑,穿越血脑屏障(BBB)然后通过神经实质迁移。更好地理解细胞和分子机制在起作用,我们使用了一个基于BBB的体外模型实验方法,一个详尽的蛋白质组学分析蛋白质的分泌由OE-MSCs pan-genomic微阵列研究分子发布的损伤细胞和细胞迁移化验。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
协议经当地伦理委员会批准后(拉西德保护des人,马赛,法国,文件号205 016),获得的人类鼻嗅觉粘膜活检在常规鼻手术在全身麻醉下。活检是立即放置在生长介质包含火腿DMEM / F12补充10%胎牛血清(的边后卫)和100单位/毫升的青霉素和100年μ克/毫升的链霉素(英杰公司/技术)。OE-MSCs从固有层和所述培养纯化前(11,13]。所有实验都使用OE-MSCs获得执行后4到12个段落从最初的文化。从三个不同的捐赠者OE-MSCs被用于这项研究。在需要的时候,OE-MSCs感染了GFP慢病毒载体。急性单核细胞的白血病细胞株THP1用作积极控制RT-qPCR实验获得了来自美国类型文化收集和培养RPMI 1640含10%的边后卫和100单位/毫升的青霉素和100年μ链霉素的g / mL。
2.2。血脑屏障(BBB)模型和渗透性测试
分析OE-MSC轮回中,我们使用一个模型的BBB两个隔间隔开多孔膜(孔隙大小:1μ米),已经被Molino et al。32]。简单地说,老鼠脑微血管内皮细胞从血液中培养高级舱聚乙烯插入过滤器涂以胶原IV和纤连蛋白,细胞密度达到500000每插入6-well文化板块。大鼠神经胶质细胞培养在舱底部密度16000细胞/厘米2。两个隔间,培养基组成的火腿DMEM / F12补充20%牛血清血小板减少,2 ng / mL纤维母细胞生长因子2 (FGF2),和500海里氢化可的松32]。对于每一个实验,重复3到4条件进行评估:0,120000年和500000年OE-MSCs被播种的内皮细胞,培养24小时。渗透率的路西法黄色染料(LY Sigma-Aldrich L0259)下使用荧光测量超过60分钟,描述(32]。
2.3。检查参与组成分泌腺OE-MSC分析
我们收集的条件培养基(厘米)的OE-MSCs培养3天在confluency T75烧瓶血压得到较好的控制含10毫升的无血清DMEM /火腿F12 insulin-transferrin-selenium-ethanolamine 1%(它的x,表达载体和生活技术)和青霉素和链霉素。一个培养瓶只包含无血清培养基作为消极的控制。0.2 CM是无菌过滤μm过滤器;蛋白酶抑制剂的鸡尾酒(Calbiochem 599131)增加了1%,和CM立即被冻结在−80°C。这个过程被重复了三天,和CMs的总和。CMs集中和淡化水Ultracel 3 k Amicon ultracentrifugal过滤器在3220年第一次离心在30分钟,加10毫升无菌水(b·布劳恩),第二个离心,享年3220岁20分钟。500年获得的μL(集中厘米,50μL被加载到一个聚丙烯酰胺凝胶(4 - 20% mini-Protean TGX凝胶,Bio-Rad 456 - 1096)和蛋白质电泳分离的沾EZ蓝染色试剂(Sigma-Aldrich G1041)。从凝胶洗脱后,通过胰蛋白酶水解肽,通过高效液相色谱法分离(终极3000 LC快速分离系统,Dionex),和串联质谱测序(Q-Exactive Thermofischer)。分泌蛋白被确定使用瑞士Prot数据银行(http://web.expasy.org/docs/swiss-prot_guideline.html)使用创造力和分析途径分析软件(https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/)。
2.4。小鼠海马Excitotoxic病变
动物实验伦理委员会批准的医学院马赛和依法进行指导方针发表在《欧洲共同体的理事会指令11月24日1986 (86/609 / EEC)。所有的努力都是尽量减少动物痛苦和减少小鼠的数量。单边或双边病变12个雄性Balb / c小鼠的海马(L 'Arbresle查尔斯河,法国)进行使用ibotenic酸(Sigma-Aldrich、Saint-Quentin-Fallavier、法国),NMDA受体激动剂,导致损失的神经细胞注入的细胞会网站,如我们之前所述研究[13]。损伤后的一天,海马损伤效率控制使用磁共振成像(MRI),如前所述[13]。
2.5。微阵列实验
4周后ibotenic段损伤,双边损伤小鼠(老鼠)和控制()被斩首。大脑很快被删除,海马解剖RNAse-free条件下之前立即放置在RNA后(试剂盒,Courtaboeuf,法国)和存储在−80°C。总RNA被隔离和处理使用RNeasy DNAse脂质组织迷你包(试剂盒)。RNA浓度和纯度测定使用NanoDrop - 1000分光光度计(NanoDrop技术,热费希尔科学、伊利柯克奇、法国)。RNA质量评估安捷伦2100 Bioanalyser(安捷伦科技、厚重的、法国)。对于每一个样本,600 ng的总RNA的互补脱氧核糖核酸生成一个安捷伦快速Amp工具包(安捷伦科技)。然后互补的RNA合成,放大,贴上青蓝3染料根据制造商的协议。青蓝3-labeled cRNA (1.65μg)是支离破碎的,杂化整个安捷伦老鼠基因组低聚糖微阵列4 x44k 17个小时的65°C。洗后,荧光强度在每个点化验使用G2565BA芯片扫描仪(安捷伦)。后提取与特征提取软件9.5.3(安捷伦)数据归一化(背景减法和分位数正常化)使用AgiND库开发下R安捷伦微阵列数据归一化和可视化软件。褶皱的变化比率(每个海马损伤对集中控制海马)计算每一个位置。加入ArrayExpress数据库上的数据(数字e - mexp - 2682)。
2.6。实时定量聚合酶链反应
4周后损伤,细胞因子的过度候选人评估使用实时定量PCR (RT-qPCR)控制()和损伤(老鼠)。根据制造商的协议(表达载体和生活技术,圣奥宾,法国),1μg总RNA从海马(如上所述)准备提交使用hexanucleotides逆转录和Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV)。定量PCR试验与7500年快速实时PCR系统(应用生物系统公司/技术)。所有反应都是使用TaqMan快速执行通用PCR大师混合和TaqMan®基因表达测定探针(应用生物系统公司,看到网上补充表2https://doi.org/10.1155/2017/1478606分析IDs)。对于每一个实验,25 ng先前准备的海马体互补脱氧核糖核酸。样本运行在7500年重复和分析软件v2.0(应用生物系统公司)。根据ΔΔCt相对表达水平测定方法Gapdh基因作为内生控制规范化。受体表达在人类OE-MSCs评估相同的协议(见补充表2分析IDs)。在这种情况下,使用人类看家基因数据规范化阿贝尔森,如前所述33]。对于每个OE-MSC捐赠者,RNA提取进行了从三个独立的文化和报道值意味着这三个独立的实验中,每一个在重复执行。
2.7。组织处理
手术后一个月,单方面受伤的老鼠()深麻醉(戊巴比妥钠、i.p)和灌注transcardially(盐4%多聚甲醛)。大脑被提取,后缀一夜之间在寒冷的多聚甲醛,并转移到30%的蔗糖溶液前处理低温恒温器切片(徕卡微系统公司,位于德国)。冠状部分(35μm厚)连续收集和保持漂浮在−20°C冷冻保护剂(30%甘油、30%乙二醇0.05磷酸盐(PBS)),直到加工为疣状。
2.8。疣状
组织染色,洗后在PBS,浮动部分被孵化1小时在室温下(RT)阻断缓冲区(3%的牛血清白蛋白,0.1%的特里同x - 100在PBS),一夜之间在4°C以下主要抗体稀释屏蔽解决方案:小鼠单克隆anti-GFAP(1/300,微孔/ Chemicon Molsheim,法国)或兔子anti-Iba1(和光纯1/200,kouichi、化工行业,大阪,日本)。然后,片冲洗(3×5分钟)在PBS和孵化90分钟在RT cross-adsorbed AlexaFluor 488 - 594 -共轭anti-rabbit或anti-mouse二级抗体(1/500,杰克逊Immunoresearch西树林,PA,美国)在黑暗中。在PBS几个洗后,切片与0.5复染色μg / mL赫斯特蓝色(# 33342,Sigma-Aldrich) 30分钟在RT和安装用延长金不变色试剂(英杰公司/技术)。图像获取与反向Axio观察者显微镜(蔡司,耶拿,德国)配备DAPI, FITC和罗丹明数字化的过滤器,使用的马赛克模式Axiovision软件(蔡司)。
细胞化学的BBB模型,进行轮回OE-MSC 12-well板插入过滤器和细胞在4%多聚甲醛固定15分钟。三洗之后,轻轻过滤器与细胞被分离从塑料插入刀片和孵化1小时在RT阻断缓冲区,一夜之间在4°C,用鼠标anti-Claudin-5主要抗体(1/100,表达载体),稀释的屏蔽解决方案。细胞被合适的荧光二次抗体孵育1小时在RT (1/500, Alexa萤石594 -共轭anti-mouse)在核与赫斯特蓝色标记。细胞被清洗和安装在延长黄金不变色试剂。
2.9。趋化性测定Boyden钱伯斯在修改
OE-MSCs在血清培养基培养,分离胰蛋白酶/ EDTA,统计,播种到参议院的细胞培养插入24-well板块与半透明的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)滤膜8μ米直径孔(BD猎鹰™,BD生物科学,Le Pont de Claix法国)密度为1.2×104细胞每插入,在200年的最后一卷μ它的x L无血清培养基的1%。细胞被允许迁移通过膜过滤后细胞因子添加到低室在不同浓度(人类重组C3A和鼠标重组SPP1,研发系统;人类重组CXCL10, CCL2, SPP1 Peprotech;和鼠标SPP1重组表达载体/生命技术)在400年的最后一卷μL相同的无血清培养基。控制插入由替换每个细胞因子与其调整缓冲区。经过12 h公司孵化(37°C的5%2)、插入被小心翼翼地清洗在PBS OE-MSCs和4%多聚甲醛固定,和他们的核沾染了1μg / mL赫斯特蓝色(# 33242,英杰公司/技术)。观察膜过滤器使用尼康E800(尼康、Champigny-sur-Marne、法国)直立显微镜配备数字化和DAPI过滤器和一个Orca-ER CCD相机(滨松光子学、滨松、日本)。定量评估,细胞染色膜的两侧是手工计算和迁移细胞的百分比计算。四十个随机领域分析了每膜过滤器,使用一个40 x的目标。报道值每膜迁移细胞的平均百分比至少有三个独立的实验一式三份。随机细胞运动性(化学运动性)评估通过添加同等浓度的细胞因子在两室的上、下井。
2.10。琼脂糖点分析
为了量化细胞因子影响OE-MSC移民,我们也进行琼脂糖现货化验,如前所述[34,35几乎没有改变。低熔点的点琼脂糖(超纯™低熔点的琼脂糖,表达载体和生活技术)被稀释到无菌PBS为了使1%的琼脂糖的解决方案。该解决方案被加热,直到所有琼脂糖颗粒被溶解,然后冷却到37°C。预热cytokine-containing解决方案在无血清培养基(37°C 1%它的x)被添加到融化1%琼脂糖生产的最终浓度0.5%琼脂糖和10μ细胞因子g / mL的解决方案。消极的控制琼脂糖溶液制备为每个细胞因子通过调整缓冲区。对于每一个条件,10独立滴5μL(维持在37°C)是用移液器吸取到一个无菌30毫米直径的玻璃盖玻片之前存入一个35毫米细胞培养培养皿。这道菜是在4°C冷却10分钟,让琼脂糖现货凝固。培养皿被轻轻装满2毫升的无血清培养基与1%它的x和放置在一个孵化器有限公司(37°C的5%2为10分钟)。然后,在血清培养基培养OE-MSCs trypsinised和resuspended无血清培养基。每一道菜包含2×10的琼脂糖点被播种5细胞培养24小时(37°C公司5%2)。细胞入侵的数量在琼脂糖现货是手动计算使用标准相差光学显微镜。显微镜成像是使用一个倒置的执行阶段(TE300尼康)10倍的目标,和图片是使用一个Orca-ER CCD相机(滨松光子学)和Axiovision软件(蔡司)。入侵细胞的总数/琼脂糖点计算,和报道值意味着数量的细胞每点至少有三个独立的实验。
2.11。统计数据
所有数据都意味着±SEM。分析了数据使用SPSS / PC + 11.0统计软件(SPSS Inc .,芝加哥,IL)。克鲁斯卡尔-沃利斯、方差分析和Mann-WhitneyU测试是使用适当的检测任何显著差异,显示在每个图的传说。最小阈值被设定为意义。
3所示。结果
3.1。人类通过体外BBB OE-MSCs迁移模型
可视化血球渗出现象,我们镀GFP-positive OE-MSCs体外血脑屏障模型。低倍镜下和使用阶段对比(图1(一)和数字化的数据1(一)和1 (b)),我们观察到明显未分化的干细胞坚持到顶端表面内皮细胞层以及differentiating-looking细胞,扩散膜的插入和BBB基底一侧的下面。穿过屏障,干细胞可以通过一个内皮细胞内皮细胞之间(transcellular)或(paracellular)。对于后者,他们可能穿孔层,在不同的地方,使他们的另一边,观察到的数据1 (c)和1 (d)。使用一个anti-Claudin 5抗体标签紧密连接,我们发现违反BBB,接近两个GFP +干细胞。确定障碍跨越,我们使用的正交投影酒吧共焦显微镜,如图1 (e)(顶部和右侧栏):迁移细胞(绿色)显然是坐落在Claudin-positive内皮细胞层(红色)。图1 (f)在迁移过程中显示一个GFP-positive球状OE-MSC(白色箭头)和附加OE-MSC BBB(白色箭头)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
观察到的穿孔的障碍使我们测量其渗透性。我们cocultivated干细胞和血管内皮细胞在24小时内,并使用一个小时长的路西法黄色的测试中,我们观察到在屏障通透性显著增加,对细胞密度:每好,120000个细胞每口井的500000个细胞(图1 (g))。
3.2。OE-MSCs分泌蛋白质参与自导和轮回
为了确定血球渗出机制,我们寻求OE-MSCs分泌的可溶性因子。这是猜测,有些责任,至少部分,轮回嗅觉干细胞的能力。为此,我们分析了介质的干细胞培养3天,称为条件媒体。后过滤、净化的蛋白质分数,在琼脂糖凝胶和迁移,我们使用质谱仪出蛋白质的存在。总共有629个人类蛋白质的特征(见补充表1)。近两5(239/629 = 38%)的这些蛋白质与细胞运动相关联,轮回,和/或归航。629年的完整列表蛋白质与创造力的软件进行了分析。显示在图2(一个),五大规范的途径与血球渗出/溢出(3/5),肌动蛋白细胞骨架(1/5),和轴突指导(1/5)。创新途径分析也确定了34与轮回相关的蛋白质,我们建议图2 (b)考虑到可能OE-MSC血球渗出机制。
(一)
(b)
3.3。损伤海马发炎受伤后的一个月
然后我们想在OE-MSC评估炎症过程的作用选择性迁移到损伤海马(13]。我们第一次使用核磁共振成像技术来验证每个动物损伤的特异性和有效性。手术后24小时,我们可视化注入/损伤区和证实,只有目标海马体(图的影响3(一个))。沿着这条线,四个星期postlesion脑组织分析显示一个戏剧性的细胞在海马注射细胞层,尤其是在CA1和齿状回区域(数据3 (b)和3 (c))。另外,我们观察到神经炎症标记如Gfap和Iba1,分别标记反应性星形胶质细胞和小胶质细胞,表达强烈,特别是在损伤区(数字3 (d)- - - - - -3 (g))。因此,一个月后损伤,损伤海马仍然显示炎症特征,使得这个模型非常适合进一步的基因表达分析。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
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(g)
3.4。损伤海马基因过表达细胞Chemoattraction
为了找到候选人OE-MSC损伤脑组织内化学引诱物,我们建立了控制和损伤海马的基因表达谱。4周病变后,海马分离和加工pan-genomic微阵列分析(ArrayExpress数据库,加入e - mexp - 2682)。数据表明,114年成绩单上面的褶皱变化2.5调节损伤海马。有趣的是,大卫功能注释集群工具显示中记录归入到官能团,特别说明,53%的这些基因是参与免疫和炎症过程。更重要的是,在强烈调节成绩单(褶皱变化超过10),四人编码分子已经闻名趋化免疫细胞上的属性和其他干细胞类型(表1)。事实上,记录为C3和Spp1,两个细胞因子家族的成员,以及那些的Ccl2和Cxcl10趋化因子是非常有趣的。旁边那四个候选人,其他趋化细胞因子转录(亚兰,Ccl5,Ccl7,Ccl12,Ccl19,处于受控,Cxcl16)也显著的过表达。相反,其他基因没有显示显著变化尽管他们编码细胞因子或生长因子与化学引诱物的作用在不同类型的干细胞,如Cxcl12 / Sdf1,干细胞因子(自洽场),Igf1,Hgf,Pdgfa,Vegfa。在随后的实验中,我们决定专注于四大细胞因子过表达的趋化作用。确认从我们的微阵列基因表达数据分析中,我们评估的表达水平C3,Spp1,Ccl2,Cxcl10由RT-qPCR(图4)。在这里,所选择的细胞因子明显过表达(在损伤海马(每个))相比,nonlesioned海马()(数据4(一)- - - - - -4(d))。值得注意的是,基因表达分析参与大脑炎症,是另一组基因,Gfap,F4/80,Tnfa,Il1b确认的炎症状态受伤的海马,一个月后病变(数字4 (e)- - - - - -4 (h))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
3.5。CCL2, SPP1刺激OE-MSC迁移体外
融合数据使我们评估的影响人类重组细胞因子C3A CCL2, SPP1, CXCL10人类OE-MSC迁移。为此,我们使用修改Boyden钱伯斯和琼脂糖现货化验评估OE-MSCs chemotattractant这些分子的潜力。有趣的是,只有CCL2和SPP1刺激OE-MSC迁移Boyden钱伯斯在修改。的确,我们观察到的数量显著增加的细胞迁移在应对这两种细胞因子的早在治疗后12小时(数字5(一个)- - - - - -5 (d))。值得注意的是,我们的研究结果显示存在剂量依赖的相关性的影响,开始时显著的浓度达到400 ng / mL CCL2 ()和SPP1 ()(图5 (d)),没有细胞因子都是使用(图时累积效应5 (e))。细胞的总数持平在这些条件下,因此排除artifactual由于OE-MSC增加增殖的影响。值得注意的是,这些结果一直复制OE-MSCs来自三个额外的个人(数据没有显示)。同样的,我们观察到,只有CCL2和SPP1显著刺激下OE-MSCs的迁移成凝胶状琼脂糖包含细胞因子10滴μ克/毫升(两个),24小时后的迁移(数据5 (f)- - - - - -5(我))。在这里,没有观察到当两个细胞因子累加效应(图相结合5 (j))。总之,我们的结果表明,CCL2比SPP1更强有力的修改Boyden室试验(242.7±18.6% hSPP1 hCCL2和181.4±19.5%;)以及在琼脂糖点分析(391.5±27.2% hSPP1 hCCL2和187.1±21.7%;),当比较的细胞因子浓度和最大的功效。手里拿着这些数据,我们假设相同的细胞因子可能发挥作用在OE-MSC迁移到损伤小鼠海马(13]。我们使用一个类似的策略用鼠标重组Ccl2, Spp1细胞因子。类似于人类CCL2修改Boyden室试验,小鼠CCL2刺激OE-MSC迁移,从400 ng / mL的浓度()(图6(一))。令人惊讶的是,更高浓度的鼠标Spp1 (4000 ng / mL)被要求观察效果()(图6(一))。最后,琼脂糖现货化验证实Ccl2 Spp1能够刺激OE-MSC迁移(两个)Ccl2比Spp1显然更强(图6 (b))。总之,我们的研究结果验证CCL2和SPP1两个候选分子可能参与定向迁移OE-MSCs朝着一个特定的损伤区域。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
(一)
(b)
3.6。对体外OE-MSCs CCL2施加趋化现象的影响
为了进一步阐明CCL2行动和SPP1机制OE-MSC迁移,然后评估随机细胞活性的相对贡献(化学运动性)和gradient-dependent细胞迁移(趋化性)的人类OE-MSCs CCL2和SPP1。区分趋化性和化学运动性修改Boyden室,我们比较的细胞因子的影响只在低或两室的上部和下部隔间,为了扰乱梯度。同样,在琼脂糖现货化验,周围的细胞因子在中,还添加了下降,为了扰乱细胞因子梯度。有趣的是,我们观察到显著减少gradient-disrupted CCL2-dependent刺激的条件(对化验)(数据7(一)和7 (b))建议OE-MSCs CCL2趋化现象的效果。然而,OE-MSC迁移仍然没有CCL2梯度的增加(在Boyden钱伯斯和修改在琼脂糖测定),从而表明CCL2刺激化学运动性和趋化性的结合。重要的是,没有观察到显著差异SPP1梯度时中断(数字7 (c)和7 (d)),这表明SPP1只作用于人类OE-MSC化学增活现象。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.7。人类OE-MSCs表达CCR1和CCR10但不是CCR2
鉴于我们的结果,我们决定评估同源受体的表达在OE-MSCs CCL2, CCR2。为此,我们设计了RT-qPCR探针(补充表2)反对的两个亚型CCR2(CCR2A和CCR2B)。令人惊讶的是,CCR2信使rna OE-MSCs从所有三个测试中无法捐助者(图8(一个))。值得注意的是,检测CCR2信使rna在急性单核细胞的白血病细胞株(THP1)来表达CCR2证明了我们的系统的有效性的分析。阐明一个替代的作用机制绕过经典CCL2 / CCR2交互,我们测量碳碳趋化因子受体的表达(ccr自己)可以绑定CCL2,包括CCR1 CCR4和CCR10。这两个CCR1和CCR10表达人类OE-MSCs,从而提供两种方式OE-MSCs CCL2行动。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
在先前的研究中,我们证明了人类OE-MSCs的定向迁移到损伤海马陪同失忆症的功能恢复观察移植后小鼠模型。我们报道的能力OE-MSCs体内移植时执行迁移距离受伤网站(13]。然而,分子机制规范招聘和OE-MSCs的归航受伤的大脑区域尚未调查并获得洞察这些机制可以提高接枝OE-MSCs的治疗潜力。我们这里提供了第一个证据,人类OE-MSCs分泌的关键蛋白质,可以让他们穿过血脑屏障,并吸引了先天免疫系统的组件中损伤海马。我们确定CCL2趋化因子能刺激人类OE-MSCs而SPP1 gradient-dependent迁移的细胞因子提高他们随机的能动性。
到目前为止,没有任何研究报告的迁移OE-MSCs穿过血脑屏障。然而,根据我们的工作之前,OE-MSCs属于子群间充质细胞(11),他们是间充质细胞的大家庭的成员。有趣的是,一些研究报道通过BBB的骨髓间充质干细胞(36- - - - - -38]。
在目前的手稿,我们用“血球渗出”这个词来唤起OE-MSCs通过BBB模型的流逝。这个术语通常是指一个细胞的机制(通常是一个白细胞)发现的毛细血管的内皮细胞之间。穿越BBB有第二种可能性:transcellular方式允许一个分子或细胞穿越内皮细胞的细胞质中加入血管的腔或器官(39]。这里给出的数据认为赞成穿孔的内皮细胞层内皮细胞之间的紧密连接。但是,不能排除存在transcytosis平行。解决这个问题在未来的研究中,我们不仅可以用视频显微镜和电子显微镜还研究蛋白质的表达参与transcellular迁移(把一、PECAM-1 VCAM-1, ICAM-1,等等)(40]。
本研究确定了629 OE-MSC-secreted蛋白质,两倍多的数量(274)分泌蛋白质相同的一个研究小组研究报告的成年干细胞亚型(41]。这两个数据集包含119常见的蛋白质,而510人独特的发现在我们的研究中。质谱仪的灵敏度用于我们的实验可以解释这种差异。尽管如此,这两项研究强调细胞迁移的重要性。事实上,使用Swiss-prot功能注释,先前的研究发现最多的分泌蛋白质有关细胞生长和迁移途径(41]。同样的,我们在这里报告,239年的629个OE-MSC-secreted蛋白质与细胞运动相关联,移民,和/或归航。
神经炎症是一种常见的分母在受损的大脑区域,并与神经炎症相关细胞因子,参与不同类型的导航机制的免疫,肿瘤、干细胞(42]。因此,破译受损区域的炎症过程是理解人类OE-MSC导航机制的先决条件。组织学分析4-week-lesioned海马透露一个强大的反应性星形胶质细胞和小胶质细胞,大脑的两个主要组件先天免疫(43]。正如预期的那样,损伤区域显示炎症基因表达谱的结构和大部分的过表达基因直接参与免疫和炎症过程。为了阐明信号参与OE-MSC归航,我们确定了四个高度中记录两个细胞因子(例如,代码C3和Spp1)和两个趋化因子(例如,Ccl2和Cxcl10)闻名趋化免疫细胞上的属性或各种干细胞类型。
第一候选人,补充组件C3,是最中记录的微阵列。补体级联激活在大多数神经系统疾病,包括急性或慢性脑侮辱(44]。补体激活从古典、替代和凝集素途径导致过敏毒素的生产C3a,一个小的多肽释放C3转化酶的前体蛋白C3。C3a过敏毒素是局灶性脑缺血后参与炎症过程45),被描述为间充质干细胞在体外的趋化现象的因素(46]。同样,SPP1,也称为骨桥蛋白,展品强chemoattractive和促炎属性(47),是调节在受伤的大脑区域48,49),并促进迁移的各种细胞类型,包括星形胶质细胞、间充质干细胞,或从subventricular区成神经细胞48,50- - - - - -53]。CXCL10,科学家趋化因子家族的一员,也可以吸引骨骨髓来源间充质干细胞(BM-MSCs) [54),和CXCL10-expressing细胞出现在发炎后中枢神经系统创伤或在神经退行性疾病55]。在四个候选人,CCL2是研究最多的因素而言,干细胞归巢到受损区域:它显示chemoattractive众多干细胞上的属性类型,包括神经嵴干细胞(56),神经干细胞(28,29日,57,58],BM-MSCs [59,60]。
当我们测试这些4过表达细胞因子的影响OE-MSC迁移,琼脂糖现货化验的数据完全证实与修改Boyden钱伯斯获得的结果。我们证明了人类重组SPP1显著刺激人类OE-MSC迁移浓度范围的40 - 400 ng / mL。这些结果与之前的研究一致表明SPP1 BM-MSCs的迁移浓度增加500 ng / mL以上(51]。然而,其他研究报告的作用SPP1浓度从10到20μ在星形胶质细胞(g / mL48),间充质干细胞(50),和成神经细胞52,53),在修改Boyden两院。这种比较突出了人类的高灵敏度OE-MSCs SPP1。这个细胞因子与不同的细胞表面受体47整合素等)β1 [51,53)和整合素αv (49通过arginine-glycine-aspartate (RGD)域或通过一个RGD-independent机制与CD44 (50]。在一项研究11),我们证明了人类OE-MSCs强烈表达整合素β1 (CD29),整合素αv (CD51),并在其表面CD44。
关于CCL2趋化因子,我们表现出显著影响人类重组CCL2人类OE-MSC迁移,浓度范围从80到400 ng / mL。这些结果与以前的研究一致表明CCL2影响成神经细胞,在500 ng / mL [29日]或BM-MSCs从75 ng / mL,在修改Boyden钱伯斯(61年]。然而,许多体外研究报道CCL2效应在低浓度(150 pg / mL到10 ng / mL)成神经细胞和间充质干细胞(28,56,57,59,62年,63年]。在大多数情况下,研究了细胞表达CCR2受体。令人惊讶的是,我们没有发现这两个同源CCL2受体产生的可变剪接,也就是说,CCR2A和CCR2B,在人类OE-MSCs从三个不同的捐赠者。从研究BM-MSCs会呈现出一幅不同的画面,一个干细胞类型OE-MSCs[密切相关11]:这些细胞趋化因子受体的表达,尤其是CCR2根据不同文化条件和评估技术(64年- - - - - -67年]。CCR2表达式preincubating BM-MSCs的刺激下,炎性细胞因子(65年]。然而,初加工OE-MSCs促炎细胞因子TNFa或CCL2配体不导致OE-MSCs CCR2表达式(数据没有显示)。这些观察表明,CCL2刺激通过CCR2-independent OE-MSC迁移途径。趋化因子受体与各种绑定的绑定到一个大家庭紧密联系(68年,69年]。例如,尽管CCR2最高的受体亲和力,CCL2可以绑定到低亲和力受体CCR1等(68年,70年]和CCR4 [71年- - - - - -73年),或通过未知的机制74年,75年]。在最近的研究中,使用RT-qPCR,我们观察到一个弱的表达CCR1而CCR4成绩单是无法觉察的。未发表的微阵列数据获得OE-MSCs表明CCR10是最高度表示碳碳在这些细胞趋化因子受体(CCR)。在这里,我们确认使用RT-qPCR OE-MSCs的表达式。尽管CCR10主要是绑定CCL27和CCL28高亲和力(76年],CCL2可能在OE-MSCs然而结合并激活CCR10,通过未知的途径。
当比较CCL2, SPP1 OE-MSC迁移的影响,我们发现CCL2更强有力的和是最佳候选人解释OE-MSC自导损伤海马。现在建立一个分子可以影响细胞迁移随机运动(即通过刺激。、化学增活现象)或concentration-dependent-directed迁移(即。趋化性)或两者的结合77年]。CCL2趋化因子是有效的在OE-MSC迁移趋化因子梯度的存在,表明CCL2主要趋化现象的影响,而SPP1诱发类似的反应在一个梯度的存在与否,证明其效果主要是chemokinetic。此外,在两种细胞因子的浓度显示的最大功效,CCL2比SPP1和一个更强有力的鸡尾酒的细胞因子不会增加CCL2效果。所需的浓度刺激人类的体外迁移OE-MSCs表明这些细胞因子在体内的潜在影响可能会限制主要physiopathological发炎状况。然而,我们不能排除OE-MSCs新趋化因子受体表达水平较高或嫁接时进入大脑。另外,鸡尾酒的其他几个趋化因子,在低水平表达海马发炎,也会起到趋药性的作用。
在先前的研究中,我们成功地展示了人类的治疗潜力OE-MSCs嫁接在失忆的小鼠模型13]。因此,我们决定评估chemoattractive潜在的人类和小鼠的细胞因子。关于CCL2,比较人类和小鼠之间的氨基酸序列CCL2表明身份和相似性为81% (55%78年]。可以预见的是,我们在这里证明老鼠和人类重组CCL2诱发类似的效果对人类OE-MSC迁移。这一发现与之前的一项研究表明,人类和小鼠细胞因子equiactive人类单核细胞(79年]。关于SPP1,比较人类和小鼠之间的氨基酸序列SPP1表明身份和相似性为81% (64%80年]。像CCL2,我们显示,老鼠和人类重组SPP1刺激人类OE-MSC迁移。
5。结论
总之,我们把人类OE-MSCs transmigration-associated表达蛋白质的第一个证据,穿过血脑屏障,并响应在损伤海马细胞因子过表达,如CCL2和SPP1。我们还发现脑成分可能吸引OE-MSCs和负责,至少部分,导航网站的脑损伤。这些新数据可能被证明是至关重要的改善的治疗潜力OE-MSCs以修复人类大脑病理或创伤。
信息披露
目前地址VECT-HORUS SAS的作者史蒂芬·d·吉拉德将进医学院学习Secteur北方,CS80011,皮埃尔•Dramard大道13344年法国马赛Cedex 15日。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。
的利益冲突
所有作者声明,不存在利益冲突。米歇尔Khrestchatisky Vect-Horus创始人之一和股东。
作者的贡献
史蒂芬·d·吉拉德和伊莎贝尔Virard贡献同样这项工作。
确认
作者感激地感谢娜塔莉Baril有效帮助MRI收购期间,尼古拉斯·雅和比阿特丽斯Loriod微阵列研究(基因组平台TAGC、Ibisa INSERM U928),撒母耳Granjeaud (CRCM)在生物信息学方面的专业知识,并为她帕斯卡尔Durbec洞察力。本研究在德未来基金会的支持下,法国脊髓和大脑研究所(IRME)和法国国家研究机构(ANR)(“特别的”项目)。他们承认的支持“溺爱纽约德发展区域”菲德尔在天竺鼠地区。史蒂芬·d·吉拉德,伊莎贝尔Virard Emmanuelle Lacassagne ANR奖学金的接受者,法国外交部的研究,和IRME。质谱仪是获得使用的金融支持“le Cerveau联合会de矫揉造作的倒”(FRC)通过旋转操作“艾丝珀恩。“项目主要出版已收到资金从法国的大学卓越计划* MIDEX,法国“Investissements d未来”计划。”