影响FTY720 (Fingolimod)增殖,分化和脑源性神经干细胞的迁移

文摘

不足的增殖、分化和迁移的主要缺陷是神经干细胞(nsc)修复中枢神经系统(CNS)疾病的疗法。有效的脂质中介sphingosine-1-phosphate (S1P)广泛在中枢神经系统调节细胞的生物学行为。然而,激活S1P在nsc的影响尚不明朗。在最近的研究中,FTY720 (Fingolimod)、S1P的模拟,采用诱导增殖,分化,并培养脑源性nsc迁移。结果表明,扩散和迁移能力由FTY720 nsc的提升。虽然我们没有明显的观察到神经元喜欢nsc的分化,有更多原浆星形胶质细胞在特定浓度的FTY720的存在。这项工作给FTY720如何影响nsc更全面的理解。

1。介绍

增殖、分化和迁移特性,神经干细胞(nsc)提供一个有前途的未来修复受伤或中枢神经系统的退化疾病1]。然而,nsc的局限性如扩散不足,没有区分对所需的细胞类型,不能有效地迁移使它还有很长的路利用他们在临床实践中2]。指出生物安全委员会的行为是由不同的内在特征和外在控制信号(3- - - - - -5]。其中,脂质介质会低估候选人在调节nsc增殖、迁移和分化。

有效的脂质中介sphingosine-1-phosphate (S1P)作为一种能传感细胞内信号发挥了至关重要的作用在中枢神经系统细胞的生物学行为通过激活sphingosine-1-phosphate受体(S1PRs) [6- - - - - -8]。S1PRs参与抗炎小胶质细胞和星形胶质细胞扩散的过程,但他们的角色在nsc很少被报道9,10]。证据表明,S1PRs S1PRs nsc表达和活化,尤其是S1P1,将调节nsc的迁移和血管生成11,12]。与蓬勃发展的一些研究干细胞移植或内源性nsc在中枢神经系统疾病,它是等待来演示S1PRs / S1P的作用在调节nsc的细节。

在目前的研究中,我们使用一个结构模拟S1P: FTY720,这被称为多发性硬化症的口服药物,干预主要培养nsc [13]。我们发现nsc的迁移和扩散被FTY720积极影响。尽管没有显著差异的神经元偏好差异被发现,有更多原浆星形胶质细胞发达在一定浓度的FTY720面前。这项研究让更多的理解FTY720 nsc的生物学行为。

2。材料和方法

2.1。神经干细胞的文化

所有实验动物保健和实验委员会批准重庆医科大学。nsc收集从胚胎13.5天(E13.5) Sprague-Dawley老鼠像前面描述的那样14,15]。短暂,端脑快速切割和机械分离成单细胞悬液管中含0.25%胰蛋白酶。单细胞悬液然后转移到生长介质组成的NB B27(美国Gibco) + 2%(美国Gibico)补充20 ng / mL重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF;英杰公司、美国)和20 ng / mL表皮生长因子(EGF);英杰公司、美国)。这也称为介质的基本条件。然后,细胞培养在37°C下湿润的气氛中含有5%的股份有限公司₂。一半的媒介是每隔一天更换一次。二级或三级neurospheres被用于后续的实验。

Brd-U合并,nsc孵化在生长介质包含10毫米Brd-U(美国σ)18个小时之前采用免疫分析。

2.2。FTY720干预

检查的影响FTY720(美国FTY720-P:磷酸FTY720:开曼群岛)(16),nsc被分成四组根据fty - 720的浓度(0 nM, 1纳米,10 nM, 100海里,稀释在DMSO)在基本培养基(分化)或没有(CCK-8测试和球面数字计数)10%胎牛血清(美国热HyClone)。0纳米FTY720被公认为对照组。分化细胞被固定和免疫化学染色与特定的标记神经元,星形胶质细胞和少突胶质细胞。

2.3。CCK-8化验

细胞计数kit-8 (CCK-8;Dojindo、日本)处理指令后,100年和通道细胞μL被镀到96 -细胞板1×10的浓度⁵100年细胞/毫升,然后培养μL基本培养基。24小时后,FTY720-P不同浓度(0 nM, 1纳米,10 nM, 100海里)单独添加。10μL CCK-8解决方案增加了48小时后,然后测量吸光度在450海里。扩散率的褶皱变化是基于吸光度计算结果,在对照组规范化为1。至于扩散神经干细胞球计数,加入一定量FTY720-P介质和干球的数量计算48小时后。

2.4。国家安全委员会和分化的神经细胞的识别

30分钟后在4%多聚甲醛固定细胞被洗了三次0.01 PBS和孵化triton - 100的0.5%。1% BSA使用前一夜孵化与主抗体。Anti-Brd-U(σ1:800年,美国),anti-Ki67(1: 200年,细胞信号),和anti-Nestin(微孔1:400年,美国)被用作干细胞标记。反β微管蛋白3(σ1:800年,美国),anti-GFAP(σ1:160年,美国),anti-A2B5 (Abcam 1: 200年,美国),anti-Olig2 (Abcam 1: 500年,美国),和anti-CC1(生命科学研究1:200年,美国)被用作特定细胞类型制造商。Anti-S1P1(1: 100年,研发系统、美国)或anti-S1P2(罗福斯生物制品1:200年,美国)被用来确定在nsc S1P受体的表达。FITC-conjugated山羊二级抗体(1:100年,中山,中国)和TRITC-conjugated山羊二级抗体(中山1:100年,中国)被用于标签的不同来源分别主要抗体。随后,样本与DAPI染色细胞核染色前共焦激光扫描显微镜(徕卡,SP2,德国)。

2.5。Transwell (Boyden室)细胞迁移试验

在600年的总量μL基本培养基含有FTY720-P添加在24-cell板涂有poly-L-lysine(美国σ),100年μL neurospheres细胞内镀Boyden室1×10的密度⁶细胞/毫升(17]。18小时后,钱伯斯被带走,和每个众议院中的细胞数量与结晶紫染色分析。

2.6。免疫印迹分析

分化细胞或nsc细胞溶解(美国热费希尔阻燃剂)和离心机在14,0006 g×20分钟。上层清液的蛋白质浓度测定用BCA蛋白质分析工具包(Beyotime生物技术,中国)。等量的蛋白质样品加载SDS-polyacrylamide凝胶和转移到PVDF膜(美国微孔)。这些墨迹被封锁,随后探讨了anti-GFAP(σ1:400年,美国),反β微管蛋白3(σ1:1500年,美国),anti-F-actin (Wanlei生物技术,中国),和anti-Olig2 (1: 2000;一夜之间Abcam)。二次辣根peroxidase-conjugated抗体(1:5000;中山生物技术,使用了中国)最后,墨迹与增强化学发光检测(ECL)检测试剂(美国热费希尔)。β肌动蛋白被认为是内部控制的并行运行。5.2.1 Bio-Rad图像实验室软件版本或图像1.50版本我像之前那样,我们用于光学密度量化(18]。单独的实验三次。

2.7。统计分析

neurospheres的数量清点,共有5系统领域的平均(相同的位置24-well板在每组)10倍的目标,这是独立重复5次。分化细胞的百分比计算β微管蛋白三世,GFAP、CC1或Olig2积极,虽然GFAP阳性星形胶质细胞有两种类型根据其形态、所有除以总数量的分化细胞(DAPI-labeled)随机领域下一个40 x 5点目标为每个小组五个独立的实验。数据被当作平均数±标准差。执行统计分析使用单向方差分析(方差分析)其次是Dunnett多重比较测试。被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。主要培养nsc分化和增殖能力

增殖形成nsc neurospheres悬浮在接下来的日子里,他们巢蛋白(神经干细胞特定标记)积极(数字1(一)和1 (b))。检测的DNA复制Brd-U nsc领域组织化学染色证实这些细胞增殖(图1 (c))。bFGF撤军后EGF和胎牛血清,球体分化成神经元和星形胶质细胞被染色的特异性神经元标记β微管蛋白三世和GFAP astrocyte-specific标志,证实nsc有多种分化潜能(数据1 (g)和1 (h))。此外,neurospheres表达S1P1是双重积极巢蛋白(见补充图1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/9671732)。

3.2。FTY720促进nsc增殖

明显有增加数量的nsc FTY720干预后48小时。更重要的是,一些领域大10和100海里FTY720组相比,控制和1 nM FTY720组(数据吗2(一个)和2 (b);补充图2)。结果进一步证实了CCK-8化验(图2 (c))。nsc高浓度组增殖能力更强,这是1.45——1.52倍增加与对照组相比,。然而,似乎FTY720并不影响神经干细胞的增殖率范围在1纳米的浓度。

3.3。FTY720诱导分化nsc原浆星形胶质细胞

分化细胞开始迁移从球体2 ~ 3天后和发达的形态特征与球形神经元细胞体和neurite-like过程或神经胶质细胞,包括更大的原浆和苗条的少突胶质细胞纤维性星形胶质细胞轮廓或短流程。

神经元和星形胶质细胞的分化是证实了采用免疫染色与特定的标记β微管蛋白三世和GFAP(图3(一个))。量化分析显示神经元不喜欢nsc的分化,因为没有明显差异组间的神经元的数量,%,%,%,%分开,(数据3(一个)和3 (b))。免疫印迹分析显示类似的结果(数据3 (d)和3 (e))。

然而,原浆星形胶质细胞明显不同组间的比例。大细胞原生质的星形胶质细胞(也称为1型星形胶质细胞)经常被观察到高剂量(10和100 nM) FTY720组%,%,分别显著增加和控制和1 nM FTY720集团%,%分开,(数据3(一个)和3 (c))。与此同时,规模较小的纤维性星形胶质细胞(也称为2型星形胶质细胞)更有可能在控制和1 nM FTY720集团(数据未显示)。确定总数还是只有原浆星形胶质细胞的相对频率增加,接下来我们用免疫印迹检测GFAP的蛋白质水平。没有差异的相对GFAP蛋白水平组间被发现,(数据3 (f)和3 (g))。

探讨少突细胞谱系分化,我们染色细胞Olig2 CC1,两人都是少突细胞制造商。有增加的趋势olig2积极的少突胶质细胞的比例更高FTY720组,但没有显著差异,(数据4(一)和4 (b))。然而,更多的形态成熟少突胶质细胞被认为在更高的浓度组,和CC1 / Olig2双阳性细胞的比例更FTY组(图4 (c))。

3.4。FTY720促进nsc迁移

评估的影响FY720 nsc迁移,Boyden室和结晶紫染色法被用于实验。结果显示浓度的方式提升nsc迁移后18小时FTY720干预。随着FTY720浓度的增加,细胞迁移到较低的膜室生长(图5(一个))。迁移细胞的数量明显高于被发现在10和100 nM FTY720组(和相比与控制(职责)。,)。1纳米FTY720集团稍高,但没有显著增加迁移细胞的数量(,与对照组相比(图)5 (b))。

以前的研究报道,丝状肌动蛋白(f -肌动蛋白)聚合需要ligand-induced细胞趋化作用[19]。然后,我们研究了f -肌动蛋白的蛋白质表达水平在国家安全委员会。与Boyden室测定的结果一致,f -肌动蛋白在nsc显然调节刺激10 nM和100海里FTY720,与对照组相比,(数字5 (c)和5 (d))。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们测试了多能性和脑源性nsc S1P1的表达。此外,这些细胞保持增殖能力我们之前做的18,20.]。我们的数据表明,FTY720可促进增殖、原浆星形胶质细胞的分化和迁移nsc的剂量依赖性的方式,因为大多数的这些影响被显示在较高的浓度组。此外,我们发现有更多成熟少突胶质细胞在FTY干预组。

原田和他的同事研究了S1P的影响在神经祖细胞和报道S1P诱导增殖的神经祖细胞通过S1P受体(S1P1/3)激活和磷酸化细胞外signal-regulated激酶(ERK) Brd-U合并分析(21]。这个观点被另一项研究支持关于胚胎神经干细胞。然而,其他研究淋巴细胞和星形胶质细胞表明S1P-analog FTY720扮演双重角色在激活或抑制S1P1 [9,22]。因此,FTY720的作用与内生S1P nsc可能不是相同的。

研究表明,FTY720增加辐照nsc的可行性和神经性潜在的海马23,24]。例如,Stessin等人报道更多的神经元(NeuN积极)分化的10 nM FTY720辐照大脑,抵消辐射诱导的抑制nsc神经性的潜力。然而,我们在培养nsc未能观察到类似的结果,没有发现组间的显著差异β微管蛋白阳性细胞。我们的结论是由一个研究viral-induced脱髓鞘小鼠模型(16]。也没有在胚胎海马神经元分化nsc最近也报道(25]。

令人惊讶的是,2型星形胶质细胞的数量,也被称为原浆星形胶质细胞,在FTY720浓度高得多,而GFAP蛋白的总量水平没有影响。类似的结果显示最近三个主要的细胞类型分化没有影响FTY使用免疫印迹(25]。因此,我们推测,FTY720可以保持一个相对nsc的“稳定的分化模式”。尽管coculture原浆与nsc促进星形胶质细胞分化的神经元(15),S1PRs原浆星形胶质细胞可能被FTY720[消极监管9),导致对神经元分化抑制的影响,这可能是另一种解释为什么我们没有观察到神经元的偏好。然而,正如我们知道原浆星形胶质细胞主要分布在灰质和参与血脑屏障的形成,他们被认为是中枢神经系统修复中获益。因此,这将是FTY720的神经保护作用的可能机制之一在中枢神经系统疾病26,27]。证据FTY是否有能力推动少突胶质细胞的发展仍存在争议(28,29日]。在这里,我们没有发现更少突细胞谱系细胞的诱导FTY nsc治疗。然而,更多的形态成熟少突胶质细胞被认为在高剂量FTY720组。组织之间的不同的结果可能是因为人使用不同的起源nsc或疾病模型(1,16,29日- - - - - -31日]。

迁移能力的前提之一nsc修复中枢神经系统损伤。在这项研究中,FTY720激发化学引诱物活动的nsc参议院在Transwell试验较低。迁移活动似乎加强FTY720浓度增加。这进一步验证了蛋白质水平的丝状肌动蛋白(f -肌动蛋白)。nsc移植研究也发现了类似的结果,因为抑制S1P1/3废除S1P的化学引诱物活动/ S1P受体(17,32]。尽管激活S1P2会减少迁移根据木村的研究,报告提到FTY720可以把这种受体(21,32]。有多个目标下游FTY720 / S1PRs,目前尚不清楚,信号通路构成机制。最近,Kassmer等人报道,生殖系祖细胞的迁移反应取决于激活PI3K和下游Rac1 S1P1 [33]。这G-protein-coupled受体调节细胞反应有吸引力的趋化因子在各种细胞类型,包括国家安全委员会。

进一步研究的一些不足之处需要改进。一方面,分子途径的nsc生物行为的存在FTY720没有测试。另一方面,在活的有机体内实验需要介绍目前的研究。虽然不确定与nsc FTY720的神经保护作用是否有相关性,我们相信这种药物的应用将不仅局限于女士也是中枢神经系统损伤和其他退化性疾病。

相互竞争的利益

没有利益冲突声明。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(没有。重庆81171859),国家自然科学基金(CSTC,没有。2012 jja10058),重庆市教育委员会科学技术研究项目(批准号KJ1500237)。作者欣然承认金融支持中国奖学金委员会。资助者作用,研究设计,数据收集和分析,决定发表,和准备的手稿。

补充材料

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