机械拉伸对间充质干细胞和前交叉韧带成纤维细胞增殖和基质形成的影响

摘要

间充质干细胞(MSCs)和成纤维细胞是韧带组织工程的两种主要种子细胞。为了了解机械刺激对这些细胞的影响，并开发有效的细胞治疗方法，有必要研究各种机械载荷条件对细胞的生物学效应。在这项研究中，纤维母细胞和间充质干细胞在一种可能模拟韧带组织机械应变的新型Uniflex/Bioflex培养系统下进行测试和比较。用不同的菌株(5%、10%和15%)在0.1、0.5和1.0 Hz下单向或径向拉伸细胞。比较细胞增殖和胶原蛋白的生成，找出最优参数。结果表明，单轴拉伸(15%在0.5 Hz;10% (1.0 Hz)对成纤维细胞有积极作用。0.5 Hz时的单轴应变(5%、10%和15%)和1.0 Hz时的10%应变对MSCs有利。径向应变对成纤维细胞无显著影响。相反，在0.1 Hz时径向应变(5%、10%和15%)对MSCs有积极作用。 This study suggested that fibroblasts and MSCs had their own appropriate mechanical stimulatory parameters. These specific parameters potentially provide fundamental knowledge for future cell-based ligament regeneration.

1.介绍

前令韧带（ACL）是一种重要的关节内结构，以保持膝关节的稳定性。然而，由于血管化差，它不能在严重伤害后自发愈合[1-3.］．由于合成移植物的结果差，同种异体移植物或自体移植物（腿筋或髌骨腱）现在经常用于重建ACL。虽然通过Allo / Auto接枝移植获得了诸如主观满足和部分稳定性恢复的有前途的结果，但在长期随访研究中没有实现可靠和功能性的组织修复。在临床治疗中观察到包括韧带韧带，供体部位发病率和病原体转移的增加的问题[4.-6.］．近年来，组织工程韧带为上述问题的解决提供了新的途径。

组织工程韧带具有提供可以容易获得的替代移植物的潜力。然而，施工可行性和生物力学等效韧带需要对ACL生物学的基本理解，包括成纤维细胞基质合成和回复局部机械环境的重塑[7.］．机械刺激对韧带的结构、功能、愈合能力和发育等性能有显著影响。在日常活动中，前交叉韧带受到不同程度的拉伸，这对韧带的内稳态至关重要。机械载荷引起活组织的结构、组成和功能的变化。现在人们普遍认为，机械力在调节细胞功能(包括基因诱导、蛋白质合成、细胞生长、死亡和分化)中发挥着基本作用，而这些功能对维持组织稳态至关重要[8.］．另一项研究还表明，机械负荷影响细胞功能，例如细胞增殖和胶原合成[9.］．

细胞来源的选择对于组织工程韧带的重建具有重要意义。不同的种子细胞由于表型和功能的差异，对组织工程韧带的性质有很大的影响。ACL成纤维细胞是负载敏感细胞，其复杂的结构变化响应机械力。此外，成纤维细胞产生的胶原是韧带的主要成分，具有很大的抗拉强度[10.］．理论上，ACL成纤维细胞应该是潜在的韧带组织工程的主要选择，特别是他们可以很容易地在诊断关节镜程序。除前交叉韧带成纤维细胞外，从骨髓中分离的间充质干细胞(MSC)由于其多能性和增殖能力是另一种潜在的韧带修复细胞来源。由编织丝纤维制成的支架具有与天然ACL相似的力学性能，显示出增强MSCs附着、增殖和分化的能力[11.］．为了可能改善组织工程韧带的功能和结构，在之前的研究中，我们将形成ACL和内侧副韧带(MCL)组织的成纤维细胞与间充质干细胞进行了比较。MSCs的增殖率和胶原排泄量进一步显示高于ACL和MCL成纤维细胞[12.］．虽然很多研究调查了循环机械刺激对移植物掺入、细胞形态、胶原生成和细胞分化的影响，但很少有文献描述了机械刺激的最佳参数[13.-15.］．

为了更好地理解机械刺激对不同细胞的作用，并开发有效的细胞治疗方法，有必要研究各种机械载荷条件对细胞的生物学效应。在这项研究中，纤维母细胞和间充质干细胞在一种可能模拟韧带组织机械应变的新型Uniflex/Bioflex培养系统下进行测试和比较。目的是找到细胞增殖和胶原生成所需的最佳参数(应变幅度、频率和持续时间)，这可能为未来的细胞基础韧带再生提供基础知识。

2。材料和方法

2．1．间充质干细胞和成纤维细胞的分离与扩增

采用文献报道的方法，分别从新西兰大白兔(12周龄，2.5-3.0 kg)骨髓抽出物和韧带组织中分离骨髓间充质干细胞和成纤维细胞[16.］．一般来说,单核细胞从骨髓被离心分离Ficoll-Hypaque梯度(σ有限公司,圣路易)和悬浮在20毫升的杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)补充10%胎牛血清(的边后卫)(HyClone犹他州洛根的)、谷酰胺(580 mg / L),和penicillin-streptomycin (100 U /毫升)。培养物在37°C和5% CO下培养₂．72 h后，通过改变培养基去除非粘附细胞。当浓度达到70-80%时，用0.05%胰蛋白酶将贴壁细胞从烧瓶中释放出来进行传代培养。培养2周后获得同源的间充质干细胞群，收集第3代间充质干细胞以供进一步使用。

为分离成纤维细胞，收集兔ACL在无菌条件下切除。将韧带组织绞碎，在1%抗生素培养基中冲洗2次，10分钟。然后将切碎的韧带组织置于37°C的0.25%胶原酶溶液中，搅拌12-18小时。纤维母细胞通过100次消化过滤分离出来μM过滤器。将含电池的溶液以300g离心5分钟，除去上清液，并将颗粒重悬于1％抗生素培养基中并进行了预振。除去上清液，并将细胞悬浮在培养基中，含有1％抗生素，1％谷氨酰胺和10％胎儿牛血清（FBS）并在37℃，100％湿度和5％CO的T-75烧瓶中培养₂．2周后汇合，进行传代培养。收集成纤维细胞(第3代)进行进一步评估。

2.2。uniflex / Bioflex板中的细胞培养

将1 mL 0.25%的胰蛋白酶溶液加入有融合细胞的T75烧瓶中，然后在37°C下孵育3分钟，定期轻轻摇晃，使细胞胰蛋白酶化。加入10 mL含10%胎牛血清的培养基，停止胰蛋白酶反应。在20℃，300 g离心10 min。细胞颗粒在2ml培养基(1%抗生素，1%谷氨酰胺和10%胎牛血清)中重悬，并通过重复移液彻底混合。1×10^6.将细胞接种于Uniflex/Bioflex培养板的每个孔中，并在37°C、100%湿度和5% CO下培养₂．

2.3。机械装载

2．3．1．单轴应变

分别在37°C，100％湿度和5％Co的Uniflex培养板中加载成纤维细胞和MSC。₂直到它到达汇合。在细胞播种区域的每一侧进行0.5cm间隙，以允许细胞迁移和增殖（图1（a）)．通过将Uniflex培养板的每个孔放置在垫圈的底板中，通过将加载矩形柱（FlexCell International）放置在垫圈的底板上并施加真空以使柔性膜向下变形来单轴加载细胞。柔性膜沿着装载柱的长边向下变形，从而将单轴应变施加到装载的细胞（图1（b）)．使用FlexCell应变单元（FlexCell International），装载方案为5天，8小时/天（每2小时15分钟，每2小时15分钟，每2小时，每2小时15分钟，0.5和1 Hz。

2.3.2。径向菌株

将来自T75瓶的成纤维细胞和间充质干细胞胰蛋白酶化，在Bioflex培养板的每孔培养基(1%抗生素、1%谷氨酰胺和10%胎牛血清)中，在37°C、100%湿度和5% CO条件下培养₂直到它到达汇合。在细胞播种区域周围制备0.5cm间隙，允许细胞迁移和增殖空间（图2(一个))．将圆柱形加载柱(Flexcell International)放置在Bioflex培养板的每个孔的垫片底部，并施加真空使柔性膜向下变形，从而对细胞进行径向加载。柔性膜沿圆柱形加载柱的圆周向下变形，从而对ACL成纤维细胞施加径向应变(图2（b）)．加载方案为5天，8小时/天(每2小时休息15分钟)，应变为5、10或15%，0.1、0.5或1 Hz，使用Flexcell strain Unit (Flexcell International)。

2．4．细胞生存能力/扩散

阿拉玛蓝(AB，萨克拉门托。将CA)加入6孔板培养液中，终浓度为10%，在37℃下孵育2 h (AB混合物应呈紫色/淡红色)。孵育2小时后，100的三倍μ将来自每个孔的AB混合物转移并置于96孔板中。用标准分光光度计在570和600nm处测量AB混合物的光密度。

AB的氧化形式是非荧光的，呈蓝色(= 600 nm），而荧光和红色的形式缩小（= 570海里)。这种染料检测活细胞的机制涉及到通过呼吸链反应的代谢还原。活细胞的数量与染料还原的幅度相关，用AB还原的百分比表示[17.］．AB减少的百分比(% AB减少)是根据制造商的协议计算的。对含有无细胞培养基的阴性对照的背景值进行了校正。

2．5．胶原蛋白生产试验

从6孔板中完全除去培养基。将种子细胞用PBS溶液洗涤两次。然后将胃蛋白酶（0.025％）加入到孔中并与细胞一起温育2小时以消化所有合成的胶原蛋白。将溶解的胶原用1M NaOH中和，并调味为微量离心管。300 μL的Sircol Dye试剂加入100 μL溶解的胶原蛋白，并摇动30分钟。在此期间，Sircol染料将结合可溶性胶原蛋白。设计染料试剂，使得胶原染料复合物将沉淀出溶液。微量离心管以10,000×g旋转10分钟。牢固地将胶原染料复合物的不溶性颗粒牢固地包装在管的底部，以避免在排水期间的任何损失。通过小心地反转并排出管，除去未结合的染料溶液。碱试剂（500 μ将L)加入到每个管中，旋转释放结合染料到溶液中。150年μ分离出的L种结合染料转移到微滴板中。吸光度为540 nm，参考波长为600 nm。

2．6．统计分析

未配对t-检验对显著性水平为0.05、样本量为6时细胞的拉伸效应进行统计数据分析。

结果

3.1。单轴拉伸成纤维细胞

在0.1 Hz、8小时/天、5%、10%、15%拉伸5天后，ACL成纤维细胞增殖分别显著下降3.9%、4.1%、13.1% ()．胶原蛋白的产生分别显著降低了21%、14%和11.1%。（)．

在0.5 Hz时，5%和15%的ACL成纤维细胞拉伸分别显著增加了6%和11%的细胞增殖()．0.5Hz的10％拉伸显着降低细胞增殖5％（)．当细胞以5％和0.5Hz拉伸时，胶原蛋白的产量明显降低了15.1％（)．然而，当细胞以相同的频率拉伸10%和15%时，胶原蛋白的产生增加了3.0% (）和33.9％（),分别。

循环拉伸ACL成纤维细胞以5％或15％的幅度为1 Hz，分别下降2.5％和12.0％的细胞增殖降低（)．同样，胶原蛋白的产生分别减少了7.0%和21.9% ()．另一方面，10%的拉伸在1 Hz增加了4.0%的细胞增殖()和胶原蛋白的产生增加12% ()(数据3.和4.)．

3.2。用于MSC的单轴伸展

骨髓间充质干细胞与成纤维细胞的增殖趋势相似。在0.1 Hz、8小时/天、5%、10%、15%拉伸5天后，MSCs增殖均明显下降()．而在0.5 Hz、5%、10%、15%的拉伸下，增殖均增加了12%、14%、18% ()．当频率增加到1 Hz时，只有10％的菌株可以增强增殖（图5.)．

MSCs显示胶原蛋白产量下降0.1Hz，幅度为5％，10％或15％（)．相反，胶原蛋白产量分别增加21％，18％和30％，0.5Hz，5％，10％和15％菌株（)．在1 Hz，只有10％的拉伸增加了胶原蛋白产量15％（） （数字6.)．

３．３．纤维母细胞的径向拉伸

15％以0.1Hz拉伸，8小时/天5天，ACL成纤维细胞增殖增加4％（)．与未拉伸细胞相比，拉伸5%和10%的细胞没有显著差异(图)7.)．然而，分别在5％，10％和15％径向菌株组中显着增加了胶原蛋白产量39.3％，28.1％和4.0％（图8.)．

在0.5 Hz时，10%拉伸组的增殖下降了6.0% (）胶原蛋白产量17.0％（)．在5％的弹力组中，胶原蛋白产量增加37.2％（)，但细胞增殖与非拉伸组无明显差异。15%拉伸组细胞增殖和胶原蛋白生成无明显变化(图)7.和8.)．

ACL成纤维细胞的循环拉伸在1 Hz的幅度为5％和10％显示细胞增殖增加7.1％和6.1％（),分别。然而，在15%拉伸时，细胞增殖下降了7.0% ()．5%、10%和15%拉伸组胶原蛋白的生成没有明显变化(图)7.和8.)．

3．4．径向拉伸MSCs

与未拉伸组相比，5%、10%和15%径向应变组MSCs增殖分别显著增加了6%、8%和9%，0.1 Hz, 8小时/天，持续5天()．各拉伸组的胶原生成量均显著高于对照组(图)9.和10.)．

在0.5Hz时，分别在5％，10％和15％菌株组中显着降低7.0％，6％和9％（)．胶原蛋白的产生也相应减少了15.0%、16.9%和14.0% ()(数据9.和10.)．

在1.0 Hz时，5%拉伸组和10%拉伸组的细胞增殖和胶原蛋白生成没有显著差异。然而，在拉伸15%时，细胞增殖下降了6.0%，胶原蛋白的产生下降了6.9% ()(数据9.和10.)．

4.讨论

韧带是一种由结缔组织组成的坚固而致密的结构。它通过关节连接骨头和骨头，以保持动态和稳定的运动。前交叉韧带是连接膝关节骨最重要的四韧带之一。前交叉韧带的功能是提供膝关节的稳定性，并减少膝关节的压力。然而，由于韧带的细胞数量和血管数量较低，其自我再生能力较差。因此，为了更好地理解前交叉韧带的力学生物学和病理生理学，确定机械载荷对前交叉韧带成纤维细胞的影响是重要的。此外，近年来，组织工程韧带作为一种替代移植在临床前研究中得到了广泛的研究。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是最有前途和最适合用于韧带组织工程的干细胞类型之一。ACL微环境中不仅含有生化因子，还会施加剪切应力、循环应变等血流动力学力，这些力可能会影响MSCs的分化[18.］．虽然许多研究调查了循环机械刺激对移植物掺入和细胞分化的影响，但很少的文献表征了最佳参数。在目前的研究中，使用能够控制拉伸的幅度和频率的体外系统（Flexcell），比较成纤维细胞和MSCs的增殖和胶原蛋白的产生，以探讨最佳的应变状态。

在生理水平下适当的机械载荷会对ECM的表达产生积极影响，因此是肌腱再生的机制。然而，虽然过度机械载荷导致肌腱的异常变化，但也诱导肌腱干细胞进入非环细胞的分化，这可能导致在临床环境中经常出现的退行性肌腱病变的发展[19.］．目前研究中使用的机械菌株的范围从5％〜15％的伸长率，这在人肌腱经历的生理范围内，鉴于肌腱可以伸长12-15％[20.］．当成纤维细胞被单轴拉伸时，增殖和胶原生成的最佳频率为0.5 Hz(图)3.和4.)．当它们以不同的菌株（5％，10％和15％）拉伸时，ACL成纤维细胞显示出增殖或胶原蛋白产生的增加。

0.5 Hz时15%的单轴应变和1 Hz时10%的单轴应变都能刺激成纤维细胞的增殖和胶原蛋白的产生。结果表明，随着拉伸频率的增加，较低的拉伸幅度更有利于细胞增殖和胶原蛋白的生成。I型胶原、III型胶原、脱蛋白和腱蛋白c是肌腱外基质中的基本蛋白[21.］．Lohberger等人[22.]使用具有10％伸长率和0.5Hz的频率的柔性胶带张力系统刺激人转子箍细胞成纤维细胞。在细胞培养上清液中测量总可溶性胶原蛋白。循环菌株在第7天和第14天显着增加了胶原蛋白的产生。在两个时间点的机械刺激的基团中，Tenascin-C和Scleraxis的表达显着增加。结果与我们当前研究中的研究结果相关。0.1Hz的单轴应变是成纤维细胞增殖和胶原蛋白的最不利的。当它们在不同菌株（5％，10％和15％）以0.1Hz以0.1Hz拉伸时，细胞显示出降低的增殖和胶原蛋白产生（表1)．

与单轴应变相比，0.5 Hz对细胞增殖最不利。径向菌株(5%和15%)在0.5 Hz时对细胞增殖无显著影响。10%径向应变对细胞增殖有抑制作用。在1 Hz和0.1 Hz时，5%和10%的菌株和15%的菌株均能促进细胞增殖。有趣的是，与未拉伸组相比，这些条件下胶原蛋白的产生没有显著差异。尽管0.1 Hz和0.5 Hz的5%和10%的菌株对细胞增殖没有影响，但在这些条件下的细胞显示出明显的胶原生成增加(表1)．

对于单轴拉伸条件下的MSCs，0.5Hz有利于细胞增殖和胶原蛋白产生。不同的菌株（5％，10％和15％）所有表现出阳性作用。此外，10％菌株为1.0Hz也上调细胞增殖和胶原合成。有趣的是，对于径向拉伸基团，MSCs在不同菌株（5％，10％和15％）以0.1Hz拉伸时，MSCs的增殖和胶原蛋白产生的增加（表2)．

总之，单轴拉伸（15％在0.5Hz; 1.0Hz时10％）对成纤维细胞显示出积极影响。单轴菌株（5％，10％和15％）在0.5Hz和10％菌株下为1.0Hz显示对MSC的正效应。径向应变对成纤维细胞无显著影响。相反，在0.1Hz的所有径向菌株（5％，10％和15％）对MSC具有阳性作用。

5.结论

本研究表明，将成纤维细胞和间充质干细胞暴露于单轴或径向菌株下，可促进细胞增殖和胶原蛋白的生成。成纤维细胞和间充质干细胞有各自合适的机械刺激参数。这些特定的参数在细胞扩张制备组织工程产品中有很大的亲代应用。

利益争夺

作者声明本论文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

孙立国、曲灵、朱睿等三位作者均为该著作的共同第一作者。

资金

国家自然科学基金资助项目(no . 31170936, no . 31470936)。关键词:岩石力学，数值模拟，数值模拟

致谢

作者非常感谢中国国家自然科学基金（第31170936和31470936）的资金支持。

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